مقالة منهجية

البكتيريا الببتيد العرض لاختيار الانزيمات بيوتينيلاتينج رواية

DOI:

10.3791/60266

⸱

أكتوبر 3, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم طريقه لتحديد المتغيرات الجديدة من e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا التي بيوتينيلات الببتيد الهدف محدده. يصف البروتوكول بناء البلازميد للعرض البكتيرية من الببتيد الهدف ، وتوليد مكتبه البيرا ، واختيار وتوصيف المتغيرات البيرا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيوتين هو تعديل جذاب بعد الانتقالية للبروتينات التي توفر علامة قويه للعزل والكشف عن البروتين. الانزيميه الحيوية من قبل e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هي محدده للغاية ويسمح للبيئة البروتينات المستهدفة في بيئتهم الاصليه. ومع ذلك ، فان الاستخدام الحالي للحيوية بوساطة البيرا يتطلب وجود الببتيد متقبل الاصطناعية (AP) في البروتين المستهدف. لذلك ، يقتصر تطبيقه علي البروتينات التي تم هندستها لاحتواء AP. والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام العرض البكتيري من الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف غير المعدلة لتحديد المتغيرات البيرا التي بيوتينيلات الببتيد. ويستند هذا النظام علي البلازميد واحد الذي يسمح للتعبير المشترك من المتغيرات البيرا إلى جانب سقالة للعرض الببتيد علي سطح البكتيريا. ويصف البروتوكول اجراء مفصلا لادراج الببتيد الهدف في سقالة العرض ، وإنشاء مكتبه البيرا ، واختيار المتغيرات الفعلية البيرا والتوصيف الاولي للمتغيرات البيرا المعزولة. ويوفر الأسلوب نظام اختيار فعاله للغاية لعزل المتغيرات البيرا الرواية التي يمكن استخدامها للتطور الموجهة المزيد من البروتينات البيوتين البروتينية التي تعكر البروتين الأصلي في الحلول المعقدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيوينيليشن من البروتين يخلق علامة قويه لعزله تقارب والكشف عنها. الانزيميه البروتين بيوتينييشن هو تعديل ما بعد الانتقالية محدده للغاية محفزه من قبل الاربطه البيوتين البروتين. و e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هو محدده للغاية والحيوية covalylates فقط عدد محدود من البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي في بقايا ليسين محدده1. ويتم حاليا تسخير مزايا البيره الحيوية المحفزة عن طريق دمج البروتين المستهدف مع الاصطناعية الصغيرة 15-الامينيه-حمض البيوتين متقبل (AP) الذي هو فعال بيوتينيلاتيد2 ويسمح لتحديدا عاليا و كفاءه في الجسم الحيوي وفي المختبر الحيوي من خلال التعبير المشترك أو أضافه البيرا3،4،5. علي الرغم من ان في الجسم الخارجي وفي المختبر البيره يحفز البيوتين-بروتين الربط هو استراتيجية جذابة لوضع العلامات ، ويقتصر تطبيقه علي العينات التي تحتوي علي البروتينات AP-تنصهر. والغرض من هذا الأسلوب هو تطوير المسوخ الجديدة من البروتينات البيوتين البروتيني التي بشكل انتقائي البروتينات غير المعدلة الاصليه ، التالي توسيع عدد التطبيقات التي يمكن استخدامها في استراتيجية الانزيميه الحيوية.

يمكن ان تتطور وظيفة البروتين من خلال جولات تكراريه من طفرة الجينات ، واختيار ، وتضخيم المتغيرات الجينات مع الوظيفة المطلوبة. استراتيجية اختيار قويه وفعاله أمر حاسم بالنسبة للتطور الموجهة ويتم اختيار النشاط البيوتين البروتين يغاز بسهوله بسبب الربط القوي بين البيوتين والسسترافالدين و homologs6. تكنولوجيات العرض phage تسمح لاختيار phage التي تعرض الببتيدات بيوتينيلاتيد7,8. وبما ان تضخيم الزوائد المعزولة يتطلب عدوي من المضيف البكتيري ، الا ان الاختيار الفاجي مع العقديات يخلق اختناقا في ان الربط العالي التقارب من البيوتين إلى العقديات لا رجعه فيه تقريبا في ظل عدم الفصل الظروف. لضمان ربط عكسها من phages الحيوية ، واستخدمت avidins موحودي مع تقارب اقل مما ادي إلى الإثراء ~ 10 اضعاف متواضعة7. طورنا مؤخرا طريقه عرض بكتيرية لعزل متغيرات البيرا الجديدة التي تلغي الحاجة إلى التملص من مصفوفة التقارب التالي تزيل اختناقا من أنظمه اختيار البيرا السابقة9. في الواقع ، لدينا نظام عرض البكتيرية يسمح لإثراء > 1 ، 000 ، 000 اضعاف من استنساخ النشطة في خطوه اختيار واحده9، التالي توفير نظام اختيار فعال للتطور الموجهة من المتغيرات البيرا الرواية.

لدينا نظام العرض البكتيري يتكون من اثنين من المكونات ، البيرا مع C-المحطة 6xHis العلامة والبروتين سقالة التي تسمح لعرض سطح الببتيد الهدف. استخدمنا البروتين سقالة معززه دائري الغشاء الخارجي البروتين X (eCPX) منذ عرض فعال من الببتيدات يمكن ملاحظتها في كل من N-و C-تيرميني10،11. الانصهار من الهدف الببتيد تسلسل إلى ال [ك-تيرمينوس] من [اكpx] يضمن [بيوينيلايشن] من جراثيم عبر عن نشطه [بيرا] [فرينت]. البكتيريا تسمح للاختيار العقديات فعاله كما الببتيد بيوتينيلاتيد يعرض الآن علي السطح (الشكل 1ا).

والغرض من هذا الأسلوب هو لتحديد المتغيرات الجديدة من البيرا التي بيوتينيلات الببتيد متواليات الموجودة في البروتينات الاصليه. يتم ترميز النظام من قبل الجينات الموجودة علي البلازميد pbad-البيرا-ecpx-AP ، الذي يحتوي علي مروج العربية المحرض السيطرة علي البيرا (arabad) ، ومروج T7 السيطرة ecpx9 (الشكل 1ب). يصف هذا البروتوكول الاجراء المفصل ل 1) دمج الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف في C-الطرفية من eCPX ، 2) إنشاء مكتبه الداخلية من البيرا عن طريق الخطا المعرضة PCR ، 3) مجموعه من البكتيريا الملزمة العقديات من قبل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MAC) ، 4) التحديد الكمي لإثراء البكتيريا ، و 5) التوصيف الاولي لمستنسخات معزولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ادراج التسلسل التسلسلي الترميز الببتيد في pBAD البيرا-eCPX-AP

ملاحظه: لتحديد المتغيرات البيرا التي تعكر البروتين الهدف الأصلي, تبدا من خلال تحديد تسلسل الببتيد الأحماض الامينيه 15 في تسلسل البروتينات الاساسيه التي تحتوي علي واحد علي الأقل ليسين (K) بقايا.

  1. انتقل إلى مجموعه التلاعب بالتسلسل12.
  2. لصق تسلسل الببتيد الأحماض الامينيه 15 المحددة في مربع الإدخال في شكل FASTA واضغط علي إرسال.
  3. حدد وانسخ الترجمة العكسية النيوكليوتيد 45 من تسلسل الببتيد.
  4. تحميل ملف GenBank ل pBAD-البيره-eCPX-AP من http://n2t.net/addgene:121907.
  5. تحميل الملف في محرر البلازميد (علي سبيل المثال ، القردة) و ، في نافذه ميزه ، حدد تسلسل AP المعينة "avitag (TM)".
  6. انقر بزر الماوس الأيمن فوق تسلسل AP المميز في اطار تسلسل الحمض النووي وحدد لصق Rev-Com في القائمة السياقية.
    ملاحظه: تسلسل ترميز eCPX في الاتجاه المعاكس ، التالي ينبغي لصق تسلسل الترميز الببتيد كتكملة عكسية.
  7. انقر بزر الماوس الأيمن فوق التسلسل المميز وحدد ميزه جديده.
  8. أضف اسما وصفيا للتسلسل المدرج واضغط OK.
  9. حدد حفظ باسم في القائمة ملف لحفظ الملف المعدل.
  10. تصميم التمهيدي إلى الامام لتشمل آخر 30 النيوتيودس من المكمل العكسي للتسلسل الترميز الببتيد وأضافه سلسله نوكليوتيد ربط البلازميد (3 '-gcggccgcctgc-5 ') إلى نهايته 5 '.
  11. تصميم التمهيدي العكسي لتشمل أول 30 النيوتيودس من المكمل العكسي للتسلسل الترميز الببتيد وأضافه سلسله نوكليوتيد الملزمة البلازميد (3 '-cttaagtaatgtttaaacgaattcgatc-5 ') إلى نهايته 5 '.
  12. اعداد رد فعل PCR 20 μL في أنبوب PCR رقيقه الجدران عن طريق أضافه الكواشف المدرجة في الجدول 1.
  13. نقل الأنبوب إلى الدورية الحرارية وأداء PCR باستخدام برنامج مع التجريد الاوليه في 98 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ، 30 دورات من [15 ق في 98 درجه مئوية ، 15 ثانيه في 60 درجه مئوية و 3 دقائق في 72 درجه مئوية] ، تمديد النهائي لمده 2 دقيقه في 72 درجه مئوية وعقد في 4 ° c.
  14. تشغيل 5 μL من رد فعل PCR علي 1 ٪ هلام اجنشا لتاكيد التضخيم من المنتجات PCR ~ 6 كيلوبايت.
    ملاحظه: إذا لم يتم ملاحظه المنتج PCR ، تحسين حاله PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  15. أضافه 1 μL من DpnI إلى تفاعل PCR واحتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية
  16. تحويل المختصة e. القولونية مع 2 Μl من dpni هضم رد فعل PCR ولوحه علي المرق المضاد للسرطان (LB)/أمبير لوحات. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  17. تطعيم 5 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من الامبيسلين مع مستعمره واحده. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
    ملاحظه: فمن المستحسن لاختبار ما لا يقل عن 6 مستعمرات.
  18. جعل المخزونات تجميد 850 μL من كل ثقافة بين عشيه وضحيها عن طريق أضافه الجلسرين إلى تركيز نهائي من 15 ٪ إلى الثقافة. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  19. استخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة المتبقية مل 4 من قبل الاعداديه مصغره الحمض النووي مجموعه استخراج.
  20. تاكيد الادراج الصحيح للتسلسل الترميز الببتيد بواسطة تسلسل الحمض النووي باستخدام T7 التمهيدي الطرفي (GCTAGTTATTGCTCGG).

2-إنشاء مكتبه لبيرا

ملاحظه: يتم إنشاء مكتبه البيره الاوليه (الشكل 1c، الخطوة 1) بواسطة PCR المعرضة للخطا. الطرق الأخرى لإنشاء مكتبه الكائن الخاص البيرا من المحتمل ان تعمل أيضا.

  1. توليف مكبرات الصوت متحولة مع البيرا-6xHis إلى الامام (ATGAAGGATAACACCGTGCC) وعكس (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) الإشعال باستخدام 1 نانوغرام من pBAD-البيرا-eCPX مع تسلسل الببتيد الهدف (أعدت وأكد في الخطوة 1.20) كقالب و 35 PCR دورات مع درجه حرارة الصلب من 60 درجه مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تشغيل 5 μL من رد فعل التضخيم علي 1 ٪ هلام اجنشا للتحقق من تضخيم 984 bp PCR المنتج.
  3. تنقيه المنتج PCR من المتبقية 45 μL من رد فعل التضخيم باستخدام مجموعه تنقيه PCR التجارية واستخدام مقياس الطيف الطيفي لكميه العائد الحمض النووي.
    ملاحظه: تنقيه من رد فعل تضخيم واحد 45 μL تنتج عموما ما يكفي من الغلة (> 250 نانوغرام).
  4. اعداد رد فعل عينه في أنبوب PCR رقيقه الجدران عن طريق أضافه الكواشف المدرجة في الجدول 2.
  5. نقل خليط التفاعل إلى الدورية الحرارية وتشغيل PCR مع مكبرات الصوت متحولة أعدت في الخطوة 2.3 باستخدام المعلمات التالية: 1 دقيقه في 95 درجه مئوية و 25 دورات من 50 s في 95 درجه مئوية ، 50 s في 60 درجه مئوية و 12 دقيقه في 68 درجه مئوية. تخزين رد الفعل في 4 درجه مئوية.
  6. أضف 1 μL من انزيم تقييد DpnI مباشره إلى تفاعل التضخيم واخلط برفق.
  7. تدور أسفل خليط التفاعل واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
  8. تحويل T7 اكسبرس lysY/Iq المختصة e. كولاي الخلايا مع 2 μl من رد فعل dpni.
  9. تطعيم 100 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين مع الخلايا المتحولة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
  10. جعل الأسهم الفريزر مع 10 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها في LB مع 15 ٪ الجلسرين وتخزين في-80 درجه مئوية.

3. اختيار البكتيريا التعبير عن الببتيد بيوتينيلاتيد

ملاحظه: ويغطي هذا الجزء من البروتوكول الخطوة 2-5 من الشكل 1جيم. ومن المستحسن جدا ان نهج الاختيار هو الاعداد باستخدام pBAD-البيره-eCPX-AP و pBAD-البيرا-eCPX-AP (K10A) كضوابط ايجابيه وسلبيه.

  1. تطعيم 100 مل من LB تحتوي علي 1 ٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين مع 1 مل من مكتبه البيرا واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
  2. تطعيم 5 مل من LB يحتوي علي 1% الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل امبيسيلين مع 100 μL من الثقافة بين عشيه وضحيها.
  3. احتضان لمده 2 ح و 30 دقيقه حتى تصل الثقافة600 OD من حوالي 0.5.
  4. للحث علي التعبير eCPX والبيرا مع 0.2 ٪ ث/v L-arabinose ، 100 μM ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) و 100 μM البيوتين ويهز الثقافة في 200 rpm ل 1 ح في 37 درجه مئوية.
  5. الطرد المركزي الثقافة لمده 10 دقيقه في 5,000 x g وأزاله supernatant.
  6. أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني والطرد المركزي في 5,000 x g لمده 5 دقائق.
  7. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 400 μl من الجليد الباردة وتخزين الخلايا علي الجليد.
  8. أزاله 10 μL من الخلايا المعاد تعليقها وتخزينها علي الجليد في أنبوب 1.5 mL المسمي "الإدخال".
  9. غسل 20 μL من الخرز المغناطيسي العقديات في 1 مل من الجليد الباردة ووضع الأنبوب في اعلي مقعد الجسيمات المغناطيسية الفاصل قبل أزاله بعناية supernatant.
  10. أعاده تعليق الخرز المغناطيسي العقديات في 20 μL من الجليد الباردة تلفزيوني ونقل إلى 390 μL من الخلايا المعاد تعليقها من الخطوة 3.8.
  11. اخلطه برفق بالأنابيب ثم حضن لمده 30 دقيقه عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
    ملاحظه: لا دوامه لان هذا قد lyse الخلايا. وغالبا ما لوحظ تراكم الخرز مع وفره عاليه من البكتيريا التي تعرض الببتيد بيوتينيلاتيد.
  12. وضع عمود مع المجالات المغنطيسية في فاصل الجسيمات المغناطيسية ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة تلفزيوني.
  13. نقل الخلايا والخرز المغناطيسي العقديات إلى العمود المرفق في الفاصل.
  14. مره واحده في خزان العمود فارغه ، أضافه 500 μL من الجليد الباردة تلفزيوني وتكرار حتى تم غسلها العمود مع حجم إجمالي من 5 مل من الجليد الباردة.
  15. أزاله العمود من الفاصل ووضعه في أنبوب 1.5 mL.
  16. ماصه 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني علي العمود و الوت الخلايا المسمية مغناطيسيا عن طريق تطبيق المكبس الموردة مع العمود.
  17. نقل أنبوب 1.5 mL إلى فاصل اعلي مقاعد البدلاء وغسل الخلية المسمي مغناطيسيا مع 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني.
  18. أعاده التعليق برفق الخلايا المسمية مغناطيسيا في 1 مل من الجليد الباردة التلفزيونية قبل أزاله وتخزين 10 μL من أعاده التعليق في أنبوب 1.5 mL المسمي "الإخراج".
  19. تطعيم 100 مل من LB تحتوي علي 1 ٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين مع الخلايا المسمية مغناطيسيا واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
  20. في اليوم التالي ، استخدم 10 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها لجعل الأسهم الفريزر مع الخلايا في LB مع 15 ٪ الجلسرين وتخزين في-80 درجه مئوية و 1 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها للجولة القادمة من الاختيار ، اي الخطوة 3.2.
    ملاحظه: عموما ، يوصي ب3-5 جولات من الاختيار لإثراء البكتيريا الملزمة العقديات.

4. القياس الكمي للتخصيب

ملاحظه: يتم اجراء القياس الكمي للبكتيريا الحية في عينات "الإدخال" و "الإخراج" بعد كل جولة اختيار عن طريق الطلاء من التخفيفات التسلسلية من العينات والعد اللاحق لوحدات تشكيل مستعمره (CFUs).

  1. أضافه 990 μL الجليد الباردة إلى المدخلات (من الخطوة 3.8) والإخراج (من الخطوة 3.18) عينات وتسميه أنابيب "المدخلات 10-2" و "الناتج 10-2" ، علي التوالي.
  2. جعل المخففات التسلسلية 10 اضعاف من "المدخلات 10-2" و "الإخراج 10-2" عينات في الجليد الباردة بالثلج حتى التخفيف النهائي من 10-10 يتم التوصل في عينه الإدخال و 10-4 في عينه الإخراج.
  3. لوحه 100 μL من العينات من "الإدخال 10-6" ، "الإدخال 10-8" ، "الإدخال 10-10" ، "الإخراج 10-2" ، "الإخراج 10-3" و "الناتج 10-4" علي لوحات LB/أمبير واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  4. عد عدد المستعمرات علي لوحات مع مستعمرات مفصوله بوضوح. اضرب عدد المستعمرات بعامل التخفيف للحصول علي عدد التركيز البكتيري/100 μL.
  5. حساب إجمالي عدد البكتيريا في عينات الإدخال والإخراج عن طريق ضرب تركيز الخلية مع الإدخال (400 μL) وحجم الإخراج (1 مل) ، علي التوالي ، وتقدير الإثراء عن طريق تقسيم المخرجات مع عدد خلايا الإدخال.
    ملاحظه: وينبغي ان يكون الإثراء الكبير مرئيا بعد جولات الاختيار 3-5

5-توصيف خيار البيرا المختار

ملاحظه: ويمكن القيام بهذا التوصيف بعد اختيار الأنواع المختلفة من مكتبه البيرا الاولي ؛ ومع ذلك, المتغيرات البيرا عموما لديها نشاط منخفض نحو الببتيد. ولذلك ، يمكن أيضا اجراء جولة اضافيه من الطفرة والاختيار قبل التوصيف. عاده ، يتم عزل 10 استنساخ من جولة الاختيار النهائي لمزيد من التوصيف.

  1. تطعيم 5 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من الامبيسلين مع المستنسخين المختارين من جولة الاختيار النهائية. الاضافه إلى ذلك ، تطعيم 5 مل LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين مع T7 اكسبرس lysY/Iq e. القولونية تحولت مع Pbad البيرا-ECPX-AP ، والتي سيتم استخدامها كعنصر تحكم إيجابي للطخه الغربية الموصوفة أدناه.
  2. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
  3. جعل المخزونات تجميد 850 μL من كل ثقافة بين عشيه وضحيها عن طريق أضافه الجلسرين إلى تركيز نهائي من 15 ٪ إلى الثقافة. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  4. تطعيم 5 مل من LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل امبيسيلين مع 100 μL من الثقافة بين عشيه وضحيها واحتضان في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة لمده 2 ساعة.
  5. استخراج الحمض النووي البلازميد من ثقافة 4 مل المتبقية من قبل s تجاريا مصغره الاعداديه الحمض النووي مجموعه استخراج. أداء تسلسل الحمض النووي في الاتجاهين الامامي والمعاكس من المتغيرات البيرا مع pBAD (ATGCCATAGكاتكتاتتاتسي) و Ptrتشيس rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) الإشعال.
  6. أضافه 0.2 ٪ w/v L-arabinose و 100 μM IPTG و 100 μM البيوتين إلى الثقافات من الخطوة 5.4 ويهز الثقافة في 200 دوره في الدقيقة ل 1 ح في 37 درجه مئوية للحث علي التعبير عن eCPX والبيرة المتغيرات.
  7. نقل 65 μL من الثقافة إلى 1.5 mL الأنابيب التي تحتوي علي 25 μL من عينه المخزن المؤقت التحميل و 10 μL من وكيل الحد.
  8. احتضان في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  9. تحميل العينة (بما في ذلك السيطرة الايجابيه) علي 12 ٪ SDS-بولياكرياميد هلام مع علامة حجم وأداء الكهربائي هلام في 200 V لمده 45 دقيقه تقريبا حتى يتم فصل العصابات القياسية 20 ، 25 و 37 كده بوضوح.
  10. الإفراج عن هلام من الكاسيت وتجميع ساندويتش لتنقيط من هلام علي غشاء PVDF.
  11. الكهربائية في 35 V لمده 2 ح علي الجليد.
  12. أزاله غشاء PVDF واحتضان في حجب العازلة [الخدمات التلفزيونية العامة ، 0.05 ٪ توين-20 ، 3 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم] لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الاهتزاز.
  13. اعداد محلول البيوتين-الكشف عن طريق تمييع العقديات الدين 1:1000 في PBST.
    ملاحظه: يحتوي المخزن المؤقت الحظر علي البيوتين ولذلك يجب عدم استخدامه كمخزن مؤقت لتخفيف العقديات.
  14. تجاهل العازلة حجب ، وغسل الغشاء بسرعة في PBST [التلفزيونية ، 0.05 ٪ توين-20] وأضافه محلول البيوتين الكشف. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الاهتزاز.
  15. تجاهل محلول البيوتين-الكشف وغسل الغشاء جيدا في PBST لمده 5 دقائق مرتين و 10 دقيقه مره واحده مع اهتزاز لطيف في درجه حرارة الغرفة.
  16. تجاهل PBST ، أضافه 2 مل ECL مزيج واحتضان لمده 1 دقيقه مع الاهتزاز.
  17. تجفيف الغشاء بسرعة علي ورقه الانسجه وتطوير الصورة علي فيلم الاشعه السينية أو في نظام التصوير هلام الرقمية.
    ملاحظه: في الممر المحمل بالسيطرة الايجابيه ، يجب ان تكون نطاقات التفاعل بين العقديات المميزة مرئية بوضوح: 30 كيلو من البروتين الذي أعرب عنه اندوجينوسلي و ~ 22 كده eCXP-AP الفرقة. إذا كانت المستعمرات 10 المحددة يمكن ان تعكر الحيوية الببتيد المعروضة ، يجب ان تكون الفرقة في ~ 22 كده مرئية. وكثافة هذه النطاقات اقل عموما من السيطرة الايجابيه ، التالي قد تتطلب فترات تعرض أطول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصمه عار الغربية من pBAD-البيره-eCPX-AP التعبير عن البكتيريا تنتج ~ 22 [كده] العقديات-رد فعل الفرقة متسقة مع الوزن الجزيئي لل eCPX (الشكل 2ا). وعلي عكس البيرا-6xHis, كان eCPX-AP الحيوية موجودة في كل من الثقافات غير المستحثة والمستحثة (الشكل 2ا) بسبب درجه صغيره من نشاط المروج T7 حتى في الثقافات غير المستحثة والتعكر اللاحقة من AP من قبل البيرا الذاتية. في البيرا-eCPX-AP (K10A) التعبير عن الثقافات ، لم يتم الكشف عن الفرقة eCPX الحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اما بالنسبة لجميع طرق الاختيار ، فان صرامة خطوات الغسيل ذات اهميه قصوى. وبما ان البكتيريا لا تحتاج إلى التملص من الخرز قبل تضخيم المستنسخين المختارين ، يمكن استخدام الربط العالي بين البيوتين والسسترافيدين بدلا من استخدام avidins التقارب الأقل ، كما فعلت سابقا مع نظام عرض بالعاثيه ، الانتقاء من [بيرا] [فرينت]7,8. وهذا يضمن ان يتم اختيار استنساخ نادره وان يتم التخلص من البكتيريا غير الحيوية. ميزه أخرى لاستخدام العرض البكتيري ، بالمقارنة مع عرض بالعاثيه ، هو ان العر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفان محمد عبد السيد احمد علي المساعدة الفنية الخبيرة. وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه لوندبيك ، ومؤسسه نوفو نورديسك ، وجمعيه الكلي الدانمركية ، ومؤسسه اياسي اوغ اجنار دانييلسن ، ومؤسسه A.P. مولر للنهوض بالعلوم الطبية ، وكود واياديث اريكسون مؤسسه ميموريال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ جل بولي أكريلاميد مسبقة الصبBio-Rad4561033
AmpicilinSigma-AldrichA1593
ApE - محرر بلازميد v2.0NAتم تنزيله من http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
أرابينوزسيجما-ألدريتشA3256
بيوتينسيجما-ألدريتشB4501
DMSOSigma-AldrichD2650
DPBS (10x) ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFischer Scientific14200083
DpnIإنجلاند BioLabsR0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFischer Scientific65001
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-AldrichPLN350
الطفرات بالمجال GeneMorph II EZCloneAgilent Technologies200552
GlucoseSigma-AldrichG8270
GlycerolSigma-AldrichG5516
Immobilon-P PVDF غشاءMilliporeIPVH15150
IPTGSigma-AldrichI6758
LS أعمدةMiltenyi Biotec130-042-401
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS7653
NEB 5-alpha المختص الإشريكية القولونية< / em>نيو إنجلاند BioLabsC2987
NuPAGE LDS عينة عازلة (4x)ThermoFischer ScientificNP0007
NuPAGE عامل اختزال العينة (10x)ThermoFischer ScientificNP0009
pBAD-BirA-eCPX-APاستخدم Addgene121907نموذجا وتحكم إيجابيا
pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A)Addgene121908التحكم السلبي
Q5 بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيو إنجلاند BioLabsM0491لإدخال تسلسل الببتيد في pBAD-BirA-eCPX-AP ، فإن أي بوليميراز عالي الدقة سيقوم ب
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
حليب خالي الدسم مسحوقسيجما ألدريتش70166
ستربتافيدين-HRPتقنيات أجيلينتP0397
T7 اكسبرس lysY / IQ المختصة الإشريكية القولونية < / em>نيو إنجلاند BioLabsC3013
TryptoneMilliporeT9410
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Western Lightning Plus-ECLمستخلص الخميرة NEL103001EA
Sigma-AldrichY1625
إنزيم تقييد نيو مجموعة PerkinElmer

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  3. de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  4. Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
  5. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  6. Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
  7. Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
  8. Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
  9. Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118(2019).
  10. Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
  11. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
  12. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BirA PCR

مقالات ذات صلة