Method Article

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

DOI:

10.3791/60282

⸱

June 2nd, 2020

 , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Parc Científic de Barcelona, 2The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داخل الكائنات متعددة الخلايا ، والأنسجة الناضجة والأجهزة عرض درجات عالية من النظام في الترتيبات المكانية للخلايا المكونة لها. وهناك مثال رائع من النعت الحسي، حيث يتم جمع خلايا من نفس الهويات أو الهويات المتميزة معا عبر التصاق الخلية الخلية تظهر أنماط بلازار منظمة للغاية. الخلايا محاذاة إلى بعضها البعض في نفس الاتجاه وعرض قطبية مكافئة على مسافات كبيرة. يتم تأسيس هذه المنظمة من النعت ناضجة على مدى مورفوجينيسيس. لفهم كيفية تحقيق الترتيب البُلّي ّ للنعت الناضج ، من الأهمية بمكان تتبع اتجاه الخلية وديناميكيات النمو مع الإخلاص الصدغي العالي أثناء التطور في الجسم الحي. كما أن الأدوات التحليلية القوية ضرورية لتحديد وتوصيف التحولات المحلية إلى العالمية. وpupa Drosophila هو نظام مثالي لتقييم التغييرات شكل الخلية الموجهة الكامنة وراء مورثوجينيسيس الظهارية. تشكل ظهارة الظهارة النامية للظهارة السطح الخارجي للجسم غير المتنقل ، مما يسمح بالتصوير على المدى الطويل للحيوانات السليمة. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة البطنية الجروية أثناء نموها. يمكن تكييف المنهجية الموصوفة بسهولة مع تصوير سلوكيات الخلايا في مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الهياكل تحت الخلية أو الكائنات الحية النموذجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحقيق أدوارها، الأنسجة الظهارية تعتمد بشكل كامل على التنظيم المكاني لمكوناتها الخلوية. في معظم النعوت، لا يتم تعبئة الخلايا ضد بعضها البعض فقط لإنشاء طبقة حصوية دقيقة ولكنها توجه نفسها نسبة إلى محاور الجسم.

الأهمية الوظيفية لتنظيم الأنسجة الدقيقة واضحة في الظهارة الحسية ، مثل الأذن الداخلية الفقارية وشبكية العين. في الحالة الأولى ، الشعر والخلايا الداعمة محاذاة في اتجاه محوري محدد لاستشعار كفاءة المدخلات الميكانيكية مثل الصوت والحركة1،2. وبالمثل، فإن التنظيم المكاني لخلية المستقبلالضوئي ضروري لتحقيق الخصائص البصرية المثلى من قبل شبكية العين3. وبالتالي فإن ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: ينقسم هذا البروتوكول إلى خمس خطوات: (1) إعداد الجرو، (2) إعداد الجرو للتصوير، (3) التصوير الحي لظهارة البطن المتنامية، (4) توليد الفسيفساء الوراثية، (5) معالجة البيانات وتحليلها (بما في ذلك أقسام تصف كيفية تحليل ديناميكيات اتجاه الخلية من الخطوط العريضة لتقاطع الخلايا وديناميكيات النمو من استنساخ الخلايا).

1. التدريج من الخوخ Drosophila قبل التصوير

  1. ذباب الثقافة من النمط الجيني المناسب على المتوسط القياسي في قوارير بلاستيكية عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام (± 12 ساعة) بعد وضع البيض (AEL).
    ملاحظة: يبدأ التحول داخل حبس يرقات النجم الثالث في حالة الجرو عند 120 ساعة AEL حتى 0 ساعة بعد تكوين الخوبة (APF). يمكن التعرف ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يغطي البروتوكول المذكور أعلاه إعداد الخوخ Drosophila للتصوير الحي على المدى الطويل وإجراءات تحليل اتجاه الخلية وديناميكيات نمو البشرة البطنية. من خلال تطبيق هذه المنهجية فمن الممكن لتوليد أفلام عالية الدقة من الخوخ النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض ضوئي كبير أو سمية ضوئية. وترد في الشكل 4لقطات تصور البشرة البطنية (على سبيل المثال، البلس الهيستوبلاسس وLECs) في نقاط زمنية مختلفة ومن الخوخ الموجهة في زوايا مختلفة . يسمح التحليل اللاحق لهذه الأفلا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النظام بعيد المدى هو سمة أساسية لمعظم الوحدات الفسيولوجية الوظيفية. خلال تكوين الشكل ، يتم تحقيق النظام من خلال دمج التعليمات المعقدة التي يتم تنفيذها بدقة زمنية ومكانية عالية. يتم دمج القيود متعددة المستويات والمتعددة المستويات في ترتيبات الأنسجة النمطية.

القطبية والاتجاه أمر حاسم لترتيب المكانية أمر أثناء التنمية. القطبية تعني كسر التماثل أثناء التنمية. تحقيق عدم التماثل ضروري لتحديد الأنثارات الجنينية (A /P) والظهرية (D / V) والمنظمة الكبار26. وإلى جانب هذا الدور الم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد في صاحبي البلاغ تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر أعضاء مختبر مارتين - بلانكو على المناقشات المفيدة. كما نشكر Nic Tapon (معهد كريك، لندن، المملكة المتحدة)، ومركز بلومينغتون للأوراق المالية (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) وFlyBase (للشرح الجيني Drosophila). تم دعم فيديريكا مانجيون من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه من JAE-CSIC. تم تمويل مختبر مارتن بلانكو من Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P و BFU2017-82876-P) ومن Fundación Ramón Areces.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
تحليلالبرمجيات-ImageJتحليل البيانات
ذبابة الفاكهة<em>Atpa::GFP-سلالات تستخدم لجمع البيانات
ذبابة الفاكهةhsflp1.22; FRT40A / FRT40A Ubi.RFP.nls< / em>-سلالات مستخدمة لجمع البيانات
Dumont 5 FallpsFST11251-20قطر 1.5 مم لتشريح
ألواح سفلية زجاجيةحصيرة TekP35G-0.170-14-Cشرانق متصاعدة لجمع البيانات
زيت الهالوكربون 27Sigma-Aldrich9002-83-9شرانق متصاعدة
مجهر متحد البؤر المقلوبZeissLSM700جمع البيانات
المجهر المجسمLeicaDFC365FXتصور الشرانق أثناء التشريح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Pupal EpidermisTissue Orientation AnalysisCell Growth DynamicsConfocal Microscopy ImagingMitotic Recombination TechniqueOrientation J PluginPlanar Polarity AnalysisHistoblast Clone TrackingEpithelial Morphogenesis StudyLive Imaging Protocol

Related Articles