Method Article

توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقه قياس التدفق الخلوي للتعرف علي أنواع مختلفه من الخلايا التي يتم استردادها من دماغ الماوس أو الحبل الشوكي في نفس الوقت. ويمكن استغلال هذه الطريقة لعزل أو توصيف مجموعات الخلايا النقية في الامراض التنكسية العصبية أو لقياس مدي استهداف الخلايا في الاداره المجرية لنواقل أو جسيمات نانويه فيروسية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد فتحت التطورات الاخيره في مجال النواقل الفيروسية والعلوم النانوماتيرياله الطريق امام نهج متطورة جديده للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي أو التلاعب به (CNS). ومع ذلك ، فان الاستفادة المثلي من هذه التكنولوجيات ستستفيد من الأساليب التي تسمح بالتحديد السريع والمبسط لمدي التركيز العصبي الخلوي والاستهداف الخاص بالخلايا علي أداره النواقل الفيروسية أو الجسيمات النانويه في الجسم. هنا ، نقدم البروتوكول الذي يستفيد من الانتاجيه العالية وقدرات الإرسال المتعدد لقياس التدفق الخلوي للسماح بالتحديد الكمي المباشر للأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المعزولة عن دماغ الماوس أو الحبل الشوكي ، اي الخلايا الصغيرة/الضامة ، اللمفاويات ، استروسينتيس نحن نطبق هذا النهج لتسليط الضوء علي الاختلافات الحاسمة بين طريقتين تجانس الانسجه من حيث الغلة الخلية ، والقدرة علي البقاء والتكوين. وهذا يمكن ان يرشد المستخدم لاختيار أفضل طريقه اعتمادا علي نوع (s) الخلية من الفائدة وتطبيق معين. هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل التوزيع التشريحي ، لان النسيج متجانس لتوليد تعليق خليه واحده. ومع ذلك ، فانه يسمح للعمل مع خلايا قابله للحياة وانه يمكن الجمع بين الخلية الفرز ، فتح الطريق امام العديد من التطبيقات التي يمكن ان توسع ذخيرة الاداات في ايدي الأعصاب ، بدءا من إنشاء الثقافات الاوليه المستمدة من الخلايا النقية ، إلى تحليلات التعبير الجيني والاختبارات البيوكيميائية أو الوظيفية علي الأنواع الفرعية المحددة جيدا في سياق امراض الأعصاب

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت تقنيات توصيل الجينات والادويه (مثل النواقل الفيروسية والجسيمات النانويه) أداه قويه يمكن تطبيقها للحصول علي رؤى أفضل حول المسارات الجزيئية المحددة التي تم تغييرها في امراض الأعصاب ولتطوير الطرق العلاجية المبتكرة1،2،3. وتعتمد الاستفادة المثلي من هذه الاداات علي القياس الكمي لما يلي: (1) مدي التغلغل في الجهاز العصبي العام عند طرق الاداره المختلفة و (2) استهداف فئات معينه من الخلايا. وعاده ما يتم تطبيق التحليلات النسيجية لتصور الجينات مراسل الفلورسنت أو فلوريسسينتلي الموسومة النانويه في مختلف المناطق العصبية وعبر أنواع الخلايا المختلفة ، التي حددتها المناعية لعلامات خليه مح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (IACUC) في معهد دانا فاربر للسرطان (البروتوكول رقم 16-024).

1-اعداد الحلول اللازمة للتجربة

  1. أعد 1x محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عن طريق تمييع 10x HBSS بالماء المعقم. قبل البرد الحل علي الجليد. هناك حاجه إلى 25 مل علي الأقل من الحل لكل عينه.
  2. اعداد محلول Percoll متساوي النظائر (IPS) عن طريق خلط 10x العقيمة HBSS 1:10 مع الكثافة التدرج المتوسط (اي Percoll). قبل البرد علي الجليد.
    ملاحظه: يمكن تخزين IPS لمده تصل إلى 30 يوما في 4 درجه مئوية.
  3. اعداد محلول التدفق الخلوي (FACS) حجب (BL) الحل (1 ٪ الزلال المصل البقري [جيش الصرب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قارننا طريقتين تجانس مختلفه (DH مقابل PD) تطبيقها علي الدماغ الماوس والحبل الشوكي ، لاختبار الكفاءة في استرداد أنواع الخلايا القابلة للحياة مختلفه مناسبه للتطبيقات المصب. للقيام بذلك ، قمنا باستغلال 9-لون تدفق لوحه الخلوي مصممه لتوصيف ، في نفس العينة ، وأنواع مختلفه من الخلايا العصبية بما في ذلك الكريات الصغيرة ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا العصبية ، astrocytes ، oligodendrocytes و بطانة.

تم استرداد انسجه المخ والنخاع الشوكي من فئران مختلفه (ن ≥ 6) ، وانقسمت في طولياين نصفيتين ، ووزنت وعولج.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نحن وصف بروتوكول لتنقيه المشتركة والمتزامنة تحليل التدفق الخلوي لبعض الخلايا العصبية الأكثر صله من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. تقليديا ، تم تطبيق التحليلات النسيجية لوصف توزيع الجسيمات النانويه أو كفاءه المحولات الفيروسية في CNS5،13، أو لتوفير رؤى حول التغيرات المورفولوجية والجزيئية التي تحدث في أنواع خلايا معينه خلال الامراض أو علي العلاج الدوائي14. ومع ذلك ، فان الانسجه تفتقر إلى التنظير ولا تسمح بالفحص الشامل لميزات متعددة في نفس ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مستشفي الأطفال بوسطن لبدء الأموال إلى A.B., ALSA منحه nr. IIP-343 إلى عضو البرلمان ، ومكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج بحوث التصلب الجانبي الضموري تحت الجائزة رقم W81XWH-17-1-0036 إلى عضو البرلمان ونحن نعترف DFCI تدفق الخلوية الاساسيه للدعم التقني.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (خالي من الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم وكبريتات المغنيسيوم)Gibco14185-052
مصفاة خلية 70 ممCorning431751
ACSA / ACSA2 الجسم المضاد للفأرMiltenyi Biotec130-117-535APC مصل
الأبقار المترافق الألبومينSigma AldrichA9647-1KG
CD11b الجسم المضاد للفئران المضاد للفأرInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 مترافق
CD31 الفئران الأجسام المضادة للفأرBD Bioscience562939BV421 المترافق
CD45 الفئران الأجسام المضادة للفأرBiolegend103138Brilliant Violet 510 المترافق
CD90.1 / Thy1.1 الفئران الأجسام المضادة للفأرBiolegend202518PE / Cy7 مترافق
CD90.2 / Thy1.2 الفئران المضاد للفئرانBiolegend1005325مترافقة PE / Cy7
(15 مل) أنابيبCellTreat 229411
(50 مل) مجموعةCellTreat
Dounce (تشمل الملاط بالإضافة إلى المدقة A و B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16 / CD32) كتلة الجسم المضاد للفئران المضادة للفئرانBD Pharmingen553142
مصل الأبقار الجنيني100-106
مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 المضادة للفأر / الفئران / الجسم المضاد البشريMiltenyi Biotec130-095-895البيوتين المترافق
PercollGE Healthcare10266569يباع على أنه كاشف غير معقم
PercollSigma65455529كاشف معقم (يستخدم للتطبيقات التي تتطلب العقم)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01يحتوي على آثار منخفضة جدا من
StreptavidinInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 مترافق
أنابيب مخروطية مخروطية مطحنة مناديل 229422 معيار كاشف السموم الداخلية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell IsolationTissue HomogenizationMouse BrainSpinal CordCell ViabilityCell YieldEnzymatic DigestionAntibody StainingCell Sorting

Related Articles