الضامة النشاط البالع ضد الخلايا السرطانية, علي وجه التحديد 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا, كانت في هذه الدراسة. تم تاسيس نموذج الاستزراع الخلوي الحي وملاحظته باستخدام مزيج من المجهر الفلوري وتباين التداخل التفاضلي. وكان هذا التقييم باستخدام برامج التصوير لتطوير الفيديو الفاصلة الزمنيه متعددة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الوقت الفاصل بين التصوير 2D من النشاط Phagocytic في M1 الضامة-4T1 الفئران سرطان الثدي خلايا في الثقافات المشتركة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تم تحديد الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كعنصر هام لنمو الورم ، والغزو ، الانبثاث ، والمقاومة لعلاجات السرطان. ومع ذلك ، الضامة المرتبطة بالورم يمكن ان تكون ضاره للورم اعتمادا علي البيئة المجهرية الورم ويمكن ان يغير بشكل عكسي خصائصها الظاهرية عن طريق اما معاداه النشاط السام للخلايا من الخلايا المناعية أو تعزيز الاستجابة المضادة للورم. الإجراءات الجزيئية من الضامة وتفاعلاتها مع الخلايا السرطانية (علي سبيل المثال ، كثرة الكريات) لم تدرس علي نطاق واسع. ولذلك ، فان التفاعل بين الخلايا المناعية (M1/M2-النوع الفرعي تام) والخلايا السرطانية في البيئة المجهرية الورم هو الآن بؤره البحوث العلاج المناعي للسرطان. في الدراسة الحالية ، تم تطوير نموذج الخلية الحية لزراعه الخلايا من الضامة M1 المستحثة والفئران الثديية الماوس 4T1 خليه سرطان لتقييم النشاط الضامة للبلمه باستخدام ميزه الفيديو الفاصل الزمني باستخدام التباين التدريجي ، الفلورسنت ، وتباين التداخل التفاضلي (DIC). يمكن للأسلوب الحالي مراقبه وتوثيق التصوير الخلوي الحي متعدد الخلايا لكثرة الكريات. ويمكن ملاحظه كثرة الخلايا 4T1 من قبل الضامة M1 باستخدام المجهر الفلورسنت قبل تلطيخ الخلايا 4T1 مع استر كاربوكسيفلوريسسين سكاليديديل (CFSE). يصف المنشور الحالي كيفيه زراعه الضامة والخلايا السرطانية في صحن تصوير واحد ، واستقطاب الضامة M1 ، وتسجيل الاحداث متعددة النقاط من الضامة تجتاح خلايا 4T1 خلال 13 ح من الزراعة.
المقدمة
الضامة هي الخط الأول من الدفاع المناعي وتلعب دورا في الاستجابات المناعية تدبير ضد مسببات الامراض والمواد الاجنبيه ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. فهي البويضات المتخصصة التي تدمر ويتخلص من الجزيئات غير المرغوب فيها في الجسم. الضامة تسهم وظائف دفاعيه مثل أزاله الخلايا الميتة والكائنات المجهرية وتجنيد الخلايا المناعية الأخرى1. الضامة يمكن التفريق إلى نوعين مختلفين ، M1 و M2 الضامة ، استجابه للإشارات البيئية2. يتم تنشيط M1-الضامة المستقطبة (اي ، الضامة المنشطة بشكل كلاسيكي) من قبل γ (ifn-γ) و lipopolysاكتشاريدس (lps) وتشارك في الاستجابة التهابيه ، وأزاله الممرض ، وندره المحببات الفعالة ، والمناعة المضادة للجراثيم3،4. الضامة M2 ترتبط ارتباطا وثيقا الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) ولها خصائص المضادة للالتهابات والورم تعزيز4.
الفندره ، المستمدة من اليونانية القديمة (phagocytosis) ، وهذا يعني "للتهام ،" (kytos) ، وهذا يعني "الخلية" ، و-osis ، وهذا يعني "عمليه"5. الفندره هي عمليه بوساطة مستقبلات حيث البالعات (بما في ذلك الضامة ، والخلايا الاحاديه ، والعدلات) قتل وابتلاع مسببات الامراض الغازية ، وتنظيف الجزيئات الاجنبيه ، وواضحة الحطام خليه ابوتوتيك. يتم العثور علي الضامة المرتبطة بالورم (tams) في سدي في الأورام المختلفة ، بما في ذلك سرطان الثدي ، ولها وظائف الموالية للورم6،7، مما ادي إلى مقاومه كثرة الكريات. لم يتم بعد فهم اليه المفصلة لندره الخلايا السرطانية بالضامة.
تقدم هذه الدراسة طريقه من خطوتين: 1) 4t1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة M1 الاستقطاب هي الخياطة ، و 2) يتم تقييم النشاط أكله من الضامة باستخدام المجهر الفيديو الخلية الحية. وقد استخدمت CFSE صبغ الفلورسنت لوصمه عار الخلايا سرطان الثدي 4T1. العلامات وصمه عار الخلايا 4T1 لتمييزها من الضامة M1 الخياطة داخل صحن التصوير واحد. RAW 264.7 الضامة المستقطبة مع LPS و IFN-γ إلى النمط الظاهري M1. لضمان الاستقطاب الكامل ، تم تنفيذ المناعي مع الأجسام المضادة لمكافحه النوس مترافقة مع FITC. وفي وقت لاحق ، تم الحصول علي سلسله متعددة من الصور الفاصلة الزمنيه لمراقبه الاحداث المتعددة ، بما في ذلك ندره المحببات ، داخل الاستزراع.
قد يؤدي الفهم الأفضل للتفاعلات بين الخلايا السرطانية والضامة إلى العلاج المناعي المحتمل للسرطان. تقدم التصوير بالخلايا الحية عرضا مفصلا لديناميكيات الخلايا في الوقت الحقيقي ، وقد استخدمت لدراسة هجره الخلايا ، والفحص الظاهري ، والمبرمج ، والسمية الخلوية8،9 في علم الأعصاب ، والبيولوجيا التنموية ، واكتشاف المخدرات. علي الرغم من ان الورم المقترح في هذه الدراسة هو سرطان الثدي ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة علي الخلايا المستهدفة المتعددة والخلايا المستجيبة المتميزة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظه: الأقسام 1 − 6 وصف نموذج الزراعة الثديية من خلايا الفئران سرطان الثدي 4T1 والضامة 264.7 الماوس الخام. يصف القسم 7 تقييم الفاصل الزمني للخلايا M1 الضامة 4T1 الخلايا.
1. كولتورينج 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة 264.7 الماوس الخام
- ذوبان قارورة من الديتريوم الحفاظ علي 4T1 و RAW 264.7 مرور 6 خلايا عن طريق الانفعالات لطيف في حمام مائي في 37 درجه مئوية أو درجه حرارة النمو الطبيعي لخطوط الخلايا.
ملاحظه: يجب ان يتم الذوبان بسرعة ، تقريبا في غضون 2 دقيقه. لتجنب التلوث ، وأزاله القارورة من حمام المياه وتطهيرها عن طريق الرش مع 70 ٪ الايثانول. لتجنب الانحراف الوراثي ، وخاصه بالنسبة للبلضام ، استخدم رقم مرور منخفض (اي اقل من 20). - تمييع الخلايا المذابة في 10 مل من المتوسطة DMEM كامله في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي الخلايا في 600 x g ل 5 دقيقه للحصول علي خليه بيليه.
ملاحظه: يتم استخدام المتوسطة DMEM كامله مع 10 ٪ (v/v) الجنين البقري المصل (المدفع) ، 200 U/mL البنسلين/ستربتوميسين ، و 2 مم L-الجلوتامين يستخدم في جميع انحاء البروتوكول. - يستنشق بعناية وسائل الاعلام ، وأعاده تعليق الخلايا في 8 مل من متوسطه كامله ونقلها إلى 25 سم2 الانسجه ثقافة معالجه قارورة. الثقافة علي حد سواء 4T1 و RAW 264.7 الخلايا في المتوسط DMEM كامله في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: أعاده التعليق الكريات الخلية برفق وأضافه تعليق الخلية في الثقافة القارورة قطره بواسطة قطره لتجنب قتل الخلايا. - بعد أسبوع واحد من الخياطة للسماح بالتصاق بالخلايا ، راقب القارورة يوميا وأضف 8 مل من المتوسط الكامل لل DMEM حسب الحاجة.
2. المناعية من M1 المستقطبة الخام 264.7 الضامة
- كما كونفلوينسي الخلايا RAW 264.7 تصل إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني.
ملاحظه: قبل بذر RAW 264.7 الخلايا ، تاكد من عدم وجود تمايز الخلية (اي ، النمط الظاهري مثل dendrite و/أو زيادة حجم الخلية). إذا كانت التغييرات المورفولوجية الخلية مرئية ، تجاهل الثقافة وذوبان خط خليه جديده من قارورة المرور السابقة. - اعداد الضامة لجمع عن طريق الانفصال بلطف الخلايا الملتصقة باستخدام مكشطه الخلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية واعداد تعليق خليه من 1 × 105 خلايا/طبق باستخدام المتوسطة dmem كامله.
- بذور 2 مل من تعليق الضامة في اثنين من اطباق التصوير. احتضان الخلايا 2 − 3 ح عند 37 درجه مئوية مع 5% CO2 للسماح بالتصاق بالخلايا.
- اعداد وسائل الاعلام الاستقطاب M1 عن طريق أضافه 100 ng/mL LPS و 20 ng/mL IFN-γ إلى كامل DMEM المتوسطة10,11.
- تجاهل الثقافة ماده طافي من الضامة وغسل بعناية الطبقات الاحاديه في طبق 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- أضافه 2 مل من وسائل الاعلام الاستقطاب M1 في واحده من اطباق التصوير ، والسماح للخلايا 264.7 RAW للحث علي النمط الظاهري M1 الضامة ، واحتضان 2-3 ح في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: بذره RAW 264.7 الضامة في طبق التصوير مع DMEM تستكمل مع 10% سلاح كعنصر تحكم لتلطيخ الأجسام المضادة للنوس. تسميه اطباق التصوير الخام (التحكم) و M1 الضامة (LPS و ifn-γ الاستقطاب) ، علي التوالي. - قبل التحصين ، إصلاح RAW 264.7 و M1 الضامة الخلايا باستخدام 2 مل من بارافورمالدهيد 4 ٪ واحتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية (درجه حرارة الغرفة ، RT).
- أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- إخماد مع 2 مل من كلوريد الأمونيوم 50 مم في التليفزيون واحتضان لمده 15 دقيقه في RT.
- بيركابايز باستخدام 2 مل من 0.3 ٪ تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية لمده 15 دقيقه في RT.
- أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- كتله باستخدام 2 مل من 10 ٪ في الاذاعه التلفزيونية لمده 30 دقيقه في RT.
ملاحظه: الخطوة المانعة في المناعي هو تقليل الربط غير محدده من الأجسام المضادة داخل الخلية. - أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- احتضان مع 2 مل من المضادة للنوس-FITC في الاذاعه التلفزيونية و 1 ٪ من بين ليله وضحيها في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: تسميه الخلايا باستخدام تخفيف الأجسام المضادة المناسبة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. حماية الاطباق من الضوء من خلال تغطيتها مع رقائق ألومنيوم من هذه النقطة علي. - أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- احتضان 1 مل من 300 nM 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) في اطباق التصوير لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية ، في الظلام من خلال تغطيه مع رقائق ألومنيوم.
- غسل الخلايا مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x وأضافه 1 مل من المتوسطة DMEM كامله في اطباق التصوير.
ملاحظه: الخلايا جاهزه الآن للتصوير الفلوري. الاعداد المجهر سوف تحتاج إلى مرحله مقلوبه ومرشحات الاثاره للبقع المختارة (في هذه الحالة ، FITC و DAPI). - قم بتشغيل المجهر وتحميل برنامج التصوير. جبل طبق التصوير علي المجهر وضبط التركيز لمراقبه RAW 264.7 و M1 الضامة. تحسين مظهر الصور FITC و DAPI علي النقيض من المرحلة عن طريق ضبط الضوء المرسل وأوقات التعرض.
ملاحظه: بدء التصوير عندما تكون جميع النقاط في التركيز والقناات الأمثل. - التقاط صور FITC و DAPI علي النقيض من المرحلة (الشكل 1).
3. البذر 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا
- كما كونفلوينسي الخلايا 4T1 تصل إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني. أضف 1 مل من التريبسين المسخن للفصل بين الخلايا واحتضانها لمده تصل إلى 20 دقيقه عند 37 درجه مئوية.
ملاحظه: مراقبه الخلايا تحت المجهر. سيتم تقريب الخلايا المنفصلة. - مره واحده في فصل الخلايا ، نقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأضافه 2 مل من المتوسطة كامله DMEM المسبقة لتنشيط التريبسين. تفريق المتوسطة بلطف عن طريق الأنابيب سطح طبقه الخلية لاستعاده الخلايا. ثم ، جهاز الطرد المركزي في 600 x g لمده 5 دقائق للحصول علي خليه بيليه.
- أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من المتوسطة كامله dmem الحرارة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية والبذور 1 × 105 4t1 الخلايا في 2 مل من المتوسطة dmem كامله في كل من 2 35 mm الزجاج القاع التصوير الاطباق التعامل مع ثقافة الانسجه. احتضان الخلايا بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الثقافة 4T1 الخلايا في واحده من الاطباق التصوير مع وسائل الاعلام الاستقطاب M1 والتسمية 4T1-الحث (السيطرة). هذا هو لضمان النمو الطبيعي للخلايا 4T1 عندما تتعرض للمحرز.
4. وضع العلامات المعيشة 4T1 الماوس الخلايا سرطان الثدي باستخدام CFSE تلطيخ
- أولا ، أزاله الوسائط الموجودة من الخلايا 4T1 التصوير الاطباق. اغسل الخلية أحاديه الطبقة علي الأقل 2x مع 1 مل من تلفزيوني.
- اعداد 5 μM من محلول تلطيخ CFSE عن طريق تمييع CFSE في 1 مل من تلفزيوني. أضافه 1 مل من محلول تلطيخ CFSE 5 μM في كل طبق التصوير واحتضان الخلايا لمده 20 دقيقه في RT أو 37 درجه مئوية ، في الظلام.
ملاحظه: تسميه الخلايا باستخدام تركيز العمل CFSE المناسبة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة والتجارب الاوليه للحصول علي تركيز التلطيخ CFSE الأمثل. ستكون كفاءه الوسم اعلي إذا تم تخفيف CFSE في الاذاعه التلفزيونية. - إخماد تلطيخ عن طريق أضافه حجم متساو من المتوسطة DMEM كامله التي تحتوي علي 10 ٪ الحل وتلطيخ للخلايا واحتضان لمده 5 دقائق في RT في الظلام.
- تجاهل الحل الذي يحتوي علي CFSE واغسل الخلايا 1x بحجم متساو من وسائط الثقافة.
ملاحظه: يتم الآن تسميه الخلايا 4T1 فلوريسسينتلي. - إرجاع الخلايا 4T1-CFSE إلى ظروف الثقافة القياسية في RT مع 5% CO2.
5. بذر RAW 264.7 الماوس الضامة والزراعة مع 4T1
- كما كونفلوينسي من RAW 264.7 الوصول إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني.
- اعداد الضامة لجمع عن طريق الانفصال بلطف الخلايا الملتصقة باستخدام مكشطه الخلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية واعداد تعليق خليه من 1 × 105 خلايا/مل عن طريق تمييع الحل المتبقي مع متوسط dmem كامله وفقا لكثافة البذر.
ملاحظه: الخلايا متموج بشكل مفرط في cocultures قد يقلل بشده كثرة الكريات. في هذه الدراسة ، ونسبه البذر من الضامة: تم تعديل الخلايا السرطانية إلى نسبه 1:1. ويمكن تعديل نسبه اعتمادا علي العدوانية من الخلايا السرطانية واصل الضامة. - قبل coculturing ، وتجاهل الثقافة ماده طافي من الخلايا 4t1 المصنفة في اليوم السابق (الخطوة 4.5) وغسل بعناية أحادي الطبقات 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- البذور 1 × 105 264.7 الخلايا الخام لكل 2 مل من المتوسطة dmem كامله في واحده من اطباق التصوير 4T1. احتضان الخلايا 2 − 3 ح عند 37 درجه مئوية مع 5% CO2 للسماح بالتصاق بالخلايا. تسميه طبق التصوير 4T1-M1 الزراعة.
ملاحظه: كانت الخلايا 4T1 (التحكم) لا الدوس مع الضامة.
6.m1 الاستقطاب من الضامة 264.7 RAW
- اعداد وسائل الاعلام الاستقطاب M1 عن طريق أضافه 100 ng/mL LPS و 20 ng/mL IFN-γ إلى المتوسطة DMEM كامله تستكمل مع 10 ٪ (v/v) المنفذة10،11.
- تجاهل الثقافة ماده طافي من الضامة حضن قبل (الخطوة 5.5) وغسل بعناية الطبقات الاحاديه في طبق 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- ثم ، أضافه 2 مل من وسائل الاعلام الاستقطاب M1 في صحن التصوير والسماح للخلايا 264.7 RAW للحث علي النمط الظاهري M1 الضامة من خلال احتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الخلايا الضامة M1 قد يستغرق 2 − 3 h من الحضانة لتحقيق الاستقطاب الكامل. التجارب الاوليه يجب القيام به لضمان فتره الحضانة مناسبه للسماح الاستقطاب الكامل من الضامة.
7. المجهرية الفيديو الخلية الحية من كثرة الفندره
ملاحظه: هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها عند تنفيذ تصوير الخلايا الحية للحصول علي فيديو قابل للإنتاج ، بما في ذلك تحسين التعرض للصورة ، وقياس الوقت ، وتصحيح التركيز التلقائي.
- قبل التجربة ، اعداد حاضنه ثقافة الخلية عن طريق تشغيل الحرارة في 37 درجه مئوية وتوريد 5 ٪ CO2.
ملاحظه: يتطلب الاعداد المجهر مرحله مقلوبه ، حاضنه اعلي المرحلة ، والتحكم في الرطوبة (95 ٪) ، ونظام حضانة الغاز. هذا الاعداد أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي خلايا لتقييم المجهرية الفيديو الخلية الحية علي المدى الطويل. - بدوره علي المجهر بما في ذلك المرحلة بيزو وتحميل برنامج التصوير المجهر.
- ضع خلايا الزراعة المصنفة في صحن تصوير بالزجاج السفلي 35 مم في وسط المرحلة والمسمار بلطف علي الغرفة العلوية. استخدم عصا التحكم لتحريك المرحلة عن طريق تحديد الموضع الذي سيتم تصويره.
- لعرض العينة ، حدد فلتر تباين المراحل علي البرج. بعد عرض العينة في البداية ، حدد موقع الحقول المناسبة وجعل العينة في التركيز.
ملاحظه: يسمح برنامج التصوير باستخدام الاختيار الموضوعي المؤتمت بالبالكامل ، ونظام التركيز المثالي ، وسلسله الفواصل الزمنيه ، واكتساب الصور متعدد القناات ، واكتساب الصور متعددة النقاط. - لاعداد الفلورية متعددة القناات لوسم CFSE والتباين في التداخل التفاضلي ، افتح مربع الحوار اكتساب برامج التصوير وحدد خانه الاختيار [لأمدا] علامة التبويب (الشكل 2).
ملاحظه: بالنسبة للتصوير بفاصل زمني 13 ساعة ، يجب استخدام قناه تباين المراحل. - حدد علامة التبويب [لأمدا] | [التكوين البصري] وحدد [10x DIC] لتباين التداخل التفاضلي و [gfp-R] لاختيار الفلتر الفلوري الأخضر. تحت [لأمدا] | عمود [التركيز] ، حدد خانه الاختيار [10 × DIC] لتعيينها كمرجع للتركيز.
- افتح مربع الحوار اكتساب برامج التصوير وانقر فوق الزر [XY الوقت...] وحدد علامة التبويب [س ص] .
- انتقل إلى نقطه اكتساب الصور باستخدام عصا التحكم علي المرحلة اليه اثناء التحقق من الصورة الحية أو حدد موضعا مختلفا من خلال العدسات العينية. ثم انقر علي مربع الاختيار تحت العمود [اسم النقطة] لتعيين كل نقطه في كل موقع للتقاط الصور (انظر الشكل 3).
ملاحظه: تسمح المرحلة المؤتمتة بالحصول علي صوره متعددة لإحداثيات XY مختلفه للتقاط عده حقول. - اضبط التركيز لكل عينه معروضه علي الشاشة. استخدم عناصر التحكم الخاصة بتصحيح التركيز التلقائي.
- استخدم البرنامج لاعداد التقاط الصور بفواصل زمنيه. في مربع الحوار اكتساب برامج التصوير ، تحقق من علامة التبويب [الوقت] (انظر الشكل 4).
- تحديد [الفاصل الزمني] (التاخير بين بداية نقطه زمنيه واحده إلى نقطه زمنيه أخرى) و [المدة] (الطول الإجمالي للوقت الخاص بالتجربة). وحدات من الوقت تختلف ويمكن اختيارها بالمللي ثانيه (مللي ثانيه) ، ثوان (ق) ، دقائق (م) ، أو ساعات (ح) من القائمة المنسدلة.
ملاحظه: قد يختلف طول فتره التصوير للتصوير بالفاصل الزمني للمضان واكتساب القناات الفاصلة الزمنيه DIC حسب الصبغة الفلورية المستخدمة في هذا الفحص. قد يحدث الرشح الضوئي إذا تعرضت الخلايا المسمية لفتره طويلة جدا. - تحقق من خانه الاختيار [حفظ إلى ملف] لحفظ الصور المكتسبة. ضمن علامة التبويب [الجدول الزمني] ، انقر علي الزر [تشغيل الآن] للحصول علي صور متعددة السلاسل الزمنيه (انظر الشكل 5).
ملاحظه: في برنامج التصوير ، يتم حفظ الصور بتنسيق ملف nd2. يمكن حفظ كل فاصل زمني بشكل فردي بتنسيق ملف MP4 لاحقا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الوقت الفاصل بين الصور ثنائيه الابعاد (2D) من نموذج الاستزراع الثديي للخطوط الخلية سرطان الثدي 4T1 تظهر الخلايا 4T1 التي اجتاحتها الضامة M1 خلال فتره 13 ح. من المهم لضمان الاستقطاب الكامل من الضامة M1 عن طريق أداء المناعي. النتائج (الشكل 1) تبين ان تركيز 100 Ng/ml lipopolysاكتشاريدس (lps) و 20 Ng/ML ifn-γ المستقطبة RAW 264.7 الضامة في الدولة M1. وسم الخلايا المستهدفة بصبغه فلورية وترك الخلايا المستجيبة غير ملطخه يسمح لنموذج الزراعة الحية الخلية (فيلم 1). في جميع انحاء 13 ساع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتطلب البروتوكول الموصوف خطوتين: 1) زراعه الخلايا السرطانية الثديية الماوس 4T1 والضامة M1-المستقطبة ، و 2) تقييم النشاط الضام البلاجي باستخدام المجهر الزمني الفاصل. ويستخدم علي نطاق واسع في زراعه الخلايا الحية في كثرة الكريات واختبارات الهجرة. نموذج زراعه الخلايا الحية هنا هو بسيط, قابل للتكيف في المختبر الاجراء (الشكل 2) التي تستخدم صبغه فلورية, cfse, الذي يستخدم لتسميه 4T1 الخلايا المستهدفة. ويستخدم ذلك للتتبع السليم لأنواع الخلايا اثناء تصوير الخلايا الحية. تم استخدام التصوير بالخلايا الح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل ماليا من قبل جيران بوترا Berimpak (GBP) ، جامعه بوترا ماليزيا: 9542800. ونود ان نشكر معهد التكنولوجيا الحيوية الزراعية ، ومختبرات ماليزيا (ABI) ، ومرفق التصوير المجهري. شكر خاص لمحمد دانيال حازم للمساعدة في تحرير وتسجيل الفيديو التجريبي لهذا العمل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأجسام المضادة المضادة المضادة ل INOS مترافقة FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 & micro; ز في 1 مل |
| كربوكسي فلوريسين إستر السكسينيميديل (CFSE) | إنفيتروجين | C1157 | 25 مجم |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد) | Invitrogen | D1306 | 10 مجم |
| DMEM / ارتفاع الجلوكوز | HyClone | SH30003.04 | 670.0 جم |
| مصل الأبقار الجنيني | Tico Europe | FBSEU500 | 500 مل |
| عديدات السكاريد الدهنية | Sigma | L4516-1MG | 1 مجم |
| ماوس مؤتلف إنترفيرون جاما | تقنيات الخلايا الجذعية | 78021 | 100 & ز |
| محلول البنسلين والستربتومايسين | Cellgro | 30-003-CI | 100 مل |
| محلول ملحي مخزن من الفوسفات | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 عبوات |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X ، 100 مل |
| 1000 & micro ؛ L أطراف ماصة | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 طرف / علبة |
| 2 مل ماصة مصلية | JET BIOFIL | GSP012002 | غير pryogenic |
| 200 & micro ؛ L نصائح ماصة | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps / علبة |
| 25 سم 2 قارورة ثقافة الخلية | Corning | CLS430639 | زراعة الأنسجة المعالجة |
| جهاز طرد مركزي | Dynamica | FA15C | نموذج: Velocity 14R |
| غطاء دخان السلامة البيولوجية | Nuaire | NU-565-400 | الموديل: الصفحة الرئيسية / LabGard & reg ؛ ES TE NU-565 الفئة الثانية ، النوع B2 السلامة الحيوية الدخان هود |
| CO2 / خلاط الهواء | Chamlide (أداة الخلية الحية) | FC-R-20 | FC-5 (CO2 / خلاط الهواء) مع مقياس التدفق |
| مكشطة الخلية | NEST | 710001 | 220 مم |
| حاضنة خلية | CO2 باناسونيك | N / A | نموذج: MCO-19M (UV) |
| مجهر متحد البؤر | شركة نيكون إنسترومنتس. | غير متوفر / أ | نيكون Ti-Eclipse |
| الزجاج الزجاج الطبق | نفسه | 81218-200 | 35 مم |
| NIS عناصر البرمجيات | نيكون إنسترومنتس. | متاح للتنزيل | |
| وحدة تحكم الماصة | CappAid | PA-100 | CappController وحدة تحكم ماصة ، 0.1-100 مل |
| ترموستات | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 × 48 × 96.5 مم |
المراجع
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
