مقالة منهجية

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

20.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60316

⸱

مارس 20, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Mechanism Section, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute at Frederick, 2Small Animal Imaging Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research, Leidos Biomedical Research, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

هذا العمل المسبقة بروتوكول متقدم لتقييم دقيق تحميل الورم عن طريق الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر وإشارات الإضاءة الحيوية، فضلا عن التكامل بين تقنية الكشف الجزيئي الكمي.

الملخص

سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) هو نوع فرعي من سرطان الثدي العدوانية مع خيارات علاجية محدودة. بالمقارنة مع المرضى الذين يعانون من أورام الثدي أقل عدوانية, معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات من مرضى TNBC هو 77% بسبب النمط الظاهري المقاوم للأدوية المميزة وعبء النقيلي. وتحقيقا لهذه الغاية، تم إنشاء نماذج المورين تهدف إلى تحديد استراتيجيات علاجية جديدة تحد من نمو ورم TNBC وانتشار النقيلي. يصف هذا العمل دليلًا عمليًا لنموذج تقويم العظام TNBC حيث يتم زرع خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 المعلقة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي في وسادة الدهون الثديية الرابعة ، والتي تحاكي عن كثب سلوك الخلايا السرطانية في البشر. يتم مناقشة قياس الأورام عن طريق الفرجار ، وتقييم الانبثاث الرئوي عبر في الجسم الحي والتصوير الحي السابق ، والكشف الجزيئي. يوفر هذا النموذج منصة ممتازة لدراسة الفعالية العلاجية ومناسب بشكل خاص لدراسة التفاعل بين الورم الأساسي والمواقع النقيلية المنقبة.

المقدمة

سوف تصاب واحدة من كل ثماني نساء تقريباً في الولايات المتحدة بسرطان الثدي الغازي خلال حياتها، وسيتم تشخيص 10%-20% من هؤلاء النساء بنوع سرطان الثدي السلبي العدواني (TNBC). في حين يمكن إزالة الآفات الأولية جراحيًا في معظم الحالات ، فإن التنابث دون السريري والمقاومة الكيميائية يجعلانه مرضًا مستعصيًا. الأهم من ذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من TNBC النقيلي ينتكسون في نهاية المطاف، حتى لو خضعوا للعلاج في المرحلة المبكرة1. وبالتالي، فإن عدم تجانس السرطان، والانبثاث المجهري، والمقاومة العلاجية هي ثلاثة تحديات رئيسية تحد من النتيجة السريرية الناجحة لمرضى TNBC. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لفهم أفضل للخلفية الجزيئية متعددة الأشكال من TNBC وتطوير عوامل علاجية فعالة تحد من الأمراض النقيلية.

الانبثاث الورم هو عملية متعددة الخطوات حيث تتحكم الخلية السرطانية وتغتصب بيئتها الدقيقة لتعزيز انتشارها الخاص عبر تدهور الأغشية وهروب الخلايا السرطانية من الآفة الأولية ، عن طريق الدخول إلى (أي intravasation) والخروج من (أي المنفرة) الأوعية الدموية ، وفي نهاية المطاف التكيف والاستعمار داخل أسرة الأنسجة المنتفخة2. وقد وضعت نماذج الحيوان لدراسة سرطان الثدي الانبثاث، حيث يتم تنفيذ منهجيتين عادة: الحقن المباشر للدورة الدموية وزرع تقويم الأسنان. طرق شائعة الاستخدام لحقن الدورة الدموية المباشرة تشمل حقن الوريد الذيل, في حين أن النهج الأخرى بما في ذلك حقن القلب المباشر3,حقن الدماغ المباشر4,وحقن الكبد المباشر5 كما تم استخدامها. غالبًا ما يشار إلى حقن الدورة الدموية المباشرة على أنها نموذج انبثاث اصطناعي ، وهو سريع وسهل ولكنه أقل دقة من الناحية الفسيولوجية لأنه يتحايل على هروب الورم من الآفة الأولية والعضم اللاف6،7،8. بالمقارنة مع نماذج الحقن المباشر ، يستغرق نموذج سرطان الثدي التقويمي وقتًا أطول لحدوث آفات النقيلية يمكن اكتشافها في الأعضاء النائية مثل الرئة ، ولكنه أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لأنه يحاكي عن كثب عملية النقيلي المتعددة الخطوات كما يحدث في البشر. الأهم من ذلك، قارنت دراسةأجريت عام 2013 حقن ووين الذيل ونماذج تقويم الأسنان ووجدت أن خلايا سرطان الثدي حقنت في الوريد الذيل وتلك المعزولة من الآفات النقيلية الرئة بعد حقن الوريد الذيل أظهرت ملامح التعبير الجيني العالمية مماثلة. في المقابل، كان الملف العالمي للتعبير الجيني لخلايا سرطان الثدي التي حقنت بتقويم موضعي مختلفة بشكل كبير عن تلك التي من الآفات النقيلي الرئة الناشئة عن الخلايا حقن تتقويم موضعي9. تشير هذه الملاحظات إلى أن نموذج تقويم الأسنان أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ، لأن الآفات النقيلية تخضع لعملية اختيار مماثلة لعملية الانبثاث المتعددة الخطوات كما يحدث في البشر.

يصف هذا العمل نموذج سرطان الثدي التقويمي (MDA-MB-231-Luc/GFP) في الفئران العارية التي تم تحسينها في مختبرنا لتقنيات الكشف عن التصوير وكذلك تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة وتطوير عوامل العلاج الكيميائي المستهدفة.

البروتوكول

تم إجراء تحليل لنمو الورم باستخدام بروتوكولات وافقت عليها لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة للمعهد الوطني للسرطان والتزمت بتوصيات مجلس البحوث الوطني للولايات المتحدة "دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية"، "دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" التابع لدائرة الصحة العامة في الولايات المتحدة، و"سياسة الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية".

1. إعداد الخلايا لزرع

ملاحظة: MDA-MB-231 خلايا غدي الثدي البشري (المكتسبة تجاريا) تم نقلها بشكل ثابت مع الجين لوسيفيراز الثالث وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (GFP) علامة بواسطة الفيروس lentivirus ونمت في وجود اختيار المضادات الحيوية (puromycin) .

  1. ابدأ استزراع الخلية بخلايا 1 × 106 MDA-MB-231-Luc/GFP وأضف 15 مل من الدفء المسبق (37 درجة مئوية) RPMI 1640 متوسطة مع مصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) في قارورة ثقافة T75. الحفاظ على الخلايا تنمو في حاضنة ثقافة الخلايا التي تسيطر عليها درجة الحرارة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استبدل المتوسط الكامل على الأقل 2x في الأسبوع.
    ملاحظة: لا تزعج نمو الخلية والحفاظ على التحقق من ظروف نمو الخلية يومياً. يجب أن تكون الخلايا تحت الثقافة عندما تصل إلى التقاء 85%-90% للحفاظ على مرحلة الانتشار.
  2. قبل أسبوع واحد من خطوة زرع الخلية، وإزالة puromycin من قارورة ثقافة الخلية عن طريق إزالة أولا كل المتوسطة في قارورة الثقافة، ثم الرص 2x مع 10 مل من 1x الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS)، وأخيرا استبدال المتوسطة مع المتوسطة كاملة بدون البوروماشين. أثناء الخطوات المتوسطة المضافة والرصانة، لا تزعج الخلايا. تذكر عدم استخدام وسيلة كاملة مع اختيار المضادات الحيوية من الآن فصاعدا لجميع الخطوات المتوسطة تجديد.
  3. في يوم إعداد الخلايا للزرع ، قم بإزالة جميع الوسائط الكاملة قبل التبذير لتجنب تعطيل التربسين. إضافة 5 مل من التربسين إلى قارورة لtrypsinize الخلايا. مراقبة الخلايا والتحقق من أنها تنفصل عن قارورة الثقافة.
  4. بمجرد فصل غالبية الخلايا، أضف 10 مل من المتوسط الكامل لتحييد نشاط التربسين. بعد ذلك، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وطارد مركزي بـ 50 مل وطارد ة مركزية في ~ 150 × ز لبيليه الخلايا. إزالة supernatant بعد الطرد المركزي ومن ثم إضافة 10 مل من 1x PBS لإعادة تعليق الخلايا والاستعداد لحساب الخلايا.
  5. عد الخلايا مع عداد الخلية وضبط تركيز الخلية إلى 20 × 106 خلايا / مل في الباردة 1x PBS تحتوي على 25٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي. حقن 2 × 106 خلايا في 0.1 مل 1x PBS مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي 25٪ في وسادة الدهون الثديية الرابعة من كل فأرة. جلب الإبر والمحاقن إضافية لزرع الخلية والحفاظ على خلية الطابق السفلي غشاء- مزيج مصفوفة على الجليد قبل الزرع.
    ملاحظة: هناك مساحة ميتة في الحقنة والإبرة. اعتمادا على اختيار طول الإبرة والحقنة، ونوع، وحجم، حقنة الدرنة مع 0.5 في 26 G إبرة يمكن أن يكون ما يصل إلى 70 ميكرولتر الفضاء الميت10. قم بإعداد مزيج زرع خلايا أكثر بنسبة 40%-50% للتعويض عن المساحة الميتة وأي خسارة عرضية أخرى.

2. نموذج سرطان الثدي التقويمي وقياس حجم الورم

  1. السماح للفئران العارية الإناث 6 أسابيع من العمر للتأقلم مع مرفق الإسكان لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل زرع الخلية.
    ملاحظة: استخدام نفس العمر الفئران سوف يقلل من تباين البيانات.
  2. لكل جولة، تخدير خمسة فئران مع isoflurane بنسبة 4٪ مع الهواء المصفاة (0.2 ميكرومتر) بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة لمدة 3-4 دقيقة. انتبه إلى معدل تنفسية الماوس وتغيير النمط، واستخدام قرصة إصبع القدم لضمان أن الفئران تحت التخدير السليم. بمجرد أن لا تتحرك، وإزالة فأرة واحدة ووضع مخروط الأنف على أنفه وفمه مع نفس التخدير.
  3. مسحة اليسار 4الغدة الثديية مع الكحول. باستخدام ملقط الأسنان الفئران غرامة، ورفع الغدةالثديية 4 قليلا لإدراج إبرة 25 G. تأكد من أن الإبرة شطبت ثم سحب قليلا المكبس للتأكد من الإبرة لا تصل إلى أي الأوعية الدموية. إذا لم يدخل الدم إلى الحقنة، استمر في حقن 100 ميكرولتر ببطء من مزيج مصفوفة الخلايا والغشاء في وسادة الدهون الثديية.
    ملاحظة: ستظهر منطقة مستديرة مرفوعة تحت الجلد.
  4. انتظر 10−15 ق حتى تصلب مصفوفة غشاء الطابق السفلي، ثم قم بإزالة الإبرة. كرر العملية مع الفئران المتبقية في غرفة التعريفي. ضع جميع الإبر والمحاقن المستخدمة في صندوق حاد.
  5. استخدام نفس موقع حقن الغدة الثديية لجميع الفئران. راقب موقع الحقن عن كثب ولاحظ أي مزيج زرع خلية يتسرب من موقع الحقن.
    ملاحظة: في غضون بضع دقائق، سيبدأ الماوس لاستعادة الوعي.
  6. السماح xenograft تنمو بحرية دون أي انقطاع لمدة 7-10 أيام قبل أي قياس حجم الورم.
  7. فحص جميع الفئران لحجم xenograft. قياس حجم الورم مع الفرجار. تحديد حجم الورم (مم3)مع المعادلة التالية:

    figure-protocol-1

    حيث L هو البعد الأطول وW هو أقصر بعد عمودي على L.
  8. تحديد وإزالة القيم المتطرفة التي تتجاوز انحرافمعياري واحد للمتوسط. استخدم الفئران فقط ذات أحجام الأورام المماثلة للتجارب. تقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعات العلاج المختلفة والبدء في العلاجات.
  9. قياس حجم الورم بواسطة الفرجار 2x في الأسبوع. إبقاء علما بجميع التغيرات المادية من xenografts (أي النخر ، التمزق).

3. في الإضاءة العضوية العضوية والجسم الحي على ما بعد التصوير الفلوري

ملاحظة: في هذه الدراسة، يتم إجراء كل من الإضاءة الحيوية ثنائية الأبعاد والتصوير الفلوري عند نقطة نهاية التجربة. تم إجراء التصوير الحيوي (BLI) باستخدام ماسح ضوئي تجاري قبل السريري مجهز بكاميرا CCD مبردة 16 بت ومرحلة تصوير ساخنة.

  1. قبل التصوير، قم بتخدير ما يصل إلى خمسة فئران حاملة للورم في غرفة الحث عن طريق وضع إيزوفران بنسبة 3٪ مع الهواء المصفاة (0.2 ميكرومتر) بمعدل تدفق 1 لتر /دقيقة لمدة 3-4 دقائق. حدد التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. تأكد من أن يتم الاحتفاظ بغرفة التعريف داخل غطاء محرك السيارة المفطّط لتقليل تعرض الموظفين للإيزوفيوران.
  2. إدارة D-لوسيفيرين (150 ملغ/كغ) إلى الفئران التي تم حقنها عن طريق طريق داخل البيريتونال باستخدام إبرة 27 G، ونقل فأرة مستحدثة إلى غرفة التصوير. في غرفة التصوير الضوئي، حافظ على الإيزوفدراني بنسبة 2%-2.5% مع O2 كحامل بمعدل تدفق قدره لتر واحد/دقيقة.
    ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس في ~ 37 درجة مئوية أثناء الإجراء عن طريق الحفاظ على وسادة ساخنة تحت غرفة التعريفي التخدير، طاولة التصوير (إذا لم يتم تسخين المرحلة)، وقفص الاسترداد بعد الإجراء.
  3. قبل تصوير الفئران الدراسة، والحصول على حركية لوسيفيرين عن طريق التصوير ثلاثة فئران إضافية تحمل الورم (الحيوانات لم يتم تعيينها إلى أي مجموعات الدراسة) في 2 فترات دقيقة لما مجموعه 40 دقيقة باستخدام المعلمات التالية باستخدام المعلمات التالية: الإثارة مرشح المحظورة، الانبعاثات مرشح مفتوح، f/stop 1، FOV-D، منتصف binning (8 × 8)، والتعرض للسيارات. استخدم إشارة ذروة الإضاءة الحيوية التي تم قياسها لتحديد الإطار الزمني الأمثل للحصول على الصورة لجميع النقاط الزمنية اللاحقة.
  4. أثناء إجراء تصوير الانبثاث ، قم بحماية إشارة BLI العالية من الورم الأساسي من خلال تغطيتها بأكمام مقطوعة من قفاز أسود. الحصول على الصورة باستخدام نفس المعلمات الموضحة في الخطوة 3.3 مع الجانب البطني من الماوس التي تواجه الكاميرا لتصوير الرئة الانبثاث والجانب الظهري من الماوس التي تواجه الكاميرا لتصوير الانبثاث في الدماغ.
    ملاحظة: من الضروري اختبار عدد قليل من العلامات التجارية المختلفة من القفازات السوداء لاختيار واحد مع الحد الأدنى من اللألوة التلقائية.
  5. باستخدام الماسح الضوئي وبرنامج تحليل البيانات، رسم منطقة الشكل القياسي من الفائدة (ROI) على تجويف الصدر أو الدماغ ضمان أن يتم تغطية الجهاز كله من الفائدة لتقييم العبء النقيلي. قياس حجم الإضاءة الحيوية (BL) الناتج كتدفق إجمالي (فوتونز/ثانية).
  6. مباشرة بعد BLI، القتل الرحيم الماوس عن طريق الاختناق CO2 (وفقا للمبادئ التوجيهية ACUC وبروتوكولات الحيوان المعتمدة من المؤسسة) واستخراج الرئة والدماغ مع تشريح مقص وملقط لتصوير الجسم الحي السابق.
    ملاحظة: لا يمكن إجراء الرئة المستخرجة للتصوير بالجسم الحي السابق وتعداد عقيدات الانبثاث الرئوي على نفس الماوس بسبب الإجراءات غير المتوافقة.
  7. شطف بسرعة جميع الأجهزة مع 1x PBS لإزالة أي بقع الدم السطحية ووضع الأجهزة على انخفاض الفلورات، لوحة بلاستيكية سوداء. نقل الأجهزة إلى ماسح ضوئي متعدد الأطياف الفلورية مجهزة قدرة عدم الخلط الطيفية (ضبط الطول الموجي الكريستالي السائل في الحالة الصلبة) مع كاميرا CCD 12 بت للكشف عن GFP.
  8. الحصول على صور GFP متعددة الأطياف (مرشح الإثارة = 457 ± 23 نانومتر؛ مرشح الانبعاثات = 490 نانومتر تمرير طويل) من الأجهزة المستخرجة والفئران التحكم في تحمل الأورام عن طريق المسح الضوئي من خلال 500-720 نانومتر في حجم خطوة 10 نانومتر. استخدام الأجهزة المكوس من الفئران التحكم تحمل الورم غير لتصحيح لautofluorescence.
  9. بعد التصوير GFP متعدد الأطياف، حدد إعدادات التصوير المثلى. إجراء الحصول على صورة لجميع الأجهزة المستهدفة وإجراء تحليل الصور (أي إنشاء مكتبة طيفية للفلور الفلورية وGFP لإجراء إلغاء الخلط الطيفي) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

4. الكشف الجزيئي لخلايا سرطان الثدي النقيلي

  1. بعد التصوير الحي السابق، المفاجئة تجميد الدماغ كله في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية في الثلاجة حتى تكون جاهزة لاستخراج الحمض النووي.
  2. لاستخراج الحمض النووي، وضع الدماغ كله في أنبوب تجانس 5 مل مع 2 مل من الحمض النووي lysis المخزن المؤقت. استخدام المتجانس مع إعداد السلطة في 50 لتجانس أنسجة الدماغ كله المفاجئة المجمدة. بمجرد تجانس أنسجة الدماغ تمامًا ، قم بنقل تعليق 1 مل (lysate) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خالٍ من DNase وخالي من RNase و2 مل ويستمر في عزل الحمض النووي وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتقليل التلوث الحمض النووي المحمول، تنظيف شامل المتجانس بعد كل عينة عن طريق شطف الأولى مع الإيثانول 75٪ في المياه الخالية من DNase وRNase خالية، ثم الشطف مع 1 M NaOH الحل، تليها شطف مع 75٪ الإيثانول في DNase خالية و RNase خالية من المياه للحد بشكل فعال وتدمير أي بقايا الحمض النووي.
  3. إضافة 0.5 مل من الإيثانول 100٪ من الحمض النووي العازلة تحليل إلى lysate. مزيج عينة عن طريق الانعكاس وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقيقة.
    ملاحظة: لا عكس مرات عديدة أو بقوة جداً. الحمض النووي سيكون مرئياً كعجل يشبه الصوف
  4. استخدم طرف ماصة لنقل الحمض النووي إلى أنبوب طرد مركزي صغير طازج خالٍ من DNase وخالي من RNase و2 مل. دع العينة يجف ّ الهواء لمدة دقيقة واحدة. أضف 1 مل 75% إيثانول ونقلب أنبوب الطرد المركزي الدقيق 3−6x لغسل عينة الحمض النووي. تخلص من الإيثانول بعد كل غسل عن طريق الأنابيب. كرر خطوة الغسيل 2x.
  5. الهواء يجفف عينة الحمض النووي لمدة 10 s. ثم أضف 52 ميكرولتر من 8 mM NaOH لإذابة عينة الحمض النووي. Pipet 2 μL من عينة الحمض النووي لكمية الحمض النووي، واستخدام 50 ميكرولتر المتبقية للحصول على فحص PCR في الوقت الحقيقي بعد تعديل التركيز.
    ملاحظة: NaOH يساعد على solubilize تماما عينة الحمض النووي.
  6. كمية 2 ميكرولتر من كل عينة من الحمض النووي مع مطياف واستخدام نسبة امتصاص بين A260/280 كمرجع فحص الجودة. حساب تركيز الحمض النووي مع هذه الصيغة:

    figure-protocol-2
  7. ضبط تركيز الحمض النووي إلى 50 نانوغرام/ميكرولتر. لكل عينة من الحمض النووي، استخدم 50 نانوغرام من الحمض النووي كقالب بداية للفحص PCR في الوقت الحقيقي. استخدم محلول NaOH 8 mM أو المياه الخالية من DNase وخالية من RNase لتخفيف عينة الحمض النووي.
  8. تصميم زوج التمهيدي محددة لخارجية بروتين الفلورسينس الأخضر (GFP) تسلسل في المنزل باستخدام بوابة ويب تصميم التمهيدي مفتوحة المصدر للكشف PCR في الوقت الحقيقي من علامة GFP في الخلايا النقيليالتي غزت والمواقع القاصية المستعمرة.
    ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة F: 5'-AGAACGGCATCAAGGAGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'.
  9. استخدم كاشف PCR سريع في الوقت الحقيقي وآلة PCR في الوقت الحقيقي تدعم بروتوكول PCR سريع في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الخطوات العادية 30 دورة تضخيم، إضافة خطوة منحنى التفكك إلى نهاية المدى للكشف عن أي تضخيم غير محدد.
    ملاحظة: تم استخدام الشروط التالية للكشف الجزيئي: 95 درجة مئوية 2 دقيقة بداية ساخنة، 40 دورات من 95 درجة مئوية 5 s، 60 درجة مئوية 15 s، وأخيرا تحليل منحنى ذوبان. أمبيريلنج GFP هو 135 نقطة في الحجم.
  10. استخدام الحمض النووي الدماغ الماوس ساذجة (وليس زرع خلية MDA-MB-231) كعنصر تحكم سلبي. استخدم الحمض النووي المستخرج من خلايا MDA-MB-231-GFP/Luc كتحكم إيجابي. إضافة كافة الكواشف PCR دون أي قالب الحمض النووي كعنصر تحكم قالب أي (NTC).
    ملاحظة: هناك حاجة إلى عنصر تحكم PCR لكل نسخة من PCR.

5. الكشف عن خلايا سرطان الثدي النقيلي في الرئة

  1. بالنسبة للمجموعة الفرعية للفئران التي تم اختيارها لحساب عقيدات الرئة النقيلية ، قم برعاية الفئران مع الإيزوفلوران (كما هو الحال في الخطوة 2.2) مباشرة بعد التصوير بالجسم الحي السابق ، قم بإجراء ثقب قلبي لجمع الدم ، ثم القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. فتح تجويف الصدر مع تشريح مقص وقطع الماضي القلب والغدة الصعترية لفضح القصبة الهوائية.
  3. أدخل حقنة 10 مل مع إبرة 22 G تحتوي على محلول بوين في القصبة الهوائية. دفع المكبس حقنة حتى الرئتين المنهارة منتفخة مع ~ 2 مل من محلول بوين. إزالة الحقنة والإبرة مرة واحدة تم تضخيم الرئتين.
  4. ضع الرئة بأكملها في أنبوب 15 مل يحتوي على محلول Bouin ، وعكس الأنبوب بلطف عدة مرات ، واسمح بنقعه لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد 24 ساعة، قم بإزالة محلول بوين من الأنبوب، وشطف الرئة بالماء، ثم ضعها مرة أخرى في الأنبوب مع الإيثانول بنسبة 70٪. عد الانبثاث (بقع بيضاء أو عقيدات) على أسطح الرئتين باستخدام المجهر تشريح.

6 - جمع البيانات وتحليلها

  1. سجل بيانات حجم الورم، وكذلك في بيانات التصوير الحي والجسم الحي السابق، على جدول بيانات إلكتروني لتسهيل إدخال البيانات وجمعها وإدارتها.
  2. وفي نهاية التجربة، نقل جميع البيانات إلى جدول البيانات الإلكتروني والبرمجيات الإحصائية لرسم البيانات والتحليلات الإحصائية.

النتائج

قياس حجم الورم عن طريق الفرجار هو طريقة راسخة لتقييم فعالية العلاج(الشكل 1). عدد الخلايا المزروعة، واستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي، الميكروبيوم، نظافة المرفق، وموقع الحقن هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على معدل نمو الورم.

على عكس تصوير GFP ، اشترط BLI إدارة ركيزة لوسيفيراز على الأقل 15-20 دقيقة قبل التصوير بـ BLI. وعلاوة على ذلك، فإن سلالة الماوس، وخط الخلية، والعلاجات، ومراسل luciferase تؤثر جميعها على مستويات إشارة الإضاءة الحيوية. وبالتالي ، للحصول على إشارات قابلة للمقارنة بين مجموعات الدراسة ، يجب إجراء دراسة حركية قبل التصوير بتقنية BLI لتحديد أفضل إطار زمني للتصوير(الشكل 2).

بسبب نسبة الإشارة إلى الخلفية المتفوقة26،27، كان الجسم كله في التصوير الحيوي الحيوي حساسًا جدًا في اكتشاف إشارة الانبثاث منخفضة المستوى مقارنة بنهج GFP(الشكل 3). وعلاوة على ذلك، وفرت إشارة الإضاءة الحيوية اختراقاً أعمق من GFP ببضعة ملليمترات. ومع ذلك ، يتطلب إنتاج إشارة الإضاءة الحيوية ATP ، وهو عامل يحد من تقييم عينات أنسجة الجسم الحي. إذا تمت معالجة الحيوانات بسرعة ، فيمكن أن يكون BLI نهجًا قابلًا للتطبيق للحصول على نتائج كمية على الانبثاث. إحدى الطرق لتحقيق ذلك هي عن طريق معالجة أحد الحيوانات في وقت واحد. ومع ذلك ، لم يكن هذا النهج ممكنًا لهذه الدراسة لأنه تم استخدام مجموعة كبيرة من الفئران. لم يتم الكشف عن إشارة BLI عندما تم صورة الأعضاء حوالي 45 دقيقة بعد حقن لوسيفيرين. استخدام خط خلية مراسل مزدوج مفيد في هذه الحالة. نظرًا للطبيعة المستقرة لجزيء GFP ، سيكون لدى الباحثين الوقت الكافي لمعالجة الذبيحة قبل التقاط إشارات GFP من الأعضاء المستهدفة(الشكل 4).

الشكل 5 يقدم مثالا ً حقيقياً على كيف يمكن لقياسات حجم ورم الفرجار أن تشوه تفسير البيانات ، لأن xenograft فقدت معظم محتوى الخلايا السرطانية القابلة للحياة ولكنها حافظت على كتلتها وشكلها الكبيرين. الفحص الهسي لتلك xenografts أشار نخر داخل الكتلة(الشكل 5B).

للباحثين الذين يتحدون نتائج التصوير فيما يتعلق بانبثاث الدماغ في نموذج سرطان الثدي التقويمية، يمكن أن يوفر الكشف الجزيئي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي أدلة مقنعة(الشكل 6). في هذه الحالة، كان تسلسل الحمض النووي GFP الخارجي أفضل طريقة لمعالجة هذه المشكلة، لأن تسلسل الحمض النووي GFP المنقولة غير موجود بشكل طبيعي في البشر أو القوارض.

figure-results-1
الشكل 1: قياس حجم الورم. بدأ قياس حجم الورم/ التحميل بالفرجار في اليوم العاشر بعد زرع xenograft ثم تم قياسه 2x في الأسبوع حتى نهاية التجربة. يتم حساب أشرطة الخطأ حسب قيمة SEM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحديد نافذة الحصول على الصورة المثلى. إلى اليسار: تم اختيار فأرة واحدة مع xenograft كبيرة وفأرة واحدة مع xenograft صغيرة لتحديد النطاق الحركي الأمثل لللوسيفرين. يمين: منحنى لوسيفيرين الحركي الذي تم الحصول عليه عن طريق الحصول على الصور كل 2 دقيقة لمدة 40 دقيقة. ولوحظت هضبة تتراوح بين 15 و22 دقيقة، استخدمت كوقت مثالي لاقتناء الصور لجميع عمليات التصوير اللاحقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الجسم كله التصوير BLI. L: الجسم كله التصوير BLI. م: عرض Ventral مع الجزء السفلي من الجسم مغطى بأكمام من قفاز أسود. R: عرض دورسال مع الجزء السفلي من الجسم مغطاة بأكمام من قفاز أسود. يتم الكشف عن انبثاث العقدة الليمفاوية الإبطية في طريقة العرض البطنية عن طريق التصوير BLI. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: Ex vivo BLI/GFP الكشف عن إشارة. تم الكشف عن إشارات GFP في الدماغ والرئة من نفس الماوس 20 دقيقة بعد التضحية بالماوس. لم يتم الكشف عن إشارة BLI 45 دقيقة آخر حقن لوسيفيرين. لم يتم الكشف عن إشارة GFP في دماغ الماوس الساذج والرئة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: مزايا تقنيات التصوير البصري على قياسات الفرجار. (أ)صورة تمثيلية تظهر في الكشف عن إشارة الجسم الفيفو GFP في الورم الأساسي. فقط جزء بسيط من xenograft أظهرت إشارة GFP، مما يشير إلى أن جزءا كبيرا من الكتلة كان ستروما. ولا يمكن تحديد ذلك بقياسات الفرجار التقليدية ويمكن أن يؤدي إلى استنتاج غير دقيق. يسلط هذا المثال الضوء على أهمية التصوير البصري لدراسة النموذج الحيواني. (ب)قسم علم الأمراض الهيستوفيولوجيا من نفس الماوس تبين أن المنطقة النخرية (أي المنطقة الداخلية) ساهمت أيضا في حساب حجم الورم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تحليل منحنى الذوبان. مؤامرة منحنى تذوب تبين خصوصية amplicons GFP. الحمض النووي من الدماغ التي تم الحصول عليها من الفئران MDA-MB-MB-231-Luc/GFP المزروعة والحمض النووي المعزول عن خلايا MDA-MB-231-Luc/GFP التي نمت في الثقافة (التحكم الإيجابي) كانت منافية. تم إجراء فحص PCR في الوقت الحقيقي لتقييم محتوى GFP في أنسجة الدماغ. (أ، ب) منحنيات ذوبان السيطرة الإيجابية والحمض النووي المستخرج من دماغ الماوس، على التوالي. (C)المنحنيات المتراكبة من الألواح A و B، مما يشير إلى إشارات الذروة من DNAs الدماغ الماوس محددة لتسلسل GFP الخارجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

لدراسة TNBC في الحيوانات، وقد وضعت نموذجين من المورين: الخلايا غدية الثدي الثدي MDA-MB-231 الإنسان في الفئران المحصنة (أي الفئران عارية الأنهيميك، الفئران NSG)، و 4T1 في الفئران BALB / ج المناعة المختصة. كلا النموذجين لها مزاياها. يعتمد اختيار النموذج الحيواني للدراسة على أهداف البحث. على سبيل المثال، نموذج MDA-MB-231 هو خط خلية TNBC الإنسان نمت في الفئران المنقوصة المناعية التي تحاكي مرضى سرطان الثدي البشري المثبطة للمناعة. من ناحية أخرى ، فإن النمط الظاهري الغازي لخلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية 4T1 في الفئران BALB / c يحاكي عن كثب العملية النقيلية كما يحدث في المرحلة الرابعة من مرضى سرطان الثدي البشري. على عكس نهج حقن الخلايا الوريدية، تم حقن خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 على نحو مماثل في وسادة الدهون الثديية11،12 في نموذج سرطان الثدي التقويمي11،13. ويعد نمو الورم والقدرة النقيلي المكتسبة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، وبالتالي فإنه ليس نموذج سرطان النقيلي الاصطناعي4,,14. مثل هذا النموذج الانبثاث التلقائي يحاكي عن كثب تطور سرطان الثدي البشري باستثناء مرحلة البدء. هذا هو نموذج حاسم لفحص المخدرات في الجسم الحي وتقييم الفعالية العلاجية في سرطان الثدي النقيلي.

موقع زرع الورم في الماوس يلعب دورا حاسما في توفير بيئة صغيرة تحافظ على نمو الورم واختيار النمط الظاهري النقيلي مماثلة لتلك التي تحدث في البشر. العقدة الليمفاوية القريبة ووجود الأنسجة الدهنية هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على تطور مرض سرطان الثدي15،16. في المريض البشري ، فإن العقدة الليمفاوية والأنسجة الدهنية كلاهما من العوامل الرئيسية المتفاعلة التي تؤثر على خبيثة وحدوث سرطان الثدي17،18،19. وبالتالي ، فإن اختيار الموقع التشريحي الصحيح لموقع الحقن يمكن أن يؤثر بشكل كبير على أهمية نموذج الورم مقارنة بالمرض البشري. استخدمت هذه الدراسة الغدة الثديية الرابعة كموقع زرع ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى المتطلبات المذكورة أعلاه وأنه من الناحية التشريحية أكثر سهولة وأسهل للتلاعب.

تتوفر طرق مختلفة لحساب حجم الورم، ويمكن للباحث اختيار أي طريقة يراها مناسبة. تستند الخوارزمية المختارة لهذه الدراسة إلى النتائج التي توصل إليها فاوستينو-روشا وآخرون، الذين قارنوا صيغ حساب حجم الورم المختلفة وخلصوا إلى أن الصيغة أدناه هي الأكثر دقة20.

figure-discussion-1

مصفوفة غشاء الطابق السفلي هو مصفوفة غير خلوية هامة تستخدم في مختلف في المختبر21 وفي الجسم الحي22،23 المقالات. هناك تقارير متناقضة22،24،25 بشأن تأثير مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الأورام الخبيثة xenograft. يبدو أن تؤثر فقط على إنشاء الأولية للxenograft وليس لها أي تأثير آخر على نمو xenograft25. لزرع xenograft وصفها، تم خلط مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الخلايا السرطانية لزيادة لزوجة حل الخلية / هلام مزيج قبل الزرع. وجود مصفوفة غشاء الطابق السفلي يقلل من فقدان محلول المزيج من موقع الحقن ويحافظ على محلول المزيج في موقع الزرع ، وبالتالي زيادة توحيد حجم xenograft المزروعة.

خط الخلية MDA-MB-231 هو خط خلية غدي الثدي البشري الخلد الخبيث وهو أداة شعبية في أبحاث سرطان الثدي بسبب حالته الثلاثية السلبية. يسمح استخدام خط الخلية المزدوج (luciferase و GFP) بمزيد من المرونة في التعامل مع التصوير في الجسم الحي والتصوير بالجسم الحي السابق. ومن الثابت أن إشارة الإضاءة الحيوية تمتلك حساسية أكبر، وإمكانية الكشف عن العمق، وتباين فائق (نسبة الإشارة إلى الضوضاء) من إشارات GFP. وبسبب هذا، هو طريقة التصوير المستخدمة على نطاق واسع لتصوير الجسم كله. لسوء الحظ، فإن الكشف عن الإضاءة الحيوية محدود بنافذة زمنية ضيقة (~ 15-20 دقيقة بعد حقن لوسيفيرين) يكون خلالها الكشف عن الإشارة خطيًا. إشارة BLI تتضاءل بسرعة عندما يتم القتل الرحيم للحيوانات. هذا يصبح مسألة تصميم تجريبي إذا كان العديد من الفئران تحتاج إلى القتل الرحيم وحصاد أنسجة متعددة أو أعضاء مطلوب. في هذه الدراسات، تم حصاد الدم عن طريق ثقب القلب المباشر، تم فحص الدماغ والورم الأساسي والرئة والعقدة الليمفاوية المتضررة في 40 الفئران. بحلول الوقت الذي تم حصاد الأعضاء وعلى استعداد للتصوير على سبيل الحمراء، كانت إشارة الإضاءة الحيوية غير قابلة للكشف. لذلك، الكشف عن GFP هو أكثر ملاءمة في هذه الحالات. إن انبعاث إشارة GFP هو في النطاق المرئي ، وعند هذه الأطوال الموجية ، يكون امتصاص الإشارة بسبب الدم (أي الهيموغلوبين) أعلى بكثير. أيضا، autofluorescence في النطاق المرئي بسبب NADH، أصباغ الدهون، وفلافين النتائج في خلفية كبيرة التي تجعل من الصعب التمييز بين إشارة GFP منخفضة المستوى وخلفية autofluorescence. يساعد استخدام نهج تصوير الفلورسينس متعدد الأطياف بدلاً من التصوير التقليدي لزوج الفلتر واستخدام خوارزميات فك الخلط الطيفية على تحديد إشارة GFP الحقيقية في العضو موضع الاهتمام. وبالتالي ، من خلال الجمع بين نقاط القوة من التصوير الإضاءة الحيوية في الجسم كله في الكشف عن الجسم الحي والتصوير GFP متعددة الأطياف في تقييمات الجهاز / الأنسجة على الجسم الحي ، يمكن تعظيم البيانات القابلة للقياس الكمي في مجموعة كبيرة من الفئران.

بغض النظر عن النهج الذي يتم اختياره لدراسة الحيوانات ، يوصى بشدة باستخراج جميع الدم قبل استرجاع الأعضاء / الأنسجة ، خاصة بالنسبة للدراسات التي تستهدف العبء النقيلي. يكتشف هذا البروتوكول إشارات GFP من عينات الدم الكاملة التي تم الحصول عليها من الفئران (البيانات غير الموضحة) في نموذج سرطان الثدي التقويمي بواسطة اختبارات PCR في الوقت الحقيقي. تقليل حجم الدم في الأعضاء / الأنسجة سوف يقلل من الإشارة الإيجابية الكاذبة في الأعضاء المستهدفة.

في الختام، نموذج سرطان الثدي التقويمي ة باستخدام خلايا MDA-MB-231-Luc/GFP هو نموذج الحيوان ذات الصلة للغاية التي تحاكي عن كثب حالة المريض TNBC الإنسان. هذا النموذج ضروري لدراسة ورصد وتقييم الفعالية العلاجية في بيئة ورم صغيرة مماثلة للبشر. استخدام خطوط الخلية المراسل المزدوج يعزز من التطبيق العملي لهذا النموذج سرطان الثدي تقويم الرحم.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن ينوهوا بدعم برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، ومؤسسة Bethesda MD، وبرنامج السرطان والالتهاب، ومختبر فريدريك الوطني - برنامج التصوير الحيواني الصغير، Leidos البحوث الطبية الحيوية ، وشركة ، فريدريك ميريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bouins SolutionSigmaHT10132-1Lتلطيخ العقيدات النقيلية للرئة
D-Luciferin ، ملح البوتاسيومGoldBioLUCK-1GLuciferase الركيزة
DNAzolThermoFisher10503027مجموعة استخراج الحمض النووي
Excel برنامججداول بيانات Microsoft
VirtisCyclone Virtishearلتجانس الأنسجة
الماسحالفلوري وBLI
الماسح الضوئي Maestro GNIR-FLEXالتصوير الفلوريPerkin Elmer
MatriGel MatrixCorning356234يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويحتفظ به قديما (4 درجة مئوية) عند الاستخدام.
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP خط خلية مستقرGenTargetSC044مراسل مزدوج خط خلايا سرطان الثدي البشري
مجهرThermoFisherEVOSالتقاط صورة الأنسجة
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتThermoFisher10010049شطف العازلة
Primer3MITبرايمر تصميم
المنشورGraphPadبرنامج التحليل الإحصائي
PuromycinThermoFisherA1113803المضادات الحيوية
RPMI 1640 وسائل الإعلامThermoFisher61870127Culture media
SeniFAST SYBR Lo-ROX kitBiolineBIO-94020كاشف PCR سريع في الوقت الحقيقي
StepOne Plus نظام PCR في الوقت الحقيقيThermoFisherآلة PCR في الوقت الحقيقي
الضوئي IVIS SPECTRUM نظام التصوير نظام

المراجع

  1. Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
  2. Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
  3. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).
  4. Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175(2011).
  5. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903(2016).
  6. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775(2011).
  7. Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178(2012).
  8. Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849(2018).
  9. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
  10. Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
  11. Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604(2019).
  12. Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
  13. Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).
  14. Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).
  15. Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26(2017).
  16. Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
  17. Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552(2015).
  18. Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
  19. Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815(2014).
  20. Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
  21. Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
  22. Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
  23. Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
  24. Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).
  25. Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
  26. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
  27. Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا MDA-MB-231قياس حجم الورمالتصوير بالتألق الحيويالكشف عن وسم GFPتقييم نقائل الرئةتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيقياس الورم باستخدام الفرجارتقدير العبء النقائلي
دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.