مقالة منهجية

زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه

DOI:

10.3791/60334

⸱

سبتمبر 28, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن ان تكون منقوشة الدهون مصفوفة خارج الخلية علي المواد الهلامية بولياكريلاميد لتمكين ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز متوافقة. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع المجهر قوه الجر والاختبارات البيوكيميائية لفحص التفاعل بين هندسه الانسجه ، والقوات المتولدة من الخلايا ، ومواصفات مصير.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية قدره فريدة علي الاستجابة للموفوينات في المختبر من خلال أنماط التنظيم الذاتي لمواصفات مصير الخلية التي تتوافق مع تكوين الطبقة الجرثومية الاوليه اثناء الاجنه. التالي ، تمثل هذه الخلايا أداه قويه لدراسة أليات التي تدفع بالتنمية البشرية المبكرة. لقد وضعنا طريقه للثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز المتوافقة التي توفر السيطرة علي كل من هندسه المستعمرات وبيئتها الميكانيكية من أجل تلخيص المعلمات المادية التي تكمن وراء تولد الاجنه. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو القدرة علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع أنماط محدده من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي السطح لتعزيز المرفقات الخلية. ويتحقق ذلك عن طريق افتعال الاستنسل مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وذلك باستخدام هذه الاستنسل لخلق أنماط من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي الزجاج الشفتين ، ونقل هذه الأنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره. هذا الأسلوب هو أيضا متوافق مع المجهر قوه الجر ، مما يسمح للمستخدم لقياس وتعيين توزيع القوات التي تولدها الخلايا داخل المستعمرات المحصورة. في تركيبه مع اختبارات الكيمياء الحيوية القياسية ، ويمكن استخدام هذه القياسات لفحص دور العظة الميكانيكية اللعب في تحديد المصير و تخلق خلال التنمية البشرية في وقت مبكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تحمل وعدا كبيرا لاستخدامها في الطب التجديدي وتطبيقات هندسه الانسجه. الطبيعة المستحثة لهذه الخلايا تمنحهم القدرة علي التفريق في اي نوع من أنواع الخلايا البالغة. وعلي الرغم من الخطوات الكبيرة التي تم القيام بها في توجيه مصير hESCs إلى أنواع معينه من الخلايا ، فقد ظل من الصعب جدا توليد انسجه كامله أو أجهزه من نوفو1،2،3،4، 5- ويرجع ذلك ، في جزء كبير منه ، إلى فهم محدود للأليات التي تقود تشكيل هذه الانسجه اثناء التنمية البشرية. ومن أجل سد هذه الفجوة في المعرفة ، برز عدد من الطرق في السنوات الاخيره لنمذجة الاجنه المبكرة والمراحل اللاحقة من التنمية مع الخلايا الجذعية الجنينية6،7،8،9 ،10،11،12،13.

بعد فتره وجيزة من اشتقاق الخطوط الاولي لل hESC14، ثبت ان الأجسام الجنينية التي تشكلت من hesc كانت قادره علي إنتاج خلايا تلقائيا من الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاثة6. ومع ذلك ، ونظرا للافتقار المتاصل في السيطرة علي حجم وشكل الأجسام الجنينية ، فان تنظيم الطبقات الجرثومية اختلف كثيرا وأخفق في مضاهاة تنظيم الجنين المبكر. في الاونه الاخيره ، وارفلش وآخرون وضعت طريقه لحصر مستعمرات hESCs علي ركائز الزجاج عن طريق ميكروباتيرنينج ، وتوفير السيطرة والاتساق علي حجم وهندسه المستعمرات8. وفي وجود BMP4 ، وهو من المتحولين المهمين في التنمية المبكرة ، كانت هذه المستعمرات المحصورة قادره علي التنظيم الذاتي لأنماط قابله للتكرار من المواصفات لمصائر تمثل الطبقات الجرثومية الاوليه. وعلي الرغم من ان هذا يوفر نموذجا مفيدا لدراسة أليات التي يتم بها إنشاء طبقات الجرثومية الاوليه ، فان أنماط تحديد المصير لم تتطابق تماما مع التنظيم والنشاه التي لوحظت اثناء تولد الاجنه15. وقد تحققت خلاصه أكثر إخلاصا للتنمية الجنينية المبكرة من خلال تضمين الشهادات في مصفوفة ثلاثية الابعاد (ECM) من المصفوفة11، وتوفير اقوي الادله حتى الآن لقدره hescs علي التنظيم الذاتي والنموذج المراحل المبكرة من الاجنه الجسم السابق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة تسفر عن نتائج غير متسقة التالي فهي تتنافى مع عدد من المقايسات التي يمكن استخدامها للكشف عن أليات الاساسيه للتنظيم الذاتي ومواصفات المصير.

النظر إلى هذه الأساليب القائمة والقيود الخاصة بكل منها ، سعينا إلى تطوير طريقه للتكرار المستعمرات hESC من الهندسي المحددة في الظروف التي نموذج البيئة خارج الخلية من الجنين في وقت مبكر. لتحقيق ذلك ، استخدمنا polyالاكريلاميد هيدروجيل من مرونة انضباطي للسيطرة علي الخواص الميكانيكية للركيزة. باستخدام المجهر القوه الذرية علي أجنه الدجاج مرحله التذوق ، وجدنا ان مرونة العدسة تراوحت من مئات باسكال إلى عدد قليل من kilopascals. وهكذا ، ركزنا علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع مرونة في هذا النطاق لتكون بمثابه الركيزة لمستعمرات hESC. قمنا بتعديل طرقنا السابقة لزراعه الدهون علي بولياكرياميد هيدروجيل7،9 لتوفير السيطرة القوية علي هندسه المستعمرات. حققنا هذا من قبل الأول زخرفه ECM ligands ، وهي الأمومي ، علي الزجاج coverslips من خلال الاستنسل المجهرية ، كما ذكرت سابقا16. ثم قمنا بتصميم تقنيه جديده لنقل الاربطه المنقوشة إلى سطح الهلام المائي بولياكريلاميد خلال البلمره. الأسلوب الذي وصفناه هنا ينطوي علي استخدام التصوير الضوئي لصنع رقاقه السيليكون مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وخلق الطوابع من الميزات الهندسية مع polydimethylsiloxane (PDMS) ، واستخدام هذه الطوابع لتوليد الاستنسل التي تسمح في نهاية المطاف زخرفه من يجند علي سطح الشفتين الزجاجية ونقل إلى بولياكرياميد.

بالاضافه إلى تلخيص البيئة الميكانيكية للجنين في وقت مبكر ، وحصر المستعمرات hESC علي polyالاكريلاميد تمكن قياس القوات المتولدة من الخلايا مع المجهر قوه الجر (TFM) ، كما ذكر في الطريقة السابقة9لدينا. باختصار ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من حبات الفلورسنت في بولياكريلاميد وتستخدم كعلامات ايماني. وتحسب القوات المتولدة من الخلايا عن طريق تصوير أزاحه هذه الخرز بعد البذر hESCs علي الركيزة منقوشة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الجمع بين خرائط قوه الجر الناتجة مع المقايسات التقليدية ، مثل المناعة ، لدراسة كيف يمكن لتوزيع القوات المتولدة من الخلايا في مستعمرات التردد الضيق المحصورة ان ينظم أو يعدل الإشارات الاماميه. ونتوقع ان تكشف هذه الأساليب عن ان القوات الميكانيكية تلعب دورا حاسما في زخرفه مواصفات قدر الخلية خلال التنمية الجنينية المبكرة التي يتم تجاهلها حاليا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا المتعلقة باستخدام hESCs من قبل لجنه البحوث البشرية والاجنه والخلايا الجذعية (جسر) في جامعه كاليفورنيا سان فرانسيسكو.

1. اعداد رقاقه السيليكون مع ميزات هندسية

  1. إنشاء ضوئي مع الميزات الهندسية المطلوبة. استخدام برامج الصياغة بمساعده الكمبيوتر لتصميم الميزات. للاستخدام مع مقاومه الصور السلبية ، وجعل الميزات مبهمه والباقي من قناع شفافة.
    ملاحظه: بالنسبة لزخرفه علي الشفتين الصغيرتين قطرها 18 مم ، ميزات المجموعة لكل حاله تجريبية في 10 × 10 ملم المناطق لضمان الاستنسل المتولدة في الخطوة 3 تناسب علي الشفتين.
  2. تدور الطبقة السلبية المقاومة للضوء علي رقاقه السيليكون 100 مم. استخدام ورقه البيانات المقاومة للضوء لتحديد سرعه وطول تدور لتوليد سمك الفيلم من 100-250 μm.
    ملاحظه: يجب تعديل سماكه الفيلم بحيث تكون نسبه العرض إلى الارتفاع للعرض من النقوش إلى ذروه الاستنسل قريبه من 1:1 قدر الإمكان. ومع ذلك ، فاننا نوصي سمك الحد الأدنى من 100 μm ، كما اي شيء اقل تنتج الاستنسل الحساسة التي تمزق بسهوله.
  3. معالجه المقاومة الضوئية وفقا لورقه بيانات المنتج. وهذا ينطوي عاده علي خبز لينه ، والتعرض للاشعه فوق البنفسجية مع ضوئي في قناع المصفف ، بعد التعرض خبز ، والتنمية ، والخبز الصلب. وكمثال علي ذلك ، فان الاجراء المستخدم لمعالجه الرقاقات المستخدمة في هذا البروتوكول مبين في الجدول 1.
    ملاحظه: توخي الحذر عند التعامل مع رقائق السيليكون كما انها هشه. بمجرد إنشائها ، يمكن استخدام الرقاقات بشكل متكرر طالما انها غير معطوبة.

2. اعداد الشفاه المختلطة

  1. اعداد الشفاه المغسولة بالحمض "العلوي"
    1. ضع 18 ملم قطر #1 سماكه الشفتين في صحن بتري الزجاج. العدد المناسب من الشفتين يعتمد علي حجم الطبق. للحصول علي طبق 100 ملم ، أعد 50-100 الشفتين في وقت. حجم المبالغ المعطية من خلال الجزء المتبقي من هذا القسم يتوافق مع طبق 100 مم.
    2. أضف 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 م إلى طبق بيتري وهز الطبق برفق لتفريق الشفتين. ضمان غمرت جميع الشفتين والإفراج عن فقاعات الهواء من بين الشفتين. احتضان بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
      تحذير: HCl حمضيه وقابله للتاكل. استخدام الحذر وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة اثناء العمل مع HCl.
    3. Decant HCl من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
    4. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضف 20 مل من الايثانول 100% إلى الطبق. باستخدام ملقط ، وأزاله الشفتين بشكل فردي وترتيب بين قطعتين من ورقه فلتر لتجف.
    5. يخزن الشفتين المجففتين في حاويه مختومه. يمكن تحضير الشفاه المغسولة بالحمض مقدما وتخزينها لمده شهر أو أكثر في ظروف خاليه من الغبار.
  2. اعداد الشفاه المنشطة من غلوتارالدهيد "السفلي"
    ملاحظه: الرجوع إلى الطرق السابقة للحصول علي تفاصيل اضافيه7,9.
    1. ضع 18 ملم قطر #1 سماكه الشفتين في طبق بيتري.
    2. أضافه 20 مل من 0.2 M HCl إلى طبق بتري ويهز بلطف الطبق لتفريق الشفتين. ضمان غمرت جميع الشفتين والإفراج عن فقاعات الهواء من بين الشفتين. احتضان بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    3. Decant HCl من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
    4. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضف 20 مل من 0.1 M NaOH وهز برفق لتفريق ودمج الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة.
    5. ديانت NaOH من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
    6. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضافه 20 مل من 1:200 التخفيف من 3-امينوبروبيل تريميثوكسيسيلان في الماء نقاء ويهز بلطف لتفريق ودمج الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها.
      تحذير: 3-امينوبروبيل تريميثوكسيسيلان هو قابل للاشتعال ويمكن ان يسبب تهيج الجلد. التعامل مع الرعاية ، وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة ، وتجاهل النفايات وفقا للوائح التخلص المحلية.
    7. Decant المخفف 3-امينوبروبيل trimethoxysilane الحل من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق. تخلصي من الماء وكرري ما لا يقل عن خمسه غسول. فمن المهم لأزاله جميع 3-امينوبروبيل trimethoxysilane قبل المضي قدما.
    8. بعد التخلص من غسل النهائي ، أضافه 20 مل من 1:140 التخفيف من 70 ٪ غلوتارالديهيد في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية الخاصة) ويهز بلطف لتفريق وغمر الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها.
      تحذير: 70% غلوتارالدهيد هو سام ويمكن ان يسبب تهيج الجلد. التعامل مع الرعاية ، وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة ، وتجاهل النفايات وفقا للوائح التخلص المحلية.
    9. Decant محلول غلوتارالدهيد المخفف من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
    10. بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضافه 20 مل من الايثانول 100 ٪. باستخدام ملقط ، وأزاله الشفتين بشكل فردي وترتيب بين قطعتين من ورقه فلتر لتجف.
    11. يخزن الشفتين المجففتين في حاويه مختومه. يمكن اعداد الشفاه المنشطة غلوتارالدهيد مسبقا وتخزينها لمده تصل إلى سته أشهر.

3. جيل من الاستنسل لزخرفه ECM يجند

  1. توليد الطوابع الوسيطة بوليديميثيلسيلاوكسان (PDMS)
    1. مزيج PDMS قاعده مع PDMS عامل العلاج في نسبه 10:1 ، من حيث الوزن. اخلط جيدا.
      ملاحظه: بالنسبة للتطبيق الاولي لل PDMS ، واعداد حوالي 100 غرام من PDMS لملء 100 mm طبق. للتطبيقات اللاحقة ، أزاله PDMS من مركز الطبق فقط حيث تقع ملامح رقاقه السيليكون واعداد 20-30 g من PDMS الجديدة.
    2. Degas الخليط PDMS في المجففة لمده 30-60 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء.
    3. ضع رقاقه السيليكون المعدلة من الخطوة 1 في طبق من البلاستيك 100 مم. ببطء التساوي صب خليط PDMS علي سطح الرقاقة. اضغط علي الطبق علي سطح العمل لإطلاق اي فقاعات الهواء من سطح الرقاقة.
    4. سكب الخليط PDMS علي رقاقه لمده 10 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء أو قد حان لسطح PDMS.
    5. اخبز PDMS في 70 درجه مئوية لمده 2 ح. السماح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة.
    6. باستخدام مشرط أو قطع مربع ، وقطع القسم من PDMS من مركز الطبق الذي يحتوي علي ميزات هندسية.
    7. قطع PDMS إلى ما يقرب من 10 × 10 ملم المربعات ، كل تحتوي علي ميزات لحاله تجريبية واحده. ويشار اليها باسم "الطوابع" في الخطوات اللاحقة من البروتوكول.
  2. توليد ألواح مسطحه من PDMS
    1. مزيج PDMS قاعده مع PDMS عامل العلاج في نسبه 8:1 ، من حيث الوزن. اعداد حوالي 20 غراما لكل طبق 100 ملم لاستخدامها. اخلط جيدا.
    2. Degas الخليط PDMS في المجففة لمده 30-60 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء.
    3. صب ببطء التساوي PDMS في طبق 100 mm نظيفه. اضغط علي الطبق علي سطح العمل لإطلاق اي فقاعات الهواء.
    4. اخبز PDMS في 70 درجه مئوية لمده 2 ح. السماح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة.
    5. أزاله PDMS من الطبق. عكس ذلك ان سطح PDMS التي كانت علي اتصال مع الجزء السفلي من الطبق هو مواجهه.
    6. لكل طابع تم إنشاؤه في الخطوة 3.1 ، قطع 15 × 15 مم مربع من PDMS. ويشار اليها بعبارة "ألواح مسطحه" في الخطوات اللاحقة من البروتوكول.
  3. إنشاء قوالب الاستنسل
    1. ترتيب ألواح مسطحه من PDMS علي غطاء طبق 150 مم ، أو سطح مستو آخر لسهوله المناولة. ضمان تباعد كاف بين ألواح (علي سبيل المثال ، لطبق 150 ملم ، وترتيب تسعه ألواح مسطحه مع تباعد حتى).
    2. عكس كل طابع تم إنشاؤه في الخطوة 3.1 علي بلاطه مسطحه من PDMS ، بحيث تكون الميزات علي الطابع علي اتصال مع بلاطه مسطحه من PDMS. اضغط برفق علي الجهة العلوية من الختم مع ملقط لضمان الاتصال حتى.
    3. دعم بعناية غطاء عقد PDMS الطوابع/لوح أزواج حتى علي قاعده الطبق ، بحيث يستريح الغطاء في زاوية. وهذا يساعد علي فتل البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في الخطوة التالية.
    4. ضع قطره صغيره من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في الواجهة العلوية لكل زوج من الطوابع/البلاطات. وسوف يكون البوليمر الأشرار بين الاثنين عن طريق التوتر السطحي ، بمساعده من الجاذبية.
      ملاحظه: العديد من البوليمرات المختلفة للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء قد تعمل في هذا البروتوكول. اخترنا Norland لاصق البصرية 74 للخصائص التالية: ط) علاج سريع علي التعرض للاشعه فوق البنفسجية ، ii) أزاله سهله من الطوابع PDMS عند المعالجة ، iii) التصاق قويه للزجاج coverslips مع الضغط اليدوي.
    5. مره واحده وكان البوليمر تماما من خلال الأشرار ، ووضع الغطاء مع أزواج الطوابع/لوح مسطحه علي سطح العمل. ضع قطره صغيره من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في كل من الجوانب الثلاثة المتبقية من كل واجهه الختم/بلاطه.
    6. باستخدام طرف ماصه 200 μL ، قم بتوصيل قطرات البوليمر حول حواف واجهه الختم/البلاطة. يؤدي هذا إلى إنشاء حدود التي سيتم عقد الحل في الخطوة 4.
      ملاحظه: كن حذرا عند العمل البوليمر حول حواف الطابع. إذا تم تعطيل واجهه الختم/بلاطه ، فان البوليمر سوف الفتيل تحت الميزات وسوف الاستنسل لا تشكل بشكل صحيح.
    7. وضع بعناية أزواج الطوابع/لوح في مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. استخدام المعقمة "Str" اعداد الطاقة وفضح لمده 10 دقيقه.
    8. أزاله أزواج الطوابع/لوح من مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط ، وأزاله بلطف ختم PDMS في حين عقد أسفل بلاطه مسطحه والاستنسل التي شكلت من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء.
    9. باستخدام ملقط ، وأزاله الاستنسل بعناية وعكس ذلك ان السطح الذي كان علي اتصال مع بلاطه مسطحه من PDMS هو مواجهه.
      ملاحظه: الاستنسل حساسة. كن حذرا في حين تسليمها ، وخصوصا في حين ازالتها في البداية من PDMS ، بحيث لا المسيل للدموع.
    10. وضع الاستنسل المقلوب مره أخرى في مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. استخدام المعقمة "Str" اعداد الطاقة وفضح لمده 3 دقائق.

4. زخرفه ECM يجند علي الشفاه المختلطة

  1. الضغط علي الاستنسل علي الشفاه المغسولة بالحمض
    1. ضعي شفه واحده مغسولة بالحامض لكل استنسل علي قطعه نظيفه من الفيلم المختبري.
    2. باستخدام ملقط ، وضع بعناية كل الاستنسل ، مسطحه من جانب إلى أسفل ، علي coverslip غسلها بالحمض. وضع مثل هذه الميزات تتركز علي الشفة.
    3. ضع قطعه صغيره من الفيلم المختبري علي راس كل استنسل. بحزم التساوي اضغط لأسفل علي الاستنسل لإنشاء اتصال قوي بين الاستنسل و coverslip.
      ملاحظه: هذه خطوه هامه! اضغط بقوة وعبر سطح الاستنسل بأكمله. إذا لم يتم إنشاء اتصال كافيه ، سيتم تسرب الحل يجند بين الاستنسل والشفتين وسوف تفشل زخرفه. اختياري: لتاكيد الاتصال الكافي بين الاستنسل و coverslip ، ماصه 100 μL من المياه المعقمة فائقه النقاء علي سطح كل الاستنسل واحتضان في درجه حرارة الغرفة. بعد 1 ساعة ، والتحقق من تسرب. يستنشق الماء من الاستنسل المستعبدين بنجاح والمضي قدما.
  2. البلازما تنظيف سطح الشفتين رسمت لزيادة الهيدروفيليسيتي
    1. ضع الشفتين مع الاستنسل في منظف البلازما. تطبيق البلازما عاليه الطاقة لمده 30 ثانيه.
  3. اعداد الحل الأمثل لECM
    ملاحظه: يجب إكمال كافة الخطوات اللاحقة في ظروف معقمه إذا كان ذلك ممكنا.
    1. مكان معقم 100 mM HEPES ، 100 mM NaCl ، pH 8.0 حل علي الجليد. مره واحده الجليد الباردة, أضافه الحاكم والكولاجين لتحقيق تركيزات 225 ميكروغرام/مل و 25 ميكروغرام/مل, علي التوالي. اختياري: لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أو للحصول علي التمثيل المرئي ، تضمين فلوريسسينتلي المفتاحية في الحل يجند.
      1. ملاحظه: يمكن استخدام يغاندس ECM مختلفه مع هذا الأسلوب. بالنسبة لمختلف الأنواع ، قد يتطلب الأمر تحسينا إضافيا لتحديد التركيز المثالي ، ووقت الحضانة ، ودرجه حرارة الحضانة. راجع قسم المناقشة للحصول علي مزيد من المعلومات.
    2. الماصة الحل علي سطح كل الاستنسل. بالنسبة لقوالب الاستنسل المصنوعة من 10 × 10 مم طوابع مربعه ، ضع 100 μL لكل استنسل.
    3. البحث عن فقاعات الهواء في ميزات الاستنسل. إذا لزم الأمر ، استخدم ملقط ذو رؤوس رقيقه أو طرف ماصه 2 μL لأزاله فقاعات الهواء من الميزات.
      ملاحظه: هذه خطوه هامه! إذا بقيت فقاعات الهواء المحاصرين علي سطح الشفة ، واليجند سوف لا الممتب علي السطح وسوف يكون نمط الناتجة غير مكتملة.
    4. ضع الشفاه الرسمته مع الاربطه في طبق ، والتفاف مع الفيلم المختبري ، واحتضان في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.

5. نقل يجند إلى هلام بولياكريلاميد

  1. أزاله الربط والحل الاستنسل من كل شفه المشارك
    1. يستنشق الحل يجند من سطح الاستنسل. ويمكن جمع الحل ligand وتخزينها في 4 درجه مئوية وأعاده استخدامها لمده تصل إلى شهر.
    2. باستخدام ملقط ، لفتره وجيزة الفرعية كوفيرسليب مع الاستنسل في صحن يحتوي علي العقيمة لغسل الصحون.
    3. بإيجاز [سوبدمج] ال [كوفرليب] مع استنسل داخل ثاني طبق من [ببس] معقمه ان يغسل.
    4. أزاله الاستنسل من سطح الشفة. كن حذرا لعدم كسر coverslip.
    5. لفتره وجيزة تحت دمج كوفيرسليب في طبق يحتوي علي المياه المعقمة نقاء لأزاله الأملاح من يغسل تلفزيوني. اضغط علي حافه كوفيرسليب لمسح مهمة حساسة إلى الفتيل بعيدا المياه الزائدة.
    6. تجفيف الشفة تحت غاز خامل ، مثل النيتروجين. وضع علامة علي الجهة السفلية من كوفيرسليب لتتبع التوجه من هذه النقطة إلى الامام. كن حذرا للحفاظ علي الجانب منقوشة مواجهه.
    7. كرر الخطوات 5.1.1 من خلال 5.1.6 لكل رسمت coverslip.
  2. صنع الهلام المائي بولياكريلاميد مع الشفتين منقوشة
    ملاحظه: الرجوع إلى الأساليب السابقة للحصول علي تفاصيل اضافيه7،9 تعقيم جميع أصحاب كاب ، أنابيب ، والفواصل المستخدمة لجعل الهلام polyالاكريلاميد بالغسل مع 10 ٪ التبييض بين عشيه وضحيها ، والشطف مع الماء علي الأقل خمس مرات لأزاله التبييض ، ويغسل لفتره وجيزة في 70% ايثانول. ضع جميع القطع علي مناديل المهمة الحساسة في خزانه معقمه للسلامة البيولوجية لتجف قبل الاستخدام.
    1. اعداد محلول بولياكريلاميد للحصول علي مرونة هيدروجيل المطلوب (الجدول 2). تخلط جميع المكونات معا باستثناء المجالات المجهرية الفلورية والبوتاسيوم البيروفات (PPS).
      ملاحظه: اعداد 1 ٪ محلول بيروكبريتات البوتاسيوم الطازجة في كل مره.
    2. Degas الحل بولياكريلاميد ، المجهرية ، و PPS في أنابيب منفصلة تحت فراغ لمده 30 دقيقه.
    3. بالنسبة لكل شفه منقوشة ، أعد المشبك المنشط "أسفل" غلوتارالدهيد مع فاصل (قطر خارجي 18 مم ، قطر داخلي 14 مم) وضع علي القمه.
    4. بعد التفريغ ، لفتره وجيزة المجهرية الدقيقة وأضافه حجم المناسبة إلى محلول بولياكريلاميد. مزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا ، والحرص علي عدم إدخال فقاعات الهواء. باختصار.
    5. أضافه الحجم المناسب من PPS إلى محلول بولياكريلاميد. ماصه صعودا وهبوطا لخلط الحل ، والحرص علي عدم إدخال فقاعات الهواء.
      ملاحظه: بعد أضافه PPS ، العمل بسرعة لإكمال الخطوات ال5.2.6ه من خلال 5.2.11 قبل بوليميريزيس بولياكرياميد.
    6. ماصه 75-150 μL (اعتمادا علي سمك فاصل) إلى مركز كل المنشطات جلوتارالدهيد تنشيط.
    7. باستخدام الملقط ، ضعي الشفة المنقوشة علي كل من المشبك المنشط غلوتارالدهيد مع بولياكرياميد والمباعدة ، بحيث تواجه الاربطه المنقوشة محلول بولياكرياميد. إذا تم أضافه محلول بولياكريلاميد كافيه ، فان التوتر السطحي سوف الفتيل polyالاكريلاميد بين اثنين من الشفتين والهواء لا فقاعات ستكون موجودة.
    8. تلتقط كل من بولي اكريلاميد "ساندويتش" وتلمس بعناية الجانب لمسح مهمة حساسة إلى الفتيل بعيدا الزائدة محلول بولياكريلاميد.
    9. ضع بعناية كل بولي اكريلاميد "ساندويتش" في حامل غطاء مع المواضيع التي تتوافق مع 15 مل أنابيب مخروطيه القاع. يجب ان يكون التوجه بحيث يكون الجزء السفلي من الكوفيرسليب جلوتارالديهيد في اتصال مع الجزء السفلي من حامل الغطاء ، والمشبك منقوشة علي القمه.
    10. برغي 15 مل أنبوب مخروطي القاع في كل حامل غطاء لعقد polyالاكريلاميد "السندويشات" في مكان. يجب ان تكون الأنابيب ضيقه لمنع تسرب ، ولكن كن حذرا لعدم الإفراط في تشديد والكراك الشفتين.
    11. الطرد المركزي بولي اكريلاميد "السندويشات" في أنابيب في الجرافات الارجوحه في 200 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. أزاله الأنابيب من الطرد المركزي ومكان في رفوف أنبوب للحفاظ علي التوجه لمده 50 اضافيه دقيقه لضمان البلمره الكامل. تبقي مغطاه إحباط لمنع تبييض المجهرية الفلورسنت.
      ملاحظه: طرد الهامه عند استخدام هذا الأسلوب لتنفيذ TFM. قوه الطرد المركزي يتحرك كل المجالات المجهرية إلى طائره واحده ، والتي سوف تكون في نهاية المطاف فقط تحت سطح هيدروجيل. ويعد هذا الأمر مثاليا لتصوير عمليات الازاحه المجهرية التي تستخدم لحساب ضغوط الجر المتولدة من الخلايا. في حاله عدم تنفيذ TFM ، يمكن ترك المجالات المجهرية للخروج من محلول بولياكريلاميد ويمكن ان تحدث البلمره في السطح بدون طرد.
    12. أزاله بلمره بولياكرياميد "السندويشات" من الأنابيب وتحت الدمج في الاذاعه التلفزيونية في صحن مم 100. التفاف في الفيلم المختبري واحتضان لمده 3 ساعات في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. اعداد الهلام منقوشة لخلايا البذر
    1. استخدام مشرط وملقط لأزاله بعناية المشبك منقوشة والفاصل من بولي اكريلاميد "ساندويتش" في حين انها لا تزال مغمورة في الاذاعه التلفزيونية. ستكون الاربطه المنقوشة قد نقلت إلى البولياكرياميد خلال البلمره ستبقي بعد أزاله الشفة المختلطة. سيبقي هلام بولياكرياميد ملتصقا بالشفة المنشطة غلوتارالدهيد.
      ملاحظه: هذه خطوه هامه! يجب ان تكون مغمورة بولياكرياميد في الاذاعه التلفزيونية في حين أزاله كوفيرسليب أو سيتم تدمير أنماط يجند.
    2. ضعي كل شفه مع بولياكرياميد منقوشة في حامل الغطاء. وضع طوقا (18 ملم القطر الخارجي ، 14 مم القطر الداخلي) علي راس كوفيرسليب وحول بولياكرياميد ، حيث يقع الفاصل. برغي أنبوب مخروطي الشكل من عيار 15 ملم إلى حامل الغطاء ، والذي يشكل بئرا مع البولياكرياميد المنقوش في الأسفل. هذه التجمعات تنسجم مع ابار القياسية 12 بئر لوحه لسهوله التعامل معها.
    3. غسل كل هلام عن طريق أضافه 500 μL من تلفزيوني إلى التجمع جيدا. احتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. أزاله تلفزيوني وتكرار مرتين لما مجموعه ثلاثه يغسل.
    4. بعد غسل تلفزيوني النهائي ، أضافه 500 μL من وسائل الاعلام المغلوب-DMEM إلى الهلام واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. ويمكن الاحتفاظ الهلام في 37 درجه مئوية مع وسائل الاعلام لمده تصل إلى 5 أيام قبل الخلايا البذر.
    5. في اليوم السابق لبذر الخلايا ، واستبدال المغلوب-DMEM لوسائل الاعلام KSR كامله واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.

6. الذبح الhescs علي الهلام منقوشة

ملاحظه: إذا كان التخطيط لإصلاح عينات للمناعة بعد TFM ، والتقاط الصور من مواقف ميكروكروي غير المجهدة قبل الخلايا البذر. في هذه الحالة ، فلوريسسينتلي الموسومة يجند ينبغي ان تستخدم في الخطوة 4-3 بحيث المواقع النهائية من الخلايا سوف تكون معروفه قبل البذر والمجهرية يمكن ان تكون في هذه المناطق.

  1. الحفاظ علي المخزونات hesc الثقافات والثقافات الثانوية الخالية من المغذيات التي أعدت علي لوحات المغلفة المصفوفة في وسائل الاعلام ksr مكيفه قبل البذر علي الهلام بولي اكريلاميد منقوشة كما هو موضح سابقا9.
    ملاحظه: توليد وسائل الاعلام KSR مكيفه عن طريق التنظير الإشعاعي الخلايا الليفية الجنينية الفئران في KSR وسائل الاعلام تستكمل مع 4 نانوغرام/مل عامل النمو الليفي الاساسيه (bFGF). جمع واستبدال وسائل الاعلام كل 24 ساعة.
  2. شفط وسائل الاعلام من hESCs. يغسل بإيجاز مع وسائل الاعلام المغلوب-DMEM. أضافه 0.05 ٪ تريبسين-أدتا تستكمل مع 10 μM Y27632 (رو كيناز المثبط) واحتضان في 37 درجه مئوية ل 5-10 دقيقه.
  3. أضافه وسائل الاعلام مع المصل لمنع التريبسين. يستنشق الوسائط برفق والماصة فوق الطبق لأزاله الخلايا. استمر في السحب برفق لأزاله كافة الخلايا وفك تكتلات الخلايا إلى خلايا مفرده.
  4. جمع تعليق الخلية والطرد المركزي في 200 x g لمده 3 دقائق.
  5. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مكافئ من وسائل الاعلام ksr لغسل. الطرد المركزي في 200 x g لمده 3 دقائق.
  6. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في وسائل الاعلام المكيفة ksr تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bfgf و 10 μM Y27632.
  7. عد الخلايا مع مقياس الكريات الدموية وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 300,000 خلايا لكل مل. ماصه 500 μL من تعليق الخلية علي كل هلام منقوشة (150,000 خلايا لكل هلام).
  8. 3 ح بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام من كل هلام واستبدال مع وسائل الاعلام الطازجة KSR مكيفه تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF و 10 μM Y27632. وهذا يزيل الخلايا الزائدة التي لم تلتزم بالمناطق المنقوشة من بولياكرياميد.
    ملاحظه: هذه خطوه هامه! في هذه المرحلة سيتم التمسك الخلايا فضفاضة إلى ligand منقوشة. كن حذرا جدا عند مبادله الوسائط بعدم فصل الخلايا. وينبغي الحرص علي المساواة مع كل من مبادلات وسائط الاعلام في الخطوات اللاحقة.
  9. 24 ساعة بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام وتبادل لوسائل الاعلام KSR مكيفه تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF و 5 μM Y27632.
  10. 48 h بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام وتبادل لوسائل الاعلام مكيفه KSR تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF. وهذا يزيل مثبطات رو كيناز من وسائل الاعلام والتجارب يمكن ان تبدا في اليوم التالي, 72 h بعد البذر.

7. أداء TFM

  1. عند الرغبة ، تنفيذ TFM كما هو موضح سابقا9 تحت الظروف التجريبية المطلوبة.
  2. إذا كانت المواقف المجهرية غير المجهدة قد وضعت قبل الخلايا البذر ، وإصلاح الخلايا بعد اتخاذ مواقف المجالات الدقيقة المجهدة وأداء المناعي لتحديد توطين البروتينات ذات الفائدة بالنسبة للمناطق من قوي الجر العالية والمنخفضة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحدي الرئيسي الذي يجب التغلب عليه في محاولة للثقافة hESCs في مستعمرات الهندسة الخاضعة للرقابة علي ركائز متوافقة هو توليد نمط متجانس من ECM-ligand علي سطح الركيزة. وتتضمن الاستراتيجية المقدمة في هذه الطريقة أولا توليد النمط المطلوب علي سطح الزجاج الزجاجي ثم بعد ذلك نقل هذا النمط إلى سطح هيدروجيل بولياكريلاميد خلال البلمره من هلام (الشكل 1 A). التالي ، فمن المهم لضمان يتم إنشاء نمط المرجوة بنجاح علي سطح الزجاج كوفيرسليب قبل الشروع في البلمره ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتبسيط بروتوكول طويل ومفصل ، وهذا الأسلوب يتكون من ثلاث مراحل حرجه: 1) توليد أنماط من الربط ECM وعلي الزجاج الشفتين ، 2) نقل أنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره من هلام ، و 3) البذر hESCs علي منقوشة هيدروجيل. وهناك خطوات حاسمه يجب النظر فيها في كل من هذه المراحل الثلاث. من أجل توليد أنماط عاليه الدقة علي الشفتين الزجاج ، يجب ان يتم الضغط علي الاستنسل بشده علي coverslips لمنع تسرب من الحل يجند ويجب أزاله جميع فقاعات الهواء بعد أضافه يجند الحل إلى سطح الاستنسل ( الشكل 1(ج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود ان نعترف بالتمويل من منحه CIRM RB5-07409. J.M.M. يود ان يشكر FuiBoon كاي ، Dhruv ثازار ، وروجر اوريا للمناقشات المختلفة التي استرشدت الجيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه الطريقة. كما يشكر J.M.M. الزمالة الاستكشافية لشركه UCSF للدعم المستمر لعمله.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ تريبسينجيبكو25300054
100 مم طبق بتري زجاجيفيشر ساينتفيك08-747B
100 مم طبق بتري بلاستيكفيشر ساينتفيكFB0875712
15 مل أنابيب مخروطية القاعكورنينج352095
150 مم طبق بتري بلاستيكفيشر ساينتفيكFB0875714
18 مم القطر # 1 أغطيةThermo Scientific18CIR-1
2٪ bisacrylamideBio-Rad161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilaneACROS Organics313251000
40٪ أكريلاميدBio-Rad161-0140
رقائق الألومنيومفيشر ساينتفيك01-213-100
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسيةSigma-AldrichF0291
مبيضكلوركسN / A
الطرد المركزي مع دلاء متأرجحةEppendorf22623508الموديل: 5804 R
كولاجينكورنينج354236
Dessicatorفيشر Scientific08-642-7
الإيثانولفيشر AC615095000
الجنين مصل البقرGibco16000044
المجهرية الفلوريةملقط Thermo ScientificF8821
(للأغطية)ملقط فيشر Scientific16-100-122
(للرقائق)حاملي جل Fisher Scientific17-467-328
N / A/ Aحاملي جل مخصصون مطبوعون ثلاثية الأبعاد ، رسم CAD متاح عند الطلب
جلوتارالديهايدفيشر Scientific50-261-94
HEPESالحرارية العلميةJ16926A1
صفيحة ساخنةفيشر ScientificHP88854100
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA144S-500
كحول الأيزوبروبيلفيشر ScientificA416-500
Kimwipes (مناديل مهمة دقيقة)كيمبرلي كلارك بروفيشنال34120
استبدال مصل خروج المغلوبجيبكو10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
تقويم قناع (للطباعة الحجرية الضوئية)Karl Suss America، Inc.Karl Suss MJB3 Mask Aligner
MatrigelCorning354277
المجهر لقوة الجرنيكونN / Aنموذج: Eclipse TE200 U
مرحلة تحديد المواقع الآليةالسابقة العلميةN /A الموديل: HLD117
غاز النيتروجينAirgasNI 250
نورلاند لاصق بصري 74 (بوليمر قابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية)نورلاند المنتجاتNOA 74
فرنحراريعلمي PR305225G
بارافيلم (فيلم معملي)فيشر ساينتفيك13-374-12
PDMS (سيلجارد 184)قناع ضوئيNC9285739
CAD / Art Services، Inc.N / Aأقنعة ضوئية مصنوعة حسب الطلب. رسم CAD لتصميماتنا متاح عند الطلب
منظف البلازمافيشر ScientificNC9332171
البلاستيك للحشيةMarian ChicagoHT6135
Plastic for spacerTAP PlasticsN / Aلوح بولي كربونات ، سمك 0.01 بوصة
كلوريد البوتاسيوم (لصنع PBS)فيشر ScientificP217-500
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (لصنع PBS)فيشر ScientificP285-500
بروسفات بوتاسيومACROS Organics424185000
مشرطفيشر Scientific14-840-00
رقاقة السيليكونعلوم المجهر الإلكتروني71893-06النوع P ، 3 بوصة ، رقائق السيليكون
كلوريد الصوديوم (لصنع PBS)فيشر ScientificS271-1
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS318-100
ثنائي هيدرات ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (لصنع PBS)فيشر ScientificS472-500
SU8-3050 مقاوم للضوءMicroChemSU8-3000
SU8-DeveloperMicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
صندوق التعقيم بالأشعة فوق البنفسجيةBio-RadN / ABio-Rad GS Gene Linker غرفة الأشعة فوق البنفسجية
Y27632 (مثبط Rho kinase)تقنيات الخلايا الجذعية72304
N فيشر العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001(2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Human Embryonic Stem CellsPolyacrylamide HydrogelsTraction Force MicroscopyColony Geometry ControlCompliant SubstratesExtracellular Matrix PatterningPDMS Stencil FabricationFluorescent Ligand TransferCell Fate SpecificationMechanical Cues Analysis

مقالات ذات صلة