يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60273

⸱

سبتمبر 16, 2019

 ,  , 
1School of Applied Sciences, University of Huddersfield, 2Laboratory of Radiotherapy and Experimental Radiation Oncology, Humbertus Wald Tumorzentrum, University Cancer Center Hamburg, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

تتميز آثار مثبطات الميغراستاتيك على هجرة الخلايا السرطانية في اختبار الغزو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) باستخدام مثبطات الأسيتيليلاز الهيستون (HDAC) بالفحص المجهري البؤري عالي الدقة.

الملخص

ويتزايد الاستناد إلى اكتشاف المخدرات وتطويرها في بحوث السرطان على شاشات المخدرات في شكل ثلاثي الأبعاد. ويجري اكتشاف مثبطات جديدة تستهدف إمكانات الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية، وبالتالي الانتشار النقيلي للمرض، وتعتبر علاجات تكميلية في أنواع السرطان الشديدة التوغل مثل الأورام الدبقية. وبالتالي، فإن توليد البيانات التي تمكن من إجراء تحليلات مفصلة للخلايا في بيئة ثلاثية الجوانب بعد إضافة دواء مطلوب. المنهجية الموصوفة هنا، التي تجمع بين اختبار غزو البشيرويد والتقاط الصور عالية الدقة وتحليل البيانات عن طريق الفحص المجهري المسح الضوئي بالليزر (CLSM)، مكنت من توصيف مفصل لآثار مثبطات مكافحة الهجرة المحتملة MI-192 على خلايا الورم الدبقي. تم إنشاء Spheroids من خطوط الخلايا لتجارب الغزو في لوحات 96 جيدا الالتزام منخفضة ومن ثم أعدت لتحليل CLSM. وقد تم تفضيل سير العمل الموصوف على تقنيات أخرى شائعة الاستخدام لتوليد السفيرويد بسبب سهولة واستنساخ. هذا، جنبا إلى جنب مع دقة الصورة المحسنة التي تم تحقيقها عن طريق الفحص المجهري البؤري مقارنة مع النهج التقليدية واسعة المجال، سمح بتحديد وتحليل التغيرات المورفولوجية المتميزة في الخلايا المهاجرة في بيئة ثلاثية الأبعاد بعد العلاج مع المخدرات mi-192 mi.

المقدمة

ويتزايد تفضيل التكنولوجيات الثلاثية الأبعاد لاكتشاف المخدرات قبل السريرية وتطوير أدوية السرطان المحتملة على شاشات الأدوية التقليدية؛ وبالتالي، هناك المزيد من التنمية من migrastatic - الهجرة ومنع الغزو - المخدرات. الأساس المنطقي وراء هذه التطورات في علاج السرطان واضحة: 3D sheroid الاختبارات تمثل نهجا أكثر واقعية لفحص الأدوية المضادة للسرطان المحتملة لأنها تحاكي الهندسة المعمارية الورم 3D أكثر إخلاصا من الثقافات الخلية أحادية الطبقة، تلخيص التفاعلات بين المخدرات والورم (الحركية) بشكل أكثر دقة، والسماح بتوصيف نشاط الدواء في بيئة ذات صلة الورم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع مقاومة الأدوية السامة للسموم الكيميائية في العديد من أنواع السرطان وارتفاع معدلات الوفيات بين مرضى السرطان بسبب الانبثاث القوى من خلال قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة إلى مواقع الورم البعيدة يدعم إدراج عوامل العلاج الكيميائي استهداف إمكانات الهجرة من الخلايا السرطانية كعلاج مساعد في تجارب السرطان السريرية في المستقبل1. وهذا هو الحال بشكل خاص في السرطانات الغازية للغاية، مثل الأورام الدبقية عالية الجودة (GBM). تشمل إدارة GBM الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك، حتى مع الجمع بين العلاج، فإن معظم المرضى الانتكاس في غضون 1 سنة من التشخيص الأولي مع البقاء على قيد الحياة متوسط من 11-15 شهرا2،3. وقد أحرز تقدم كبير في مجال التكنولوجيا 3D على مدى السنوات القليلة الماضية: نظم دوارة، وهياكل مجهقلة والسقالات 3D، ويجري تحسين الاختبارات الفردية الأخرى باستمرار للسماح بإجراء اختبارات روتينية على نطاق واسع4، 5و6و7. ومع ذلك، يجب تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الاختبارات بطريقة مجدية لأن تفسير البيانات غالباً ما يعوقه محاولات تحليل البيانات التي تم إنشاؤها ثلاثية الأبعاد مع أنظمة تحليل الصور ثلاثية الأبعاد.

وعلى الرغم من أن معظم النظم الواسعة النطاق لا تزال محدودة بموجب القرار8،على الرغم من أنها أفضل من حيث سرعة الحصول على الصور وانخفاض سمية الصورة. وهكذا، وبصرف النظر عن البيانات قراءة الخروج المتعلقة بفعالية المخدرات، والآثار التفصيلية للعمل المخدرات على الهياكل الخلوية 3D من الخلايا المهاجرة تضيع حتما إذا تم تصويرها باستخدام نظام واسع المجال. وعلى العكس من ذلك، يلتقط الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر (CLSM) صورًا عالية الجودة ومقطعة بصريًا يمكن إعادة بنائها وتقديمها في مرحلة ما بعد الاكتساب ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج الكمبيوتر. وهكذا، فإن CLSM ينطبق بسهولة على الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد المعقدة التصويرية، مما يتيح التحقيق في آثار مثبطات مضادة للميثاستاتيك على الهياكل ثلاثية الأبعاد والتحليلات المتعمقة لآليات هجرة الخلايا. ومما لا شك فيه أن هذا سيوجه تطوير العقاقير الميجراستاتيكية في المستقبل. هنا، يتم وصف سير العمل مجتمعة من جيل spheroid، والعلاج من المخدرات، بروتوكول تلطيخ، والتوصيف عن طريق الفحص المجهري البؤري عالية الدقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. توليد من Spheroids الخلية

اليوم الأول

  1. إعداد وسط الثقافة القياسية كما هو مطلوب من قبل خط الخلية قيد التحقيق.
  2. تنفيذ جميع الخطوات المرتبطة بزراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنيات المناولة المعقمة.
  3. التجرب وحساب الخلايا السرطانية. استخدام 20 مل من تعليق الخلية لكل لوحة. الحفاظ على تعليق الخلية في أنابيب عالمية معقمة وصفت بوضوح.
  4. إضافة عدد محدد مسبقا من الخلايا إلى كل بئر. كل من العدد الأولي للخلايا وحجم spheroid النهائي المطلوبة يعتمد على معدل انتشار خط الخلية التي يجري التحقيق فيها.
    ملاحظة: لخطوط الخلايا الدبقية الراسخة مثل U251 و KNS429،10،5 × 103 خلايا / مل سوف تنتج spheroid مرئية مجهرية (200 أو 800 م) بعد 4 أيام من الحضانة.
  5. إعادة تعليق الخلايا في أنابيب عالمية عن طريق انعكاس لطيف لتجنب تكتل الخلايا. ماصة 200 درجة مئوية من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 96 جيدا. إذا لم تكن جميع الآبار مطلوبة، فمن المستحسن إضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر فارغة لتجنب التبخر.
  6. حضانة الخلايا في حاضنة طبيعية عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خطوط الخلايا مثل خطوط الخلايا السرطانية الورم الدبقي سوف تشكل spheroids في غضون 24 ح. السماح للهندسة الخلوية 3D لتشكيل عن طريق احتضان spheroid لمدة 72 ساعة.

اليوم الثاني

  1. فحص الخلايا عن طريق الفحص المجهري مشرق الميدان بعد 24 ح. اعتمادا على خط الخلية، قد تكون الخلايا قد شكلت spheroid يمكن الكشف عنها في الجزء السفلي من البئر.
    ملاحظة: خطوط الخلايا السرطانية السرطانية الراسخة تشكل بسهولة النفيض في غضون 24 ساعة.

2. الكولاجين غزو ة

اليوم الثالث

  1. ضع الكولاجين، 5X ثقافة المتوسطة، 1 M هيدروكسيد الصوديوم، وأنبوب واحد 20 مل على الجليد.
  2. إضافة بعناية وببطء 10.4 مل من الكولاجين البارد في أنبوب الثقافة المبردة. تجنب فقاعات. هذه الكمية من الكولاجين كافية للوحة واحدة 96 جيدا. الترقية ممكن، ولكن من المستحسن أن يتم إعداد أنبوب واحد 20 مل لكل لوحة في وقت واحد.
  3. إضافة بلطف 1.52 مل من الباردة معقمة 5X وسط الثقافة. تجنب فقاعات.
  4. قبل الاستخدام مباشرة، أضف بلطف 72 ميكرولتر من هيدروكسيد الباردة 1 M هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على الحل على الجليد.
  5. يُمزج بلطف عن طريق الأنابيب. تجنب فقاعات. خلط فعال يؤدي إلى تغيير اللون (من الأحمر إلى البرتقالي والأحمر (درجة الحموضة 7.4) في المتوسط. يُترك المزيج على الثلج حتى يُترك.
  6. خطوة حاسمة: إزالة 190 درجة مئوية من supernatant من لوحة 96 جيدا أعدت في اليوم 1. كن حذرا جدا لا يزعج spheroids التي شكلت في الجزء السفلي من البئر. استخدام ماصة في زاوية نحو الجانب، وليس مركز، من البئر.
  7. إضافة بلطف 100 درجة مئوية من مزيج الكولاجين إلى كل بئر. لمنع أي اضطراب spheroid، ماصة مزيج أسفل الجانب من البئر. تجنب فقاعات. الحفاظ على أي مزيج الكولاجين المتبقية في أنبوب 20 مل في درجة حرارة الغرفة لتقييم البلمرة.
  8. طبق الحضانة في الحاضنة لمدة 10 دقائق على الأقل للسماح للكولاجين للبلمرة. كمبدأ توجيهي، إذا تم تعيين الكولاجين المتبقي، لتصبح شبه صلبة والإسفنج مثل، وspheroids على استعداد لعلاجمع المانع.
  9. إضافة الأدوية أو مثبطات في تركيز 2X إلى وسط الثقافة. إضافة المتوسطة بلطف إلى كل بئر (100 درجة مئوية لكل بئر). مرة أخرى، ماصة المتوسطة أسفل جانب البئر لتجنب اضطراب spheroid.
  10. مراقبة وصورة كل spheroid عن طريق المجهرية حقل مشرق في بعض الأحيان T = 0 ساعة، 24 ح، 48 ح، و 72 ح لتقييم نشاط المخدرات. ثم اعادة اللوحة الى الحاضنة.
    ملاحظة: اعتمادا على السلوك الغازية من خط الخلية، يمكن ملاحظة الهجرة بعيدا عن جوهر spheroid الأصلي من 24 ساعة فصاعدا.

3. إعداد الكولاجين جزءا لا يتجزأ من Spheroids والخلايا المهاجرة للميكروسكوب البؤري

  1. ضع اللوحة في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة وإزالة بلطف supernatant (200 درجة مئوية). مرة أخرى، والحرص على عدم إزعاج spheroid وتجنب لمس الكولاجين، وهذا قد تتداخل مع المكونات الكولاجين.
  2. استبدال supernatant مع 100 درجة مئوية من 1X PBS. كرر هذه الخطوة غسل 3x.
  3. إزالة الغسيل النهائي واستبدال مع 4٪ الفورمالديهايد في 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
    تحذير: الفورمالديهايد هو مسرطن محتمل. التعامل مع الرعاية وفقا للمبادئ التوجيهية للصحة والسلامة.
  4. ضع طبق 96 بئر على مقعد المختبر، وتغطية مع احباط، وترك لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة الفورمالديهايد بعناية واستبدالها 1X PBS. كرر هذا 1X PBS غسل 3X.
  6. إعداد 0.1٪ تريتون X-100 في 1X PBS. قم بإزالة غسل PBS 1x واستبداله بـ 100 ميكرولتر من حل تريتون X-100. الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الأثناء، إعداد حل حجب مع 1X PBS و 0.05٪ مسحوق الحليب منزوع الدسم وتخلط جيدا.
  7. إزالة تريتون X-100 وغسل 3X مع 1X PBS. إضافة 100 درجة مئوية من حل حظر لكل بئر وحضانة لمدة 15 دقيقة.
  8. تمييع الأجسام المضادة الأساسية المطلوبة في حظر المخزن المؤقت عند التركيز المحدد مسبقاً. هنا، استخدم الأجسام المضادة للماوس IgG الأسيتيلاتيتوبين (1:100).
  9. الطرد المركزي الأساسية المضادة حجب الجسم العازلة مزيج لمدة 5 دقائق في 15,682 × ز. قم بإزالة محلول الحظر بعناية وأضف الـ supernatant (25-50 درجة مئوية) إلى كل بئر. الحضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  10. إزالة محلول الأجسام المضادة وغسل 3X مع 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
  11. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت حظر في التركيز الموصى بها أو المحددة مسبقا بالإضافة إلى أي بقع الفلورسنت إضافية. هنا، استخدم 1:500 مضاد للماوس فلوروفور-488 جسم مضاد مترافق، phalloidin-594 (1:500) لتلطيخ الأكتين، ووصمة الحمض النووي (DAPI).
  12. مرة أخرى، الطرد المركزي حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 5 دقائق في 13،000 دورة في الدقيقة.
  13. قم بإزالة محلول الحظر من كل بئر وأضف 25-50 درجة مئوية من مزيج الأجسام المضادة الثانوية/الفيلويدين/DAPI. الحضانة في الظلام لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  14. إزالة الثانوية المضادة للجسم صبغ الحل وغسل 3X مع 1X PBS (100 درجة مئوية لكل بئر).
  15. رفع بعناية المقابس الكولاجين الفردية عن طريق شفط مع ماصة بلاستيكية (200 درجة مئوية) على وسط شريحة زجاجية عاديعالية الجودة.
  16. إضافة قطرة واحدة من جبل مناسبة إلى قابس الكولاجين، وضمان تغطية المكونات تماما. تجنب فقاعات.
  17. تطبيق غطاء من سمك الأمثل لهدف المجهر التي سيتم استخدامها للتصوير والسماح لتعيين بين عشية وضحاها. تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

4. مجهريال الفلورة

  1. التقاط الصور الفلورية باستخدام المجهر البؤري المناسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تعمل تقنية spheroid ثلاثية الأبعاد على تعزيز فهم التفاعلات بين المخدرات والورم لأنها أكثر تمثيلاً للبيئة الخاصة بالسرطان. ويمكن تحقيق جيل من spheroids في عدة طرق. تم استخدام لوحات 96 جيدا منخفضة في هذا البروتوكول. بعد اختبار العديد من المنتجات من مختلف الشركات المصنعة، تم اختيار لوحات المستخدمة هنا لأنها أداء باستمرار أفضل من حيث إنتاج spheroid ناجحة والتوحيد. خطوة استبدال, حيث يتم استبدال وسيط النمو مع مصفوفة الكولاجين, هو نقطة حرجة من البروتوكول; يجب توخي الحذر الشديد لإزالة معظم المتوس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم وصف طريقة جديدة لخلق spheroids الخلايا السرطانية لتحديد نشاط المخدرات migrastatic باستخدام الفحص المجهري البؤري عالية الدقة. وقد سهل استخدام لوحات منخفضة الالتزام على تقنيات أخرى، مثل قطرات شنقا15،وسيلة لتوليد spheroids قابلة للاستنساخ وموحدة لاستخدامها في هجرة الكولاجين وتجارب الغزو. النقاط الحرجة في هذا البروتوكول هي إزالة متوسط النمو من لوحة 96 جيدا قبل دمج spheroid الخلية في مصفوفة الكولاجين والتعامل الدقيق مع المقابس الكولاجين التي تحتوي على spheroids بعد ذلك. وتتوافر الآن تكنولوجيات جديد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر البروفيسور كريس جونز على مساهمته بخط الهاتف KNS42. وZEiss LSM880 المجهر البؤري مع AiryScan المستخدمة في هذا العمل هو جزء من مشروع هادرسفيلد للابتكار والحضانة (HIIP) الممولة من خلال اتفاق النمو شراكة المشاريع منطقة مدينة ليدز (LEP). الائتمان لصورة المجهر الشكل 3: كارل زايس مجهرية GmbH، microscopy@zeiss.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجين الأول ، ذيل الفئران ، 100 مجم354236 كورنينجلمقايسة غزو الورم الدبقي ؛ يتم تقديم هذا من قبل العديد من الموزعين / الشركات المصنعة وسيحتاج إلى تحديده لكل من نوع الفحص المقصود وخطوط الخلايا المستخدمة. بالنسبة لخطوط خلايا سرطان الورم الدبقي ، فإن ذيل الفئران من النوع 1 (مثل كورنينج) هو الخيار المفضل. يجب تخزين الكولاجين عند 4 درجات. C ، في الظلام ، حتى الحاجة. لا ينصح بخلط الكولاجين من دفعات مختلفة لأن هذا قد يؤثر على تناسق الكولاجين المبلمر.    
Coverslipsمختلفةللتصوير المجهري
مسحوق DMEMSigmaD5648المطلوب بتركيز 5x لمحلول الكولاجين لمقايسة غزو الورم الدبقي ؛   يمكن شراء هذا في شكل مسحوق ، يتكون من ماء مقطر مزدوج ، واعتمادا على التركيب النهائي لوسط النمو ، يتم استكماله مع أي إضافات مطلوبة. يجب تصفية محلول 5x الكامل من خلال نظام تصفية الحقنة (0.22 & mu; م) قبل الاستخدام.
مصل ربلة الساق الجنينيةSigmaF7524-500MLاللازمة لزراعة خلايا خطوط خلايا الورم الدبقي
زجاجيةمتنوعةللتصوير المجهري
الجلوكوز DMEMGibcoلزراعة خلايا خطوط خلايا الورم الدبقي
المثبطTocrisمختلفمختلف - وفقا للتصميم التجريبي ؛ يمكن شراء المثبطات من الشركات المصنعة مثل Selleckchem و Tocris. تقدم هذه الشركات المصنعة وصفا مفصلا لخصائص المثبطات ، وروابط إلى المراجع المرتبطة بها واقتراح تركيزات العمل. كما هو الحال مع جميع المثبطات ، قد تكون سامة ويجب التعامل معها وفقا لإرشادات الصحة والسلامة. يتم تحضير المثبطات كمحاليل مخزون على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. على سبيل المثال ، استخدمنا مثبط المهاجر MI-192 لإثبات استخدام هذه المثبطات. لقد اختبرنا مجموعة من مثبطات الهجر بهذه الطريقة مع نتائج مماثلة.
Mountantمختلفةللتصويرالمجهري
هيدروكسيد الصوديوم (1 م) مختلفة يمكن شراء هيدروكسيد الصوديوم المختلفة بمولارية مطلوبة أو تحضيرها من شكل صلب. يجب تعقيم المحلول المحضر بالترشيح باستخدام نظام تصفية الحقنة. واحد M هيدروكسيد الصوديوم مادة للتآكل ويجب توخي الحذر أثناء تحضير المحلول.
بارافورمالدهايد مختلفمختلفلإصلاح الكرات والخلايا ؛ تشكل بنسبة 4٪ ، تحذير من المخاطر الصحية ، والتأكد من الالتزام بلوائح الصحة والسلامة لحل الكولاجين لفحص الغزو
الباستيت (ماصة متدرجة ، 3 مل)مختلفةلفحصالغزو ، وإزالة
المحلول PBS ، ومعقمة لثقافة الأنسجةSigmaD1408-500ML & nbsp ؛  مطلوب لزراعة الخلايا لخطوط خلايا الورم الدبقي وغسلها للتلطيخ
القلم / البكتيريا العقدية (المضادات الحيوية)SigmaP4333اللازمة لزراعة الخلايا لخطوط خلايا الورم الدبقي
الجسم المضاد الأساسي ، الجسم المضاد الثانوي ، DAPI ، Phalloidinمختلف،هناك العديد من الشركات المصنعة لهذه الكواشف ، بالنسبة للأجسام المضادة الثانوية المسماة نوصي باستخدام Alexa Fluor (المجسات الجزيئية). استخدمنا هنا للأجسام المضادة الأولية للجسم المضاد للتوبولين المضاد للأستيلات (1/100 ، Abcam). بالنسبة للأجسام المضادة الثانوية ، استخدمنا 1/500 الجسم المضاد المترافق Alexa Fluor 488 المضاد للفأر ، المجسات الجزيئية. بالنسبة للبقع النووية ، استخدمنا DAPI (العديد من الشركات المصنعة) وصبغة الأكتين Phalloidin (العديد من الشركات المصنعة) كلاهما يستخدم في التخفيف الموصى به 1/500.
بيكربونات الصوديومSigmaS5761اللازمة لحل الكولاجين لمقايسة غزو الورم الدبقي بتركيز 5x
بيروفات الصوديومSigmaP5280اللازمة لمحلول الكولاجين لمقايسة غزو الورم الدبقي بتركيز 5x
التربسينSigmaT4049للتربسين
لوحات التعلق المنخفضة للغايةSigma / NuncCLS7007-24EAلمقايسة غزو الورم الدبقي ؛ مطلوب صفيحة منخفضة الالتصاق ، مع تفضيل ألواح 96 بئرا للسماح بفحص المركبات قيد الفحص على نطاق واسع. هناك العديد من لوحات الالتصاق المنخفضة المتاحة تجاريا. ينصح باختبار مجموعة متنوعة من الألواح لتوليد كروي مثالي. في تجربتنا ، يعمل Costar Ultra Low Cluster مع غطاء ، قاع دائري ، بشكل أفضل لتوليد الكرات من خلايا سرطان الورم الدبقي من حيث تكوين كروي بنسبة 100٪ وقابلية التكاثر. تم استخدام هذه الألواح أيضا بنجاح لتوليد كرويات الورم الدبقي من المواد المشتقة من المريض وخلايا سرطان المثانة والمبيض في مختبرنا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام المجالات العصبية الجذعية أو السلفية في هذه الألواح لتسهيل توليد الخطوط الكروية العصبية
الموحدة (الماصات المصلية ، المعقمة ، 5 مل و 10 مل)مختلفة مثل CostarCLS4488-50 ؛ CLS4487-50لزراعة الأنسجة وتحضير الكولاجين
متعدد القنوات (50 - 250 مو ؛ L) والماصات أحادية القناة (10 & mu; لتر ، 50 مو ؛ لتر ، 200 مو ؛ L 1 مل)مختلفةمختلفةللخلية والسكوية التعامل
مع الفحص المجهري واسع المجالمختلف   ؛مختلفةلمراقبة التوليد الكروي والتصوير الكروي ؛ هنا تم التقاط صور مضان واسعة المجال باستخدام نظام تصوير خلية EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM المجهز بخطة Apochromat 63x 1.4 NA هدف النفطاقتباس Zeissمن الشركة المصنعةتم التقاط الصور متحدة البؤر باستخدام Zeiss LSM 880 CLSM المجهز بهدف زيت Plan Apochromat 63x 1.4 NA. تم استخدام ليزر الصمام الثنائي 405 نانومتر و 458/488/514 نانومتر الأرجون متعدد الخطوط وليزر HeNe 594 نانومتر لإثارة Phalloidin 594 و Alexa Fluor 488 و DAPI على التوالي. تم التقاط قسم بصري تمثيلي واحد لكل صورة ، مع الحفاظ على جميع الإعدادات ، سواء قبل التقاط الصور أو بعدها ، لأغراض مقارنة. تمت معالجة جميع الصور لاحقا باستخدام برنامج تصوير Zen المرتبط و Adobe Photoshop.
شرائح 41965062 يلزم ارتفاع

المراجع

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333(2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253(2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.