يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

6.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60295

⸱

يناير 23, 2020

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

في هذه المقالة

ملخص

نقدم ثلاثة بسيط في المختبر ومقالات الهجرة لمسافات طويلة ، والدراسة المشتركة للهجرة الثقافة ، والكيميائية جاذبية الجاذبية والمواد التي تقيم بشكل جماعي وظائف الخلايا الجذعية البشرية المستمدة الخلايا البطانية التشعبية ولهم التفاعل مع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic.

الملخص

دور الأوعية الدموية في الدماغ في تطوير الجهاز العصبي ومسببات اضطرابات الدماغ تكتسب اهتماما متزايدا. وقد حددت دراساتنا الحديثة مجموعة خاصة من الخلايا الوعائية، والخلايا الفيوذيلية التشعبية، التي تلعب دورا حاسما في هجرة وتوزيع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic prebrain أثناء التطور الجنيني. هذا، إلى جانب وظائفها المستقلة الخلية، يلمح إلى أدوار جديدة من الخلايا الفيوذيلية التشعبية التشعبية في علم الأمراض من الاضطرابات العصبية النفسية مثل الفصام، والصرع، والتوحد. هنا، وصفنا ثلاثة مقالات مختلفة في المختبر التي تقيّم بشكل جماعي وظائف الخلايا البطانية التشعبية التشعبية وتفاعلها مع الخلايا العصبية البينية GABAergic. استخدام هذه المقالات، لا سيما في سياق الإنسان، سوف تسمح لنا لتحديد الصلة بين الخلايا التناسلية التشعبية المعطبية واضطرابات الدماغ. هذه المقالات بسيطة ومنخفضة التكلفة وقابلة للاستنساخ ، ويمكن تكييفها بسهولة مع أي نوع خلية ملتصقة.

المقدمة

الخلايا البطانة تشكل بطانة الأوعية الدموية وتتوسط وظائف هامة التي تشمل الحفاظ على نفاذية جدار السفينة, تنظيم تدفق الدم, تجميع الصفائح الدموية, وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. في الدماغ، تشكل الخلايا الفيوذيلية جزءا من حاجز الدم الدماغ الحرجة التي تسيطر بإحكام تبادل المواد بين الدماغ ومجرى الدم1. وقد حددت دراساتنا في العقد الماضي الأدوار العصبية الجديدة للخلايا البُنائية للدماغ التي لها آثار كبيرة على نمو الدماغ وسلوكه2،3،4،5. لقد أظهرنا أن الدماغ الأمامي الجنيني للفأر هو الأوعية الدموية من قبل نوعين فرعيين متميزين من الأوعية، والأوعية البيال والأوعية المحيطية، التي تختلف في التشريح والأصل، والشخصية التنموية2. الخلايا البطانة بطانة هذين النوعين الفرعيين السفينة تظهر اختلافات واضحة في ملامح التعبير الجيني. في حين أن الخلايا اللبية اللبية اللبية تعبر في الغالب عن الجينات المتعلقة بالالتهاب والاستجابة المناعية ، فإن الخلايا اللبية اللبية يتم تخصيبها بشكل فريد في التعبير عن الجينات المرتبطة عادة بالتكوين العصبي ، والهجرة العصبية ، chemotaxis ، والتوجيه المحوري3. الخلايا البُصيّدة التبذيلية التعامدية أيضاً بيت رواية GABA إشارة مسار التي تتميز عن الخلايا العصبية التقليدية GABA إشارة المسار5. بالتزامن مع التعبير الجيني، تم العثور على الخلايا الفيوذيلية التشعبية لتنظيم الهجرة وتوزيع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic في القشرة الجديدة النامية. أثناء التطور الجنيني ، تخضع الخلايا الفيوثيريلية العمودية للهجرة لمسافات طويلة على طول تدرج الصمام البطني لإنشاء شبكة الأوعية الدموية العمودية2،3. وينعكس هذا الطريق الهجرة بعد يوم واحد من قبل interneurons. المهاجرة interneurons تتفاعل جسديا مع شبكة الأوعية الدموية عمودي شكلت مسبقا واستخدامها كدليل للوصول إلى وجهتها النهائية في القشرة الجديدة. بالإضافة إلى العمل كركيزة مادية، تعمل الخلايا العضوية العضوية العضوية العضوية العضوية كمصدر للإشارات الملاحية للخلايا العصبية المهاجرة. الخلايا التشعبية التشعبية التشعب GABA أدلة الهجرة interneuron وينظم أنماط التوزيع النهائي4. ترتبط العيوب في هجرة الخلايا العصبية البينية وتوزيعها بالاضطرابات العصبية النفسية مثل التوحد والصرع والفصام والاكتئاب6و7و8و9و10. لذلك ، تصبح دراسة وظائف الخلايا الفيوذيلية المعطبة وتأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية في السياق البشري أمرًا حاسمًا لمعالجة الإمراض لهذه الاضطرابات.

لقد قمنا بتوليد الخلايا البُطاجنة الشبيهة بالمفصلية البشرية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في مختبرنا11، باستخدام تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)12،13. للتحقق مما إذا كانت الخلايا البطانية التعشية ية البشرية تحاكي بأمانة الخلايا البطانية التعشيةية للفأرة، ولتقييم تأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية تقييمًا كمًا، قمنا بتطوير ثلاث تقييمات في المختبر: فحص هجرة لمسافات طويلة، ودراسة هجرة مشتركة في الثقافة، وفحص كيميائي جذاب. هنا نصف بروتوكولات هذه المقالات بالتفصيل. وتستند جميع المقالات الثلاث على استخدام إدراج ثقافة السيليكون لإنشاء رقعة مستطيلة صغيرة من الخلايا (ذات الأبعاد الثابتة) محاطة بمساحة خالية من الخلايا. يتم تقييم مسافة الترحيل عن طريق قياس المسافة بين المواضع النهائية للخلايا من حدود الرقعة المستطيلة التي تم تحديدها في اليوم 0. في اختبار الهجرة لمسافات طويلة ، يتم بذر الخلايا البُطاية التشعبية المعفرة البشرية كرقعة في وسط طبق 35 ملم ، ويتم حساب المسافات التي تقطعها الخلايا على مدى طويل من الزمن. في تحليل الهجرة في الثقافة المشتركة، تشارك الخلايا الفيوذيلية التعبدية البشرية مع الخلايا العصبية البشرية كرقعة واحدة في طبق 35 ملم. هذا الإعداد يسمح بفحص تأثير التفاعلات المادية المباشرة من هذين النوعين من الخلايا على معدل الهجرة من interneurons. يقيس إجراء الجاذبية الكيميائية هجرة الخلايا العصبية البينية استجابة للإشارات الجذابة كيميائيًا التي تفرزها الخلايا الفيوذيلية المحيطية البشرية. يتم بذر الخلايا العصبية البينية كرقعة مستطيلة ، مع خلايا البوذيلية التعشية ية التعشية ية البشرية والتحكم في الخلايا البُنائية غير التعشيةية غير المعبّرة كبقع مماثلة الحجم على كلا الجانبين. يتم فصل كل من بقع الخلية بواسطة فجوة خالية من الخلايا من 500 ميكرومتر. يتم تقييم استجابة الخلايا العصبية البينية عن طريق تحديد عدد الخلايا التي هاجرت نحو الخلايا البُضائية التشعبية التشعبية التشعبية التشعبية بالقياس إلى التحكم في الخلايا البُنْمية غير التضائية التضائية غير التضافرية.

توفر هذه المقالات تقييمًا قويًا لوظائف الخلايا البُلية التعشيةية البشرية وتأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية. يوفر الإعداد الجديد للاقاعات طويلة المدى وزراعة المشاركة في نقل الثقافة مساحة خالية من الخلايا في نطاق سنتيمتر (~ 1-1.5 سم) للسماح بالكشف عن الهجرة لمسافات طويلة. ويرد في الجدول 1ملخص لملامح مقالاتنا مقارنة بمقالاتنا الشائعة الأخرى. بشكل جماعي ، فإن المقالات الموصوفة هنا ستكون بمثابة منصة لتقييم الخلايا الفيوليلية "المريضة" والخلايا العصبية البينية الناتجة عن iPSCs من اضطرابات الدماغ مثل الفصام أو التوحد أو الصرع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقالات لتحديد كيفية الظروف المختلفة (مثل مثبطات، ليغاند، RNAi) تؤثر على هجرة الخلايا. وأخيراً، يمكن تحسين هذه المقالات لأنواع الخلايا الأخرى لقياس الهجرة لمسافات طويلة، أو الجاذبية الكيميائية، أو الهجرة بوساطة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثقافة وتخزين الخلايا البُصيّدة التعاميّمية

  1. الحفاظ على الخلايا البطانة التشعبية البشرية على غشاء الطابق السفلي المغلفة مصفوفة (انظر جدول المواد)لوحات 6-well في متوسطة الخلية البطانة المحيطية (E6 المتوسطة التي تحتوي على 50 نانوغرام/مل VEGF-A، 100 نانوغرام/مل FGF2 و 5 μM GABA) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير المتوسطة كل يوم بديل.
  2. إذابة مصفوفة غشاء الطابق السفلي في 4 درجة مئوية، وجعل حل 1:100 عن طريق تخفيف ه في DMEM/F12 المتوسطة الباردة. معطف كل بئر من لوحة 6-well مع 1 مل من محلول المصفوفة. تحضن لوحات في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام.
  3. السماح للخلايا التبطانية التشعبية البشرية للوصول إلى التقاء 80٪-90٪. يستنشق المتوسطة من البئر. غسل الآبار مرة واحدة مع 1 مل من 1x مقسم معقم لكل بئر.
  4. فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من حل الانفصام الخلية (انظر جدول المواد)لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. بعد 5 دقيقة، إضافة 1 مل من متوسطة الخلية البُضاة التشعبية التشعبية. نقل حل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: نحن نستخدم Accutase لتفكك الخلية هنا، بدلاً من التربي في القسمين 3 و 4.
  5. خلايا الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من متوسطة الخلية الانبذيلية التشعبية التشعبية.
  6. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة الاستبعاد الأزرق trypan. خلايا البذور في لوحات جديدة مغلفة بمصفوفة بكثافة 1.2 × 105 خلايا / سم2. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. تخزين الخلايا البُاثية التعاميفية البشرية عن طريق الحفاظ على التجميد في وسط التجميد (90٪ متوسطة الخلية البُلية المحيطية و10٪ DMSO).
    1. فصل وجمع الخلايا التالية الخطوات 1.3 و 1.4 أعلاه. عد الخلايا في الحل بواسطة أسلوب الاستبعاد الأزرق trypan.
    2. خلايا الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يستنشق supernatant وresuspend بيليه الخلية في 5 × 106 خلايا / مل من وسط التجميد.
    3. الاستغناء 1 مل من تجميد المتوسطة بالإضافة إلى الخلايا في cryovial. ضع القنينات في غرفة مليئة بالايزوبروبانول وتبرد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية عند درجة مئوية واحدة/دقيقة.

2. إعداد الخلايا البُصيّدة التعاميّمية للتنظير للتنظير

  1. السماح للخلايا البُازُنة التعاملية البشرية بالوصول إلى 70%-80% التقاء.
  2. الخلايا المنفصلة بعد الخطوات 1.3 إلى 1.5 كما هو موضح أعلاه. عد الخلايا باستخدام طريقة الاستبعاد الأزرق trypan.

3. إعداد الخلايا العصبية المشتركة GABAergic الإنسان للحصول على إجراء

ملاحظة: تم شراء الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (iPSC) المشتقة من GABAergic interneurons والمتوسطة العصبية تجاريًا (انظر جدول المواد). يتم إنشاء الخلايا العصبية عن طريق التمييز بين خط iPSC الإنسان المشتقمن الخلايا الليفية بعد بروتوكول وضعته الشركة المصنعة. تم إذابة الخلايا ومثقفوفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

  1. إذابة الخلايا العصبية المشتركة GABAergic الإنسان وثقافة لهم في لوحة 12 جيدا لمدة أسبوعين إلى التقاء من 70٪-80٪.
  2. في يوم من الخزعة، حل الخلايا الحارة (انظر جدول المواد)وaliquot من وسط الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. استشير ة متوسطة من كل بئر يحتوي على الخلايا. غسل الخلايا مع 1 مل من 1x مقسم المعقم في البئر.
  4. فصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الانفصام قبل الدفء لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. أضف 1 مل من وسط الخلايا العصبية لكل بئر. نقل حل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. ثلاثية بلطف لفصل كتل الخلية.
  5. خلايا الطرد المركزي في 380 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسط الخلايا العصبية. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة الاستبعاد الأزرق trypan.

4. إعداد الخلايا النتمية البشرية السيطرة على الخلايا للاقها

ملاحظة: تم شراء الخلايا التنظيرية البشرية المشتقة من iPSC والمتوسطة الخلية البذيلية بشكل تجاري(جدول المواد). يتم إنشاء هذه الخلايا التنظيرية عن طريق التمييز بين خط iPSC الإنسان المشتق من الخلايا الليفية إلى مصير البُنَدِيبعد بروتوكول طورته الشركة المصنعة. تم إذابة الخلايا ومثقفعلى الركيزة ليفينكتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إعداد لوحات المغلفة فيلينكتين بعد بروتوكول الشركة المصنعة.

  1. ذوبان السيطرة على الخلايا البُنثية البشرية واستزراعها في 6-well لوحة إلى التقاء من 80٪-90٪.
  2. في يوم من الخزعة، حل الخلايا الحارة (انظر جدول المواد)وaliquot من الوسط الاندوذيل في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. اسشق الوسط من كل بئر يحتوي على الخلايا. غسل الخلايا مع 1 مل من 1x مقسم المعقم في البئر.
  4. فصل الخلايا عن طريق إضافة 0.5 مل من محلول الانفصام ما قبل الحارة في البئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. أضف 1 مل من وسط الخلية الانبوتية لكل بئر لتحييد حل التفكك. نقل حل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اسذاء supernatant وresuspend بيليه الخلية في 1 مل من وسط الخلية البذاءة. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة الاستبعاد الأزرق trypan.

5. إعداد إدراج ثقافة بئر واحد

  1. إذابة محلول لامينين 1 ملغم/مل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  2. معطف عدد مناسب من الأطباق 35 ملم مع 0.01٪ بولي-L-ornithine الحل (1 مل لكل طبق). احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  3. تمييع 1 ملغم/مل محلول لامينين 1:300 في الماء المعقم إلى تركيز نهائي قدره 3.3 ميكروغرام/مل مباشرة قبل الاستخدام.
  4. تستنشق تماما بولي-L-ornithine من كل طبق. شطف كل طبق جيدا 3x مع الماء المعقم واستنشاق تماما لتجنب سمية الخلايا الناجمة عن بولي L-ornithine.
  5. أضف 1 مل من محلول اللامينين 3.3 ميكروغرام/مل لكل طبق واحتضانه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو على الأقل 1 ساعة. إزالة محلول اللامينين من الطبق مباشرة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، قم بتخزين الأطباق المحتوية على اللامينين في 4 درجات مئوية. اتوازن الأطباق في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  6. قطع ثلاثة جوانب من بئر واحد من اثنين من جيدا إدراج ثقافة السيليكون(الشكل 1A)باستخدام شفرة معقمة لتوليد إدراج بئر واحد(الشكل 1B).
    ملاحظة: الحفاظ على إدراج اثنين من جيدا تعلق بحزم على سطح التعبئة والتغليف الأصلي في حين قطع لضمان قطع على نحو سلس وحماية لاصقة من إدراج.
  7. اسشق حل لامينين من الأطباق.
    ملاحظة: لا تغسل الأطباق مع PBS المعقم أو الماء بعد حضانة اللامينين. الأسطح الرطبة سوف تمنع التصاق ضيق من إدراج الثقافة.
  8. إزالة واحد جيدا إدراج مع ملاقط معقمة ووضعه في وسط طبق بولي-L-ornithine/laminin المغلفة. اضغط على طول حواف إدراج لإصلاحه على سطح الطبق.
  9. قم ببعناية لتحويل الطبق رأسا على عقب للتحقق من أن يتم الالتزام بحزم إدراج.
  10. حافظ على الطبق رأسًا على عقب ووضع علامة على حدود حجرة الإدراج باستخدام علامة سوداء دائمة مع طرف ناعم للغاية(الشكل 1C).

6. طويلة المدى الهجرة المنقاة

  1. تعليق الخلايا العصبية المشتركة GABAergic الإنسان بتركيز 3 × 104 خلايا / 70 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية. البذور 70 ميكرولتر من محلول الخلية داخل كل إدراج ثقافة بئر واحد.
    ملاحظة: كثافة البذر من الخلايا العصبية البينية وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
  2. تعليق الخلايا البُاقة التشعبية التشعبية البشرية بتركيز 3 × 104 خلايا/70 ميكرولتر من وسط الخلية البُاقة التطفلية التشعبية التشعبية التشعبية. البذور 70 ميكرولتر من محلول الخلية داخل كل إدراج ثقافة بئر واحد.
    ملاحظة: عدد الخلايا الفيوذيلية المعتقّدة البشرية المبذرة بنسبة 1:1 مع عدد الخلايا العصبية المبذرة.
  3. إضافة 1 مل من وسط الخلايا العصبية في طبق الخلايا العصبية لملء المنطقة المحيطة إدراج ومنع الطلاء من التجفيف. وبالمثل، أضف 1 مل من وسط الخلية الانبذيلية التشعبية العمودية في طبق الخلية الانجيلية التشعبية العمودية.
    ملاحظة: أضف متوسط ببطء على طول حافة الطبق بحيث لا يتم إزعاج الإدراج.
  4. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا لا تتسرب من حجرة الإدراج.
  5. الخلايا المحتضنة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد 24 h الحضانة، تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا قد تعلق بشكل صحيح وليس هناك تسرب بين عشية وضحاها.
  6. بعد 48 ساعة من البذر، وإزالة بلطف إدراج باستخدام ملاقط معقمة. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن طبقة الخلية لا تزال دون عائق (اليوم 0).
  7. إزالة المتوسطة من طبق الخلايا العصبية وإضافة 1 مل من وسط الخلايا العصبية الطازجة. وبالمثل، قم بإزالة المتوسطة من طبق الخلية الانجيلية التشعبية وإضافة 1 مل من متوسطة الخلية الانبذيلية التشعبية التشعبية التشعبية.
    ملاحظة: خصص عددًا مطلوبًا من الأطباق وأصلحها باستخدام 4٪ PFA لصور اليوم 0.
  8. الخلايا المحتضنة لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد 5 أيام، وإزالة المتوسطة، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة، وغسل 3x مع 1x PBS.
  9. الخلايا العصبية وصمة عار مع المضادة للإنسان β-Tubulin أو المضادة للجسم المضاد MAP2 الإنسان، والخلايا الأنبوبيلية مع الأجسام المضادة CD31 المضادة للإنسان. في نهاية المناعة، إضافة 1 مل من antifade تصاعد المتوسطة لكل طبق.

7. الثقافة المشتركة الهجرة الوزراء

  1. شارك في تعليق 3 × 104 GABAergic interneurons و 3 × 104 الخلايا البُاقة التشعبية التشعبية التشعبية في 70 ميكرولتر من الوسط الثقافة المشتركة (50٪ متوسطة صيانة عمودي دون GABA و 50٪ وسط الخلايا العصبية). قم ببذر محلول الخلية هذا داخل حجرة الإدراج بشكل جيد. إعداد عدد مناسب من مثل هذه الأطباق.
    ملاحظة: لم يتم إضافة GABA في الوسط الثقافة المشتركة لاستبعاد تأثير GABA الخارجية على الهجرة.
  2. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا لا تتسرب من حجرة الإدراج.
  3. إضافة ببطء 1 مل من الوسط الثقافة المشتركة على طول جانب الطبق لمنع الطلاء من التجفيف.
    ملاحظة: أضف متوسط ببطء على طول حافة الطبق بحيث لا يتم إزعاج الإدراج.
  4. كتحكم أول، البذور 3 × 104 الخلايا العصبية المشتركة GABAergic الإنسان فقط في 70 ميكرولتر من الوسط الثقافة المشتركة لكل إدراج بئر واحد. إعداد عدد مناسب من هذه الأطباق.
  5. كتحكم ثان، البذور المشتركة 3 × 104 GABAergic interneurons الإنسان مع 3 × 104 الخلايا البُنائية البشرية في 70 ميكرولتر من وسط الثقافة المشتركة لكل إدراج بئر واحد. إعداد عدد مناسب من الأطباق.
  6. احتضان الأطباق لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون2. بعد 24 h الحضانة، تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا قد تعلق بشكل صحيح وليس هناك تسرب.
  7. بعد 48 ساعة من البذر، وإزالة بلطف إدراج باستخدام ملاقط معقمة. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم اضطراب طبقة الخلية (اليوم 0).
  8. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من وسيطة الثقافة المشتركة الطازجة.
    ملاحظة: خصص عددًا مناسبًا من الأطباق للحصول على صور اليوم 0.
  9. الخلايا المحتضنة لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  10. بعد 5 أيام، وإزالة المتوسطة، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة، وغسل 3x مع 1x PBS.
  11. وصمة عار مع المضادة للإنسان β-Tubulin أو المضادة للجسم المضاد MAP2 الإنسان لتسمية الخلايا العصبية. في نهاية المناعة، إضافة 1 مل من antifade تصاعد المتوسطة لكل طبق.

8. الكيماوي جاذبية الجاذبية الاسهة

  1. ضع ثلاثة آبار إدراج الثقافة في وسط بولي-L-ornithine/laminin المغلفة 35 ملم طبق باستخدام ملاقط معقمة.
  2. قلب الطبق رأسا على عقب. ضع علامة على الحدود حول المقصورة الوسطى للإدراج باستخدام علامة سوداء دائمة مع طرف دقيق للغاية.
  3. البذور 3 × 104 الخلايا العصبية GABAergic الإنسان في المقصورة الوسطى في 70 ميكرولتر من المتوسطة العصبية(الشكل 3A).
  4. البذور 104 الإنسان الخلايا البُاذيلية في 70 ميكرولتر من متوسطة الخلية البُاذيلية التشعبية العمودية و104 خلايا البُنبطية في 70 ميكرولتر من وسط الخلايا البُنذيلية المُتحكم به في المقصورتين الخارجيتين على التوالي(الشكل 3A).
  5. إضافة 1 مل من الوسط الثقافة المشتركة (50٪ متوسطة صيانة عمودي دون GABA و 50٪ وسط الخلايا العصبية) على طول جانب الطبق لمنع الطلاء على الطبق من التجفيف.
  6. تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا لا تتسرب من حجرة الإدراج.
  7. الخلايا المحتضنة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد 24 h الحضانة، تحقق تحت المجهر للتحقق من أن الخلايا قد تعلق بشكل صحيح وليس هناك تسرب.
  8. بعد 48 ساعة من البذر، وإزالة بلطف إدراج باستخدام ملاقط معقمة. تحقق تحت المجهر للتحقق من عدم اضطراب طبقة الخلية (اليوم 0).
  9. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من وسيطة الثقافة المشتركة الطازجة.
    ملاحظة: خصص العدد المطلوب من الأطباق لصور اليوم 0.
  10. الخلايا المحتضنة لمدة 36 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد 36 ساعة، تستنشق المتوسطة، وإصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 10 دقيقة، وغسل 3x مع 1x PBS.
  11. بقعة الخلايا العصبية المشتركة GABAergic الإنسان مع المضادة للإنسان β-Tubulin أو المضادة للجسم المضاد MAP2 الإنسان. في نهاية إجراء تلطيخ، إضافة 1 مل من antifade تصاعد المتوسطة في كل طبق.

9- التصوير وتحليل البيانات

  1. ضع طبق الاطباق الملطخ بالمناعة تحت المجهر عند التكبير 4X.
  2. احتفظ بحافة طويلة واحدة من الحدود المستطيلة (مصنوعة في الخطوة 5.10 أعلاه) في مجال الرؤية. التقاط صور للخلايا في المساحة الخالية من الخلايا المجاورة لتلك الحدود. الحصول على الصور على طول الحافة اليمنى الطويلة والحافة الطويلة اليسرى للحدود المستطيلة(الشكل 2B).
    ملاحظة: لا تعتبر الخلايا المتمركزة قطرياً فيما يتعلق بالمستطيل بسبب الغموض في تحديد الحافة القصيرة أو الطويلة كعلامة بداية. أيضا، أعداد الخلايا المهاجرة عبر الحافة القصيرة غالباً ما تكون أقل بكثير (ربما بسبب عدد أقل من الخلايا بدءاً على طول الحافة القصيرة) ولا تعتبر.
  3. افتح الصور في ImageJ. احسب المسافة بين كل خلية وعلامة الحدود(الشكل 2D)باستخدام ImageJ.
  4. لتقييم الترحيل من حيث أرقام الخلايا، قم بتعيين مسافة محددة من الحدود في الصورة المكتسبة في ImageJ. عد عدد الخلايا الموجودة ضمن هذه المسافة. حساب متوسط الرقم والانحراف المعياري والأهمية الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عرض خطوات إعداد إدراج ثقافة بئر واحد داخل طبق 35 مم في الشكل 1. استخدام إجراء الهجرة لمسافات طويلة وزراعة المشاركة في نقل الثقافة إدراج بئر واحد لبذر العدد المطلوب من الخلايا في وسط طبق بولي-L-ornithine/laminin المغلفة 35 ملم. في اليوم 0، كانت الخلايا موجودة كرقعة مستطيلة(الشكل 2A, C). في اليوم 0 الصور، يمكن التعرف على سطر يوم 0 بسهولة من قبل الحافة الحادة للطبقة الخلية (خط منقط أبيض في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، وصفنا ثلاثة في المختبر ومقالات التي توفر معا التقييم الكمي للخصائص البطانية الانجيلية الكلية البشرية. هذه التحليلات ستكون ذات قيمة في اكتساب رؤى ميكانيكية في تفاعل الخلايا الفيوثيلية التشعبية التبصرية البشرية مع الخلايا العصبية البشرية. التجارب باستخدام ligands، مثبطات، أو الخلايا مع ضربة قاضية خاصة بالجينات أو الإفراط في التعبير تحديد أو التحقق من صحة اللاعبين الجزيئية التي تتوسط الهجرة الخلايا الدودية الموجهة بين الخلايا العصبية أو خصائص الهجرة لمسافات طويلة من الخلايا البُلية المحيطية. ويمكن أيضا تعديل هذه المقال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال جوائز من المعهد الوطني للصحة العقلية (R01MH110438) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (R01NS100808) إلى AV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول تفكك AccutaseMillipore SigmaSCR005محلول تفكك الخلايا (للخلايا البطانية حول البطينين ، الخطوة 1.4)
الأجسام المضادة للإنسان بيتا توبولينBiolegend802001
الجسم المضاد CD31 المضاد للإنسانMillipore SigmaCBL468
الأجسام المضادة MAP2المضادة لعلم الأعصابCH22103
الأجسام المضادة المضادة ل Caspase 3Millipore SigmaAB3623
التحكم في الخلايا البطانية البشريةالديناميكيات الخلويةR1022
التحكم في الخلايا البطانية المكملات الغذائية المتوسطةالديناميكيات الخلويةM1019
قوارير مبردةفيشر ساينتفيك03-337-7Y
DMEMF / 12 متوسطThermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 متوسطالرصيد الحراري A1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
FibronectinThermofisher Scientific33016-015
حاوية التجميدThermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
مقياس الدمسيجما ألدريتشZ359629
الخلايا العصبية البشرية GABAergicالديناميكيات الخلويةR1013
الخلايا العصبية البشرية GABAergic قاعدةمتوسطة الديناميكيات الخلويةM1010
الإنسان GABAergic الخلايا العصبية التكمل العصبيالديناميكيات الخلويةM1032
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning356230مصفوفة غشاء القاعدة
تصاعد مختبرات ناقلات متوسطةH-1200
بولي L-ornithinSigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
Trypan BlueThermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher حلتفكك الخلايا العلمية 12563011 (للخلايا العصبية الداخلية GABAergic والخلايا البطانية ، القسمين 3 و 4)
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF مجموعة كاملة متوسطةLifeline Cell TechnologiesLL-0003مكون التحكم في الخلية البطانية البشرية المتوسطة
2 بئر ثقافة السيليكون- إدراجibidi80209
3 آبار سيليكون ثقافة-إدراجطبق Ibidi80369
طبق 35 ممكورنينج430165
أنبوب مخروطي 15 ملفيشر ساينتفيك07-200-886
محلول PFA 4٪فيشر ساينتفيكAAJ19943K2
لوحة زراعة الأنسجة 6 آبارفيشر ساينتفيك14-832-11
مجهر تباين الطورالمقلوب زايسمجهر الفلورسنت Zeiss Axiovert 40C
أوليمبوسFSX-100
المضادة

المراجع

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149(2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356(2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.