يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري

8.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60291

⸱

يناير 12, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الاوعيه المجهرية من مناطق متعددة من الجهاز العصبي المركزي لفقاريات السسينسيفريك والفقريات.

الملخص

يتم اجراء عزل الاوعيه الدقيقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) عاده عن طريق الجمع بين الانسجه القشرية من العديد من الكائنات ، وغالبا ما تكون القوارض. هذا النهج يحد من التحقيق في خصائص حاجز الدم في الدماغ (BBB) إلى القشرة ولا يسمح للمقارنة الفردية. يركز هذا المشروع علي تطوير طريقه العزلة التي تسمح للمقارنة بين وحده الاوعيه الدموية (NVU) من المناطق العصبية المتعددة: القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، المهاد ، الغدة النخامية ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي. وعلاوة علي ذلك ، تم تكييف هذا البروتوكول ، الذي وضع أصلا لعينات murine ، بنجاح للاستخدام علي الانسجه العصبية من الأنواع الصغيرة والكبيرة فقاري التي نحن أيضا قادره علي عزل الاوعيه الدقيقة من المادة البيضاء في نصف الكره الدماغ. هذا الأسلوب ، عندما يقترن مع المناعي ، يسمح لكميه من التعبير البروتين والمقارنة الاحصائيه بين الافراد ، ونوع الانسجه ، أو العلاج. وقد أثبتنا هذا التطبيق من خلال تقييم التغيرات في تعبير البروتين خلال التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، وهو نموذج murine للمرض التهابي العصبي ، والتصلب المتعدد. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الاوعيه المجهرية المعزولة بواسطة هذه الطريقة للتطبيقات المصب مثل qPCR ، الحمض الريبي المتسلسل ، ولطخه الغربية ، من بين أمور أخرى. علي الرغم من ان هذه ليست المحاولة الاولي لعزل الاوعيه الدقيقة CNS دون استخدام الانحلال القصبي أو التفكك الانزيمي ، فهي فريدة من نوعها في الدقة للمقارنة بين افراد واحد والمناطق العصبية المتعددة. لذلك ، فانه يسمح للتحقيق في مجموعه من الاختلافات التي قد تظل غامضه والا: أجزاء CNS (القشرة ، المخيخ ، الفص البصري ، جذع الدماغ ، المهاد ، الغدة النخامية ، والحبل الشوكي) ، ونوع الانسجه العصبية (المادة الرمادية أو البيضاء) ، والافراد ، مجموعات العلاج التجريبية ، والأنواع.

المقدمة

دماغنا هو الجهاز الأكثر اهميه في جسمنا. لهذا السبب, الحفاظ علي التوازن الدماغ علي الرغم من العوامل الخارجية التي قد تؤدي إلى انحراف عن الحياة الطبيعية هو اولويه. وفقا لبعض العلماء ، حوالي 400-500 مليون سنه مضت1، فقاري الحيوانية وضعت ما نعرفه الآن باسم حاجز الدم في الدماغ (BBB)2،3. هذا "السياج" الواقية تمارس أكبر قدر من التاثير علي النظام العصبي المركزي (CNS) التوازن والوظائف من خلال تنظيم باحكام نقل الأيونات والجزيئات والخلايا بين الدم والخلية العصبية. عندما تتعطل BBB ، يصبح الدماغ عرضه للتعرض السام ، والعدوى ، والتهاب. ولذلك ، يرتبط الخلل الوظيفي BBB مع العديد ، ان لم يكن كل ، اضطرابات العصبية والنمو العصبي4،5،6.

وتعزي الوظيفة المتطورة لل BBB إلى الاوعيه المجهرية العصبية الفريدة التي تتوافق مع وحده الاوعيه العصبية (nvu)2،3. الخلايا البطانية عاليه التخصص ، بيريسيلات ، والقدمين النهاية استروسيتيك هي المكونات الخلوية لل nvu2،3. مصفوفة خارج الخلية المتولدة من هذه الخلايا هي أيضا ضرورية لل nvu و BBB فسيولوجيا2,3. علي الرغم من ان المكونات الخلوية والجزيئية الاساسيه لل nvu يتم الحفاظ عليها بين الفقاريات ، يتم الإبلاغ عن عدم التجانس بين الأوامر والأنواع7،8. ومع ذلك ، القيود التقنية تعيق قدرتنا علي النظر بشكل كامل في هذه الاختلافات في البيولوجيا العصبية ، الطب الحيوي ، أو البحوث الانتقالية.

وبسبب ذلك ، قمنا بتوسيع طريقه العزل المجهري الخاصة بمنطقه السفينة العصبية الخاصة لجعلها قابله للتطبيق علي العديد من الأنواع من مجموعات الفقاري الخمسة: الأسماك والبرمائيات والزواحف والطيور والثدييات. يوصف البروتوكول لاستخدامه علي الفقاريات الصغيرة والفقريات الكبيرة ، بما في ذلك الأنواع ذات الصلة الانتقالية9. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن تشمل مناطق أخرى من الCNS لم يتم التحقيق فيها من قبل في هذا السياق ، ولكن ذات الصلة لفسيولوجيا الأعصاب ومع الآثار السريرية الهائلة: المهاد ، الغدة النخامية ، والمادة البيضاء. وأخيرا ، اختبرنا قدره هذه الطريقة العزلة كاداه موثوق بها لتحديد التغيرات في تعبير البروتين علي طول nvu و/أو BBB9،10،11. كدليل علي المفهوم ، أظهرنا كيفيه تحديد التغييرات في VCAM-1 والتعبير جام-B خلال EAE باستخدام طريقه العزل تليها المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع إجراءات هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعه كاليفورنيا (UC) ، ديفيس المؤسسية الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (IACUC). يتم تنظيم الرعاية الحيوانية في جامعه كاليفورنيا ديفيس من قبل العديد من الموارد المستقلة ، وقد تم اعتمادها بالبالكامل من قبل جمعيه لتقييم واعتماد المختبر الدولي لرعاية الحيوانية (AAALAC) منذ 1966. تم الحصول علي انسجه الخلايا العصبية الخاصة بالخنازير من قسم العلوم الحيوانية في جامعه UCD ، مختبر علوم اللحوم. تم الحصول علي الانسجه العصبية المركزية من macaques ريسوس من كاليفورنيا الرئيسية الرئيسية للبحوث قسم علم الامراض (المعاهد الوطنية للصحة P51OD011107). لم يتم اجراء التخدير أو القتل الرحيم أو الانحلال الجسدي من قبل موظفي المختبر علي الخنازير و macaques. ولذلك ، لا توجد توصيات محدده بشان هذه المسائل.

ملاحظه: تم التحقق من صحة هذا الأسلوب لأنواع متعددة ، ولكن يتوافق مع البروتوكول المتوفر أكثر مباشره إلى الماوس والانسجه الخنازير. لا تنطبق التفاصيل المتعلقة بالفص البصري عند استخدام عينات الثدييات. ويجب معالجه جميع المواد البيولوجية الخطرة في مرفق مناسب لمستوي السلامة البيولوجية (BSL). يجب التعامل مع جميع المواد السامة حاد تحت غطاء الدخان. ويجب التخلص من جميع النفايات الطبية الخطرة بيولوجيا والنفايات السمية الحاده بشكل صحيح.

1-الاعداد

  1. اعداد الحلول (الجدول 1) قبل يوم واحد علي الأقل.
    ملاحظه: من الصعب جدا حل 70 الوزن الجزيئي (MW) ديكسان. فمن أكثر كفاءه للسماح للحل يحرك بين عشيه وضحيها مغطاه اما فيلم البارافين أو إحباط. يتطلب البروتوكول استخدام اثنين من الحلول المختلفة MV-2 اعتمادا علي العينة قيد التحقيق. و 18 ٪ ديديكسان يفصل بكفاءة الميالين من بيليه الاوعيه الدقيقة عند تنفيذ البروتوكول علي العينات الصغيرة ليسينسيفريك. ومع ذلك ، فانه يطور مسحه من الميالين داخل واجهه الانسجه العصبية من العينات الكبيرة الجيروسكوب ، فضلا عن المهاد والغدة النخامية من العينات الصغيرة. يتم منع هذه المسحة باستخدام 20 ٪ ديكدكان.
  2. اعداد الشرائح جيدا عن طريق تحميل 50 μL لكل بئر من بولي-D-يسين واسمحوا الجافة ل 2 ح في درجه حرارة الغرفة (RT) ، ويفضل في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء-الدرجة 2 (BSC-2). لا تفرط في الجفاف. يشطف مرتين بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات ويحفظ في البراد حتى يصبح جاهزا للاستعمال.

2. تشريح الانسجه العصبية من العينات الصغيرة فقاري ليسينسيفريك

ملاحظه: توضح هذه المقالة تطبيق البروتوكول علي C57BL6/J ، 10 الأسبوع القديم ، ~ 25 ز ، الذكور الماوس.

  1. اعداد 2 15 mL أنابيب مخروطيه و 1.7 mL أنبوب ميكروالطرد المركزي مع 5 مل و 1 مل ، علي التوالي ، من الحل MV-1 لكل عينه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.
  2. تخدير
    1. تخدير الفئران بواسطة حقن داخل الصفاق من الكيتامين ، اكسيليازين ، وكوكتيل التخدير اسيبرومازين في 100/10/3 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم ورذاذ مع 70 ٪ الايثانول. تاكيد التخدير من خلال تقييم غياب المنعكسات ودواسات الأصابع عن طريق لمس العين ومعسر القدم ، علي التوالي.
    2. تخدير الحمام عن طريق استنشاق 5 ٪ ايزوفلواني باستخدام مربع التخدير التعريفي.
    3. تخدير الأسماك والضفادع في 1 ٪ Tricaine اما في الأسماك عقد خزان المياه أو البرمائية الحل الرنين (جدول المواد) ، علي التوالي.
    4. تخدير السحالي بالتبريد عند 4 درجه مئوية قبل القتل الرحيم.
  3. قطع الراس الحيوانية مع مقص الجراحية ، قشر بعيدا الجلد مع ملقط لفضح الجمجمة ، وقص مع مقص لاجنج من خلال ماغنوم فورامين (الشكل 1ا).
  4. تشريح الدماغ خارجا مع ملعقة ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
  5. استرداد الغدة النخامية من الجمجمة سيلا سرج مع ملقط ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 mL الصغرى مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
  6. أزاله الجلد والعضلات للكشف عن العمود الفقري. قطع الأطراف والقفص الصدري والأعضاء الداخلية (الشكل 1ب).
  7. تشريح الحبل الشوكي بأحدي الطريقتين الموصوفتين أدناه. ثم ، نقل إلى أنبوب مخروطي 5 مل مع الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
    1. اجراء استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق قطع في منقاري إلى اتجاه الذيليه مع مقص لاجنج ، بدءا من خلال النخاع الشوكي العنقية، حتى تصل إلى الحبل القطني.
    2. اجراء بيغ في الذيليه إلى اتجاه منقاري في جميع انحاء القطنية الفقرية مع ابره 18 ز و 10 مل حقنه محمله بالحل MV-1 (الشكل 1ج ، د).
      ملاحظه: هذا الأسلوب يعمل فقط مع عينات صغيره جدا ، ومعظمهم من القوارض (< 100 غرام).
  8. باستخدام نطاق تشريح ، قطع الكيس الوضعي من الحبل الشوكي مع مقص الربيع وأزاله السحايا المتبقية مع اختيار مزدوجة الشق (الشكل 2).
  9. نقل الدماغ إلى طبق بيتري ، وباستخدام نطاق تشريح ، وأزاله السحايا مع اختيار مزدوجة الشق (الشكل 2ا – ج).
  10. المكوس المصابيح حاسة الشم والمهاد مع ملقط ، مقص القزحية ، ومقص الربيع. باستخدام اختيار مزدوجة الشق ، وأزاله الضفيرة المشيميه من جميع البطينين في الدماغ. تاكد من أزاله جميع الضفيرة المشيميه.
    ملاحظه: الضفيرة المشيميه والمصابيح حاسة الشم هي مصدر هائل من التلوث. وعلي النقيض من BBB, هذه الشعيرات الدموية هي منوفذه للغاية ونتائج التجارب اللاحقة سيتم المساس إذا لم يتم ازالتها.
  11. باستخدام ملقط ، فصل المناطق المستقلة العصبية: القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، الفص البصري (وليس علي عينات الثدييات) ، والمهاد.

3. تشريح الانسجه العصبية من عينه كبيره من فقاري الجيروسكوبات

ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول انسجه الاشعه العصبية التي تم الحصول عليها من مسلخ. ولذلك ، لا يتم وصف أو إظهار التخدير ، القتل الرحيم ، أو العنكبوت.

  1. نقل الانسجه العصبية العامة في حاويه الانسجه 0.946 L (32 oz) محمله بمحلول MV-1 داخل الصدر الجليد/دلو.
  2. باستخدام نطاق تشريح ، وأزاله السحايا مع اختيار مزدوجة الشق ، ملقط ، مقص القزحية ، ومقص الربيع من كل الانسجه العصبية. تاكد من أزاله اي قطع من الضفيرة المشيميه من البطينات الدماغ.

4. العصبي الانسجه التجانس

ملاحظه: هو أكثر كفاءه عندما اثنين من المحققين الانخراط في عمليه التجانس: واحد تشريح السحايا تحت المنظار الفراغي وغيرها من المجانسة الانسجه المفرومة. بهذه الطريقة ، يتم إرجاع الانسجه بسرعة إلى دلو الثلج وتبقي بارده.

  1. وضع كل منطقه CNS علي طبق بتري مع ~ 1 مل من الحل MV-1. باستخدام شفره أحاديه الحافة ، فرم النسيج للحصول علي قطعه 1 – 2 مم.
    1. للحصول علي عينه فقاري صغيره ، استخدم 100 مم × 20 مم طبق بيتري.
    2. للحصول علي عينه فقاري كبيره ، استخدم 150 مم × 15 مم طبق بيتري.
  2. تجانس عينه فقاري صغيره (الجدول 2 والجدول 3)
    1. نقل القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، الفص البصري ، والحبل الشوكي إلى ~ 1 مل من الحل MV-1 في الفرد 10 مل بوتر-Elvehjem طاحونة الانسجه الزجاجية مع مدقه PTFE باستخدام ماصه النقل. أضافه 5 مل من الحل MV-1 وتجانس كل الانسجه (~ 10 السكتات الدماغية). نقل إلى الفردية 15 مل أنابيب مخروطيه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري الصغيرة ، 5 أو 4 ، مع أو بدون الفص البصري ، علي التوالي ، وهناك حاجه إلى 10 مل المطاحن بوتر-Elvehjem و 15 مل أنابيب مخروطيه.
    2. نقل في المهاد والغدة النخامية مع ملقط ل ~ 100 μL من الحل MV-1 في أنبوب الفردية 1.7 mL والمجانسة بعناية مع ميكروبيستلي الزجاج. شطف كل ميكروبيستلي مع ~ 1 مل من الحل MV-1. ابقي الأنبوب علي الثلج
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري الصغيرة ، هناك حاجه إلى 2 الزجاج microمدقه وأنابيب 1.7 mL.
  3. تجانس عينه فقاري كبيره (الجدول 4 والجدول 5)
    1. باستخدام ماصه نقل ، نقل الانسجه المفرومة إلى طاحونة الانسجه الزجاجية بوتر-Elvehjem 55 مل مع مدقه PTFE ونعلق علي الركاب العلوية. يضاف نصف الحجم الموصي به لمحلول MV-1 ، وفقا للجزء الخاص بالوحدة العصبية الخاصة الذي يجري تجانسه (الجدول 5).
    2. بدوره علي الركاب العلوية في سرعه منخفضه جدا (~ 150 دوره في الدقيقة) ونقل بعناية أنبوب الزجاج صعودا وهبوطا لحوالي 30 ق.
    3. إيقاف الحمولة الزائدة ، أضافه المزيد من الحل MV-1 ، وكرر الخطوة 4.3.2 حتى الحصول علي الطين متجانسة.
    4. نقل إلى أنبوب مخروطي 50 mL. ابقي الأنبوب علي الثلج
    5. اغسل الطاحونة بالماء منزوع الأيونات بين تجانس الانسجه العصبية.
      ملاحظه: بالنسبة لفقاري كبيره 5 أو 4 ، مع أو بدون ماده بيضاء ، علي التوالي ، وهناك حاجه إلى أنابيب مخروطيه 50 mL. المثل ، هناك حاجه إلى اثنين (2) 15 مل أنابيب مخروطيه لمهاد والغدة النخامية.

5. تنقيه الاوعيه المجهرية

  1. الخالطون الانسجه الطاردة المركزية الناتجة عن الخطوة 4-2-1 ، 4.2.2 ، أو 4.3.4 في 2,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 درجه مئوية. ستتشكل واجهه بيضاء كبيره من الميالين علي قمة كريات الاوعيه المجهرية المحمرة. تخلص من النمل الخارق.
    1. عينه فقاري صغيره (الجدول 2 والجدول 3)
      1. أعاده تعليق القشرة, المخيخ, جذع الدماغ, الفص البصري, والكريات الحبل الشوكي في 5 مل من محلول الجليد الباردة MV-2 مع ماصه 5 مل المصلية (~ 10 الهبات). أضافه 5 مل من الجليد الباردة MV-2 حل لكل تعليق ومزيج بعناية عن طريق التقليب الأنابيب.
      2. أعاده التعليق الكريات في المهاد والغدة النخامية مع 1 مل من الحل MV-2.
    2. عينه فقاري كبيره (الجدول 4 والجدول 5)
      1. أضافه 20 مل من الجليد الباردة MV-2 الحل إلى القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، والكريات الحبل الشوكي الاوعيه الدقيقة. أعاده التعليق الكريات عن طريق خلط علي أنبوب المسدس شاكر ، مع التحريك في 40 لفه في الدقيقة ل ~ 5 دقيقه. موازنة احجام الأنابيب المخروطية من القشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، وتعليقات الحبل الشوكي عن طريق أضافه المزيد من محلول MV-2.
      2. أعاده تعليق الكريات في المهاد والغدة النخامية المجهرية في 5 مل من الحل MV-2 مع ماصه المصلية 5 مل (~ 10 الهبات). أضافه 5 مل من الجليد الباردة MV-2 حل لتعليق وخلط بعناية عن طريق التقليب الأنبوب.
  2. جهاز الطرد المركزي في 4,400 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c.
  3. افصل طبقه المايلين السميكة والكثيفة بعناية علي الواجهة السائلة من جدران كل أنبوب بتدوير الأنابيب ببطء والسماح لل ماده طافي بالمرور علي طول الجدران.
  4. تجاهل الميالين وواجهه السائل ولطخه الجدار الداخلي لكل أنبوب مع ملعقة ملفوفه مع مسح ورقه منخفضه الوبر. بالنسبة للعينات فقاري الصغيرة ، قم بازاله طبقه الميلين من كل المهاد وأنبوب الغدة النخامية عن طريق الشفط بعناية مع ماصه النقل.
  5. امسحي السائل الزائد بمسحه ورقيه منخفضه الوبر. أعاده تعليق كل بيليه مع 1 مل من الحل MV-3 باستخدام نصائح ملزمه منخفضه. إبقاء الأنابيب علي الجليد.

6. المرجل المجهري والترشيح

  1. صب الجليد الباردة MV-3 الحل في الأكواب الفردية لكل منطقه CNS. يحفظ في 4 درجه مئوية.
    1. لفقاري الصغيرة العينات ، استخدم 10 مل من الحل MV-3 لكل كوب 50 mL. ومن الضروري ما مجموعه 6 – 7 أكواب اعتمادا علي ما إذا كان الفص البصري مشمولا ام لا.
    2. لفقاري العينات الكبيرة ، استخدم 30 مل من محلول MV-3 لكل كوب 100 مل. ما مجموعه 6 – 7 أكواب ضرورية اعتمادا علي ما إذا كانت المادة البيضاء مشمولة ام لا.
  2. وضع مصفاه الخلية علي راس أنبوب مخروطي 50 mL. استخدم واحده لكل منطقه CNS. استخدام مصفاه 100 μm لقشره, جذع الدماغ, الفص البصري, الحبل الشوكي, والغدة النخامية. استخدام مصفاه الخلية 70 μm لمخيخ والمهاد.
  3. الرطب كل مصفاه مع 1 مل من الجليد الباردة MV-3 الحل.
  4. أضافه المزيد من الحل MV-3 للتعليقات التي أعدت في الخطوة 5.5 مع ماصه المصلية في حين خلط لتجنب المجاميع. بعناية تحميل الاوعيه الدقيقة علي راس المصفاة. شطف مع الجليد الباردة MV-3 الحل.
    1. بالنسبة للعينات فقاري الصغيرة (الجدول 2 والجدول 3) ، أضف 10 – 15 مل من محلول mv-3 مع ماصه مصليه واشطف مع 5 مل من محلول mv-3.
    2. بالنسبة للعينات فقاري الكبيرة ، أضف 20 مل من محلول MV-3 مع ماصه مصليه واشطف مع 10 مل من محلول MV-3.
  5. تجميع وحده الترشيح عن طريق وضع فلتر صافي 20 μm النايلون علي حامل مرشح تعديل (الشكل 2د) ، واحد لكل منطقه الجهاز العصبي الخاص.
    1. بالنسبة للعينات الفقارية الصغيرة (الجدول 2 والجدول 3) ، استخدم حامل الفلتر المعدل 25 مم للقشرة والمخيخ وجذع الدماغ والفص البصري والحبل الشوكي. استخدام 13 ملم مرشحين تعديل لفي المهاد والغدة النخامية.
    2. بالنسبة للعينات الفقارية الكبيرة (الجدول 4 والجدول 5) ، استخدم أصحاب مرشحات 47 mm المعدلة للقشرة ، المخيخ ، جذع الدماغ ، والحبل الشوكي. استخدام 25 ملم لمهاد والغدة النخامية.
  6. تصفيه مكان علي راس أنبوب مخروطي 50 mL وفلتر الرطب مع 5 مل من الجليد الباردة MV-3 الحل مما يجعل العازلة بالتاكيد يصب أسفل حامل مرشح إلى أنبوب مخروطي.
  7. نقل الاوعيه الدقيقة التي لا يمكن التملص منها (من الخطوة 6.4) علي اعلي فلتر صافي النايلون 20 μm وشطف الاوعيه الدقيقة مع 5-10 مل من محلول الثلج البارد MV-3.
  8. استعاده فلتر باستخدام ملقط نظيفه وتزج به في الكاس التي تحتوي علي الجليد الباردة MV-3 الحل أعدت في الخطوة 6.1.
  9. افصل الاوعيه الدقيقة من الفلتر عن طريق هزها برفق لحوالي 30 ثانيه. لفقاري الصغيرة العينات ، صب المحتوي الكاس في أنبوب مخروطي 15 مل. لفقاري الكبيرة العينات ، صب المحتوي الكاس في أنبوب مخروطي 50 mL.
  10. جهاز الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 5 دقائق عند 4 °c وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من محلول الجليد الباردة MV-3 باستخدام غيض ماصه منخفضه التصاق.
    1. لفقاري الصغيرة العينات ، نقل تعليق (من الخطوة 6.10) إلى 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 20,000 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الدورة علي أجهزه الطرد المركزي بالأعلى بسرعة قصوى (~ 20,000 × g) لضمان العائد القوي.
    2. لفقاري العينات الكبيرة ، نقل التعليق من الخطوة 6.10 إلى 5.0 mL أنبوب الطرد المركزي ، أضافه 4 مل من الحل MV-3 ، وأجهزه الطرد المركزي في 2,000 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.

7-التحصين المناعي

ملاحظه: تم اجراء تلطيخ الهييوكسيلين و ايوسين (H & E) علي الزواحف ، البرمائيات ، وعينات الأسماك كدليل علي مفهوم جدوى البروتوكول. ولذلك ، لا توجد توصيه للمناعة لهذه العينات.

  1. أزاله ماده طافي من أنابيب الطرد المركزي الصغير.
  2. أعاده تعليق بيليه في 1x العقيمة تلفزيوني باستخدام غيض ماصه منخفضه ملزمه (جدول المواد). الحفاظ علي الاوعيه المجهرية من تشكيل المجاميع عن طريق الأنابيب عده مرات. لفقاري الصغيرة العينات (الجدول 3) ، استخدم ~ 100 μl-2000 μl وفقا لحجم بيليه. لفقاري الكبيرة العينات (الجدول 5) ، استخدم ~ 1,000 μl-4000 μl وفقا لحجم بيليه.
  3. باستخدام طرف ماصه منخفضه التصاق ، قم بنقل الاوعيه الدقيقة إلى شرائح جيدا ، وتوخي الحذر لأضافها إلى وسط كل بئر ، وتجنب الجوانب الجانبية.
  4. تعيين الشرائح جيدا ، وكشفت ، داخل BSC-2 ، واسمحوا الجافة لمده 20 إلى 30 دقيقه في RT.
    ملاحظه: يتم استخدام حجم كبير نسبيا من 1x تلفزيوني لتجنب تشكيل التجميعية. وبسبب هذا ، فمن الضروري السماح للشرائح الجافة قبل التثبيت للتاكد من ان يتم عقد الاوعيه الدقيقة بواسطة طلاء بولي دي يسين.
  5. أزاله المتبقية 1x تلفزيوني عن طريق السحب خارج مع ماصه نقل ، أضافه 200 μL من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
  6. ماصه للحل المثبت وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT.
    ملاحظه: H & E تلطيخ علي الأسماك ، البرمائيات ، والزواحف المجهرية CNS تم تنفيذها في هذه المرحلة.
  7. أضافه 200 μL من حظر المخزن المؤقت إلى الشريحة جيدا واحتضان لمده 60 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  8. أزاله العازلة حظر مع ماصه نقل وأضافه 200 μl من كوكتيل الأجسام المضادة الاساسيه في مخفف الأجسام المضادة (جدول المواد). احتضان في 4 °C بين عشيه وضحيها.
  9. ماصه من كوكتيل الأجسام المضادة الاساسيه وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT.
  10. تحميل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) المخفف في 1X تلفزيوني واحتضان لمده 2 ح في RT ، محمية من الضوء.
  11. ماصه من كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية وغسل 3x مع 200 μL من 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في RT ، محمية من الضوء. بعد غسل الماضي فصل الإطار جيدا الشريحة ولطخه الجافة اي الزائدة 1x تلفزيوني مع مسح ورقه منخفضه الوبر.
  12. أضافه كوفيرسليب ، السائل اللورن المتوسطة ، و 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi) لتلطيخ النووية. اسمحوا الجافة بين عشيه وضحيها في RT المحمية من الضوء.
  13. مره واحده الجافة ، والحفاظ علي حماية من الضوء علي مربع الشريحة في 4 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه للمجهر البؤري والحصول علي البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأظهرت الاوعيه المجهرية المعزولة من murine CNS جميع المكونات الخلوية الجوهرية للوحدة العصبية2,3. باستخدام اما الصفائح الدموية الغشائية التصاق جزيء-1 (PECAM ، المعروف أيضا باسم CD31) أو ايسولكتين IB4 (بروتين سكري الذي يربط غليكوكاليكس الخلية البطانية) للخلايا البطانية ، عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية-β (PDGFRβ) أو الخلايا العصبية-غليال مستضد 2 (NG2) ل perسيلات و اكوابورين-4 (AQP4) للحصول علي نهاية القدم الفلكية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتضمن BBB الخصائص الفريدة للخلايا الغشائية الوعائية المجهرية التي يقترن بها بنيه متطورة من ضيق-، ملتصقين-، "ربط المقبس"-تقاطعات ، والتصاق لويحات الحرجة ل CNS التوازن2،3،19. يتم الحث علي خصائص الخلايا البطانية والحفاظ عليها من قبل pericytes والعمليات المحيطة بالأرجل الفلكية المجاورة2،3،19. يعرض الاوعيه الدقيقة BBB القطبية (اي نمط التعبير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم الدكتور كروز اورينجو من قبل جامعه كاليفورنيا ، ديفيس ، كليه الطب البيطري بدء الأموال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
يستخدم BP39920 10X PBSThermoFisherفي الحجب ومخفف الأجسام المضادة.
20٪PFA علوم المجهر الإلكتروني15713-Sتستخدم كمثبت (4٪ PFA)
70،000 ميجاوات DextrannMillipore Sigma9004-54-0تستخدم لحل MV-2
Adson CorppsFine Science Tools (FST)11006-12تستخدم لإزالة العضلات والجلد
ملقط Adson ، جودة الطالبFST91106-12نفس النحو الوارد أعلاه ولكن أرخص
مصل البقر الألبومين (BSA)Millipore SigmaA7906-100Gيستخدم لمحلول MV-3 ، ومنع وتخفيف الأجسام المضادة
Corning 100 & mu ؛ مصفاة الخلية mMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 & mu ؛ مصفاة m CellMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork نصائح منخفضة الربطMillipore SigmaCLS4151كما هو موضح أدناه ولكن أرخص.
كولتريكس بولي دي ليسينآر آند D3439-100-01يستخدم لطلاء الشرائح
الحمار المضاد للماعز IgG-ALEXA 555ThermoA21432يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الحمار المضاد للفأر IgG-ALEXA 488ThermoA21202يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الحمار المضاد للأرانب IgG-ALEXA 488ThermoA21206يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الحمار المضاد للأرانب IgG-ALEXA 647ThermoA31573يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الحمار المضاد للفئران IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
اختيار الأنسجة ذات الشقالمزدوج FST18067-11يستخدم لإزالة السحايا والضفيرة المشيمية
Dumont #3c ملقطFST11231-20يستخدم لمناولة أنسجة الجهاز العصبي المركزي الأكثر حساسية و / أو الصغيرة (مثل الغدة النخامية)
Dumont # 7 CorppsFST11274-20تستخدم لتشريح الجهاز العصبي المركزي والتعامل معه
Dumont # 7 Fallps ، الطالبFST91197-00كما هو مذكور أعلاه ولكن أرخص
EP Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008جودة أفضل من النصائح المذكورة أعلاه (أغلى).
ملقط Graefe ناعم للغاية ،FST11151-10مسنن يستخدم لإزالة العظام
مقص ناعم ،حاد FST14060-09يستخدم لإزالة كيس الخنازير والمكاك الجافية
زجاج مدقة 1.5 مل خالط أنبوب الطرد المركزي الدقيق طاحونة الأنسجة الخالط ، حزمة من 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10تستخدم في منطقة ما تحت الحمراء الصغيرة والغدة النخامية.
الماعز المضاد ل CXCL12 ، البيوتينيلPeproTech500-P87BGBTيستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التخفيف الموصى به: 1:20.
الماعز المضادة ل JAM-BR & DAF1074يستخدم كجسم مضاد أساسي لتقييم الالتهاب العصبي. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الماعز المضاد للفأر IgG-ALEXA 488ThermoA11001يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الماعز المضاد للفأر IgG-ALEXA 555ThermoA21424يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الماعز المضادة ل PDGFR & beta ؛R & DAF1042يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الماعز المضاد للأرانب IgG-ALEXA 555ThermoA21249يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الماعز المضاد للأرانب IgG-DyLight 488Thermo35552يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
الماعز المضاد للفئران IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021يستخدم كجسم مضاد ثانوي. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
ملقط Graefe ، طرف منحني ، أسنان 1X2FST11054-10يستخدم لعقد صافي مرشح النايلون وهز
HBSS ، 1X عازلة مع الكالسيوم والمغنيسيومCorning21-022-CMتستخدم لمحلول MV-1
HEPES ، 1M عازلة سائلةCorning25-060-CIتستخدم لمحلول MV-1
Isolectin GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414البروتين السكري المعزول من البقوليات Griffonia simplicifolia التي تربط بقايا D-galactosyl من glycocalysx للخلايا البطانية. تستخدم للسفن الدقيقة للجهاز العصبي المركزي للطيور والخنازير. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
مقص LaGrange ، FST مسنن14173-12يستخدم لتشريح الجمجمة واستئصال الصفيحة الفقرية (باستثناء الخنزير المكاك)
Millicell EZ الشريحة 8 آبار وحدةMillipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500تستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الفأر المضاد ل GGT1Abcamab55138يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الفأر المضاد للإنسان CD31R & DBBA7يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي للرئيسيات. التركيز الموصى به: 16.5 مو ؛ جم / مل.
الفأر المضاد ل NFMThermoRMO-270يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الفأر المضاد لألفا SMAThermoMA5-11547يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
شبكة تصفية النايلون ، لفةMillipore SigmaNY6000010أقراص صافية مرشحة مقطوعة بالليزر إلى أقراص صافية قطرها 13 مم. تستخدم لمنطقة ما تحت الحمراء الصغيرة والغدة النخامية.
شبكات ترشيح النايلون ، 25 ممMillipore SigmaNY2002500تستخدم في معظم أنسجة الجهاز العصبي المركزي للفقاريات الصغيرة ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية. تستخدم لمنطقة ما تحت المهاد المكاك والخنازير والغدة النخامية.
شبكات ترشيح النايلون ، 47 ممMillipore SigmaNY2004700تستخدم لأنسجة الجهاز العصبي المركزي للمكاك والخنازير ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية.
كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان مع DAPIThermoFisherP36935يستخدم لتغطية الشرائح.
أرنب مضاد ل AQP4Millipore SigmaA5971يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
SAB2107967يستخدم الأرنب المضادLSR Millipore Sigmaكجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
أرنب مضاد ل NG2Millipore SigmaAB5320يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
أرنب مضاد ل OSPAbcamab53041يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 1 & mu ؛ جم / مل.
أرنب مضاد للفيروسف-كاديرينAbcamab33168يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
أرنب مضاد ل ZO-1Thermo61-7300يستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
550274 الفئران المضادة ل CD31Becton DickinsonBDكجسم مضاد أساسي للأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي للفئران. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
الفئران المضادة ل GFAPThermo13-0300تستخدم كجسم مضاد أساسي على الأوعية الدقيقة للجهاز العصبي المركزي من جميع العينات. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 200.
Becton DickinsonBDالمضاد للجرذ VCAM-1553329 كجسم مضاد أساسي لتقييم الالتهاب العصبي. التركيز الموصى به: 5 مو ؛ جم / مل.
محلول Ringer المعقم ، FrogAldon CorporationIS5066يستخدم للتخدير الأمفيبي
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355يستخدم كجسم مضاد ثانوي لتسمية الأجسام المضادة الأولية الحيوية. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357يستخدم كجسم مضاد ثانوي لتسمية الأجسام المضادة الأولية الحيوية. التخفيف الموصى به بنسبة 1: 500.
مقص جراحي ، حادFST14002-12يستخدم لإزالة العضلات والجلد
مقص جراحي ، حادحاد FST14001-16يستخدم لقطع الرأس (باستثناء الخنازير المكاك)
حامل مرشح سوينكس ، 13 ممMillipore SigmaSX0001300تم تعديله بواسطة القطع بالليزر. تستخدم لمنطقة ما تحت الحمراء الصغيرة والغدة النخامية.
حامل فلتر سوينكس ، 25 ممMillipore SigmaSX0002500معدل بالقطع بالليزر. تستخدم في معظم أنسجة الجهاز العصبي المركزي للفقاريات الصغيرة ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية. تستخدم لمنطقة ما تحت المهاد المكاك والخنازير والغدة النخامية.
حامل فلتر سوينكس ، 47 ممSX0004700 Millipore Sigmaتم تعديله بواسطة القطع بالليزر. تستخدم لأنسجة الجهاز العصبي المركزي للمكاك والخنازير ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277يستخدم للحجب وتخفيف الأجسام المضادة.
Wheaton 120 Vac Overhead StirrerVWR (المورد DWK Life Sciences)62400-904 (DWK # 903475) تستخدملأنسجة الجهاز العصبي المركزي للمكاك والخنازير مع طاحونة أنسجة سعة 55 مل ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية.
مطحنة مناديل Wheaton Potter-Elvehjem مع مدقة PTFE ، 10 ملVWR (مورد DWK Life Sciences)14231-384 (DWK # 357979) تستخدمفي معظم أنسجة الجهاز العصبي المركزي للفقاريات الصغيرة ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية. تستخدم لمنطقة ما تحت المهاد المكاك والخنازير والغدة النخامية.
طاحونة مناديل Wheaton Potter-Elvehjem مع مدقة PTFE ، 55 ملVWR (مورد DWK Life Sciences)14231-372 (DWK # 357994) تستخدملأنسجة الجهاز العصبي المركزي للمكاك والخنازير ، باستثناء منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية.
ل يستخدم يستخدم

المراجع

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خصائص الحاجز الدموي الدماغيمقارنة الوحدة الوعائية العصبيةتقنية عزل الأوعية الدموية الدقيقةتشريح أنسجة الجهاز العصبي المركزيتجانس محلول MV-1بروتوكول تنقية الأوعية الدموية الدقيقةطرق الكشف عن الوسم المناعيالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبيقياس كمية التعبير البروتيني
عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.