ويتيح نموذج المثانة الخالي من الدعامات امكانيه الوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال لدراسة أليات المحلية لتنظيم توافر الوسيط النشط بيولوجيا في بروبيوروثيلال/لأمينا بروبروا اثناء تخزين وتفريغ البول. التحضير يشبه بشكل وثيق ملء المثانة السليمة ويسمح باجراء دراسات حجم الضغط دون التاثيرات الجهازية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
A لامركزية (فيفو السابقين) نموذج المثانة Murine مع أزاله العضلات ديتروور للوصول المباشر إلى السوبوروثثيلال اثناء ملء المثانة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أدت هذه النتائج إلى الافتراض بأنه يتم أيضا إطلاق سراح هؤلاء الوسطاء في سوبيوروثثيلال (SubU)/لأمينا بروبرونا (LP) اثناء ملء المثانة ، حيث تؤثر علي الخلايا العميقة في جدار المثانة لتنظيم استثاره المثانة في نهاية المطاف. هناك ما لا يقل عن اثنين من القيود الواضحة في مثل هذه الدراسات: 1) اي من هذه النهج توفر معلومات مباشره عن وجود وسطاء في SubU/LP ، و 2) المحفزات المستخدمة ليست فسيولوجية ولا تلخص ملء أصيله من المثانة. هنا ، نناقش الاجراء الذي يتيح الوصول المباشر إلى سطح سوبوروثيليال من الغشاء المخاطي للمثانة في سياق ملء المثانة. الاعداد الخالي من الدعامات التي انشاناها بشكل وثيق يشبه ملء المثانة السليمة ويسمح باجراء دراسات حجم الضغط علي المثانة في غياب الإشارات المربكة من ردود الفعل الشوكية والعضلات الملساء. وباستخدام نموذج المثانة الخالي من الدعامات الجديدة ، أظهرنا مؤخرا انه لا يمكن استخدام القياسات المثانته للوسطاء كوكيل لما تم الإفراج عنه أو تقديمه في السوبو/LP اثناء ملء المثانة. يسمح النموذج بفحص جزيئات الإشارات المشتقة من اوروثيثيلال التي يتم إصدارها ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الأيض و/أو نقلها إلى السوبو/LP اثناء ملء المثانة لنقل المعلومات إلى الخلايا العصبية والعضلات الملساء للمثانة وتنظيم استثاره لها اثناء الزهد والولادة.
المقدمة
والغرض من هذا النموذج هو تمكين الوصول المباشر إلى الجانب تحت المخاطية من الغشاء المخاطي في المثانة خلال مراحل مختلفه من ملء المثانة.
يجب ان تمتنع المثانة عن الانكماش السابق لأوانه اثناء التعبئة والتفريغ عند الوصول إلى الحجم الحرج والضغط. غالبا ما ترتبط الزهد غير الطبيعية أو إفراغ البول مع استثاره غير طبيعيه للعضلات الملساء (DSM) في سياق ملء المثانة. يتم تحديد الاستثارة من DSM من قبل العوامل المتاصله في خلايا العضلات الملساء والتاثيرات المتولدة عن أنواع مختلفه من الخلايا داخل جدار المثانة. يتكون جدار المثانة البولية من اوروثيثيلال (الغشاء المخاطي) ، وسوبيوروثثيلال (سوبو)/لأمينا بروبروسا (LP) ، العضلات الملساء (DSM) و مصلي (الشكل 1a). يتكون المسالك البولية من خلايا شمسيه (اي الطبقة الخارجية لمجري البول البولي) ، والخلايا المتوسطة ، والخلايا القاعدية (اي الطبقة الأعمق من المسالك البولية). أنواع مختلفه من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الخلالي ، الليفية ، والمحطات العصبية الزبائ ، والاوعيه الدموية الصغيرة ، والخلايا المناعية الموجودة في subu/LP. ومن المفترض علي نطاق واسع ان المثانة البولية هو الجهاز الحسي الذي يبدا الزهد منعكس والإفراج عن وسطاء في الغشاء المخاطي الذي يؤثر علي الخلايا في subu/LP و DSM1,2,3. وتستند هذه الافتراضات في معظمها إلى الدراسات التي أظهرت إطلاق الوسطاء: من قطع الغشاء المخاطي المعرضة للتغيرات في الضغط الهيدروستاتيكي4,5; من الخلايا البولية المستزرعة المعرضة لتمتد6,7, الوتر الناجمة عن تورم الخلية7 أو سحب القوات8; من معزولة جدار المثانة شرائط علي مستقبلات أو تنشيط العصب9,10,11,12,13,14; وفي تجويف المثانة في نهاية المثانة ملء15،16،17،18،19. في حين ان هذه الدراسات كانت مفيده لإظهار الإفراج عن الوسطاء علي التحفيز الميكانيكي للأجزاء جدار المثانة أو الخلايا البولية المستزرعة ، فانها تحتاج إلى ان تكون مدعومة بادله مباشره للإفراج عن وسطاء في الغشاء المخاطي الذي يتم استخلاصه من قبل المحفزات الفسيولوجية التي تتكاثر ملء المثانة. هذه مهمة صعبه بالنظر إلى ان SubU/LP يقع عميقا في جدار المثانة يعوق الوصول المباشر إلى المنطقة المجاورة لل SubU/LP اثناء ملء المثانة.
هنا ، ونحن نوضح لامركزية (الجسم الغريب) نموذج المثانة murine مع أزاله العضلات deدعامات13 التي تم تطويرها لتسهيل الدراسات علي أليات المحلية للمحولات الميكانيكية التي تشارك في الإشارات بين المثانة البولية ، DSM وأنواع الخلايا الأخرى في جدار المثانة. ويمكن استخدامه لقياس التوافر ، والإفراج ، والتمثيل الغذائي والنقل الترانسوروثيليال للوسطاء في SubU/LP في مراحل مختلفه من ملء المثانة (الشكل 1B). ويمكن أيضا ان تستخدم اعداد لفحص الإشارات البولية والميكانيكية في نماذج من فرط نشاط ومتلازمات المثانة السفلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانية الموصوفة في هذه المخطوطة وفقا للدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية واللجنة المؤسسية لاستخدام ورعاية الماشية في جامعه نيفادا.
ملاحظه: النموذج المعروض هنا يتكون من أزاله العضلات العضلية في حين ان المسالك البولية وسوبو/lp تبقي سليمه (الشكل 1ب) لتمكين المحققين من الوصول المباشر إلى subu/lp في سياق ملء المثانة.
1. تشريح المثانة الحرة التحضير
- وضع المثانة المعزولة في صحن تشريح مليئه الباردة (10 درجه مئوية) والأوكسيجين مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2 krebs بيكربونات الحل (كال) مع التكوين التالي (مم): 118.5 Nacl, 4.2 Kcl, 1.2 mgcl2, 23.8 ناهكو3, 1.2 KH2PO4, 11.0 سكر العنب, 1.8 cacl2 (pH 7.4)13.
- دبوس جزء صغير من قبة المثانة المعزولة إلى صحن تشريح المغطية Sylgard مليئه بالنسبة لل. تاكد من ان دبوس يمر من خلال قطعه من مصلي أو الحافة الخارجية للعضلات العضلات بعيدا عن الحافة الأعمق للعضلات التي تواجه subu/LP.
- باستخدام المجهر ، حدد مجري البول والحالب ودبوس كل واحد منهم إلى الجزء السفلي من الطبق تشريح.
- أزاله الدهون الزائدة والانسجه الضامة بحيث يتم عرض الجسم الرئيسي بأكمله من المثانة ، ومجري البول والحالبين علي حد سواء.
- اربط الحالب مع خيوط النايلون 6-0. ثم ، دبوس نهايات مفتوحة من الحالب نحو الجزء السفلي من الطبق تشريح لتامين التحضير.
- باستخدام ملقط الطرف الرفيع ، اسحب قطعه من المصليين برفق في الزاوية بين الحالب وجسم المثانة.
- ضبط ضوء المجهر لزيادة الشفافية والتمييز بين هامش الغشاء المخاطي تحت العضلات ديتروور.
- بدء القطع (لا تقشير!) جدار المثانة مع مقص غرامه علي طول السطح الداخلي للطبقة العضلات في حين سحب بلطف قطعه قطع بعيدا عن الاعداد. في جميع الأوقات ، وضمان ان الحافة الجانبية من الغشاء المخاطي يمكن ان ينظر اليها وتجنب لمسها.
- أزاله العضلات deدعامات تماما عن طريق الدوران حول الطبق تشريح بحيث موقف التحضير هو مريح لمواصله تشريح العضلات deدعامات.
- اترك قطعه صغيره من العضلات علي قمة قبة المثانة لضمان القدرة علي شل الاعداد اثناء الخطوات المتبقية من البروتوكول.
- جعل حلقه مزدوجة من الخيط النايلون 6-0 ، وضعه حول الرقبة من اعداد المثانة ، وترك حلقه فضفاضة.
- أضافه حلقه مزدوجة ثانيه من الخيط الحرير 6-0 ، وضعه حول الرقبة من اعداد المثانة ، وترك حلقه تفقد. وجود اثنين من الغرز يمنع تسرب حول الغرز.
- قطع حوالي 2 سم من 20 PE الأنابيب (القسطرة) ، وإشعال الطرف عن طريق التحرك ببطء غيض علي مقربه من اللهب.
- أملا القسطرة بالأكسجين الدافئ (37 درجه مئوية).
- ادخل القسطرة في فوهه مجري البول وادفع القسطرة برفق حتى يصل طرف القسطرة إلى منتصف المثانة تقريبا.
- اربط الخيط حول القثطار والانسجه المحيطة بعنق المثانة.
- ببطء ملء المثانة مع حوالي 50-100 μL من الدافئة (37 درجه مئوية) الأوكسيجين الأكسجين ، ورفعه لفتره وجيزة (< 10 ثانيه) فوق سطح الجهاز ، ورصد للتسرب في الغرز والمثانة الجسم.
- وإذا لم يلاحظ حدوث تسرب ، فان الاعداد جاهز للتجربة. إذا لوحظ تسرب حول خياطه ، وأزاله خياطه واستبدالها. إذا لاحظت تسرب من ثقب في الجسم المثانة ، وتجاهل التحضير.
2. تعبئة التحضير للمعري المثانة
- Perfuse الكيلو (37 درجه مئوية) في غرفه 3 مل من الماء (37 درجه مئوية) صحن الجهاز مع القاع Sylgard.
- ضبط الأكسجين وخطوط الشفط.
- وضع اعداد المثانة المعري في الغرفة.
- تامين القسطرة إلى جانب الغرفة بحيث لا تطفو علي سطح الاعداد الحل ترويه.
- قم بتوصيل قسطرة المثانة بأنبوب PE20 أطول (خط ضخ) متصل بالطريقة الثلاثة محبس باستخدام نفس حجم المناسبة.
- تاكد من ان الخطوط بين مضخة ضخ ، ومحول الضغط والمثانة مفتوحة.
- ملء حقنه ضخ مع الطازجة والدافئة (37 درجه مئوية) والأوكسيجين.
- ضبط المعلمات مضخة: نوع/حجم الحقنه (اي ، 1 مل) ، عمليه (اي لبث) ، وتدفق (اي ، ثابت) ، ومعدل التدفق (اي ، 15 μL/min).
- اضغط علي زر أبدا علي مضخة حقنه لملء المثانة.
- رصد حجم التعبئة والضغط مثانة اثناء ملء المثانة.
3. الكشف عن وسطاء في الجانب SubU/LP من اعداد المثانة المعري
- جمع الارصفه من محلول الحمام في الجليد الباردة أنابيب الطرد المركزي أو اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC) ادراج.
- اعداد ومعالجه العينات وفقا لتطبيق الكشف المناسب. في حاله الكشف عن توافر البيورين ، ومعالجه العينات من قبل hplc مع الكشف عن الفلورية13،18.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الجدار من murine خاليه من المثانة اعداد خاليه سليمه ويحتوي علي جميع الطبقات باستثناء DSM و serosa. أظهرت الدراسات إثبات من المبدا ان الجدار المثانة DSM خاليه تشمل اوروثثيلال وسوبو/LP في حين ان موسكولاريس غلاله والمصلي غائبه (الشكل 2)13.
ملء المثانة الخالية من الدعامات يقترب من حشوه المثانة الطبيعية. ويظهر الشكل 3 مخططات الاعداد التجريبي ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المثانة لديها وظيفتين: تخزين وتفريغ البول. التشغيل العادي لهذه الوظائف يتطلب الاستشعار الميكانيكي السليم لحجم داخل ألومنيوم والضغط وتوصيل الإشارات من خلال الخلايا في جدار المثانة لتنظيم الاستثارة العضلية. ويعتقد ان الغشاء المخاطي المثانة (اوروثثيلال) لتنظيم استثاره المثانة عن طريق الإفراج عن مجموعه متنوعة من الجزيئات الإشارات في SubU/LP التي تؤثر علي أنواع عديده من الخلايا في جدار المثانة. وفي الوقت الحالي ، فان معظم محاولات توصيف الوسطاء المشتقين من المسالك البولية تنطوي علي استخدام مستحضرات المثانة (مثل صفائح المثانة ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد نشرت أجزاء من هذا العمل من قبل في مجلة علم وظائف الأعضاء (PMCID: PMC6418748; DOI: 10.1113/JP27692413). وقد منحت الاذن من قبل وآيلي وأولاده ، وشركه لاستخدام المواد من هذا المنشور. وليس لدي أصحاب البلاغ اي نزاعات مالية أو خلافات أخرى للكشف عنها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي وامراض الكلي المنحة DK41315.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| CaCl2< / sub> Fisher | C79 | المصدر مرن | |
| سكر العنب | فيشر | D16 | مصدر مرنة |
| دبابيس تشريح | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-20 | مصدر مضخة التسريب المرنة |
| كينت Scientific | GenieTouch | المصدر المرن | |
| KCl | Fisher | P217 | المصدر مرن |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Fisher | P284 | مصدر |
| مرن | مصدر SCHOTT ACEI | مجهر مرن | |
| أوليمبوس SZX7 | مرن لاستخدام أي نطاق | ||
| MgCl2< / sub> | Fisher | M33 | المصدر المرن |
| NaCl | Fisher | S671 | المصدر مرن |
| NaHCO3< / sub> | Fisher | S233 | مصدر إبر مرنة |
| 25G | Becton Dickinson | 305122 | مصدر مرن |
| حمام | مصدر مرن ؛ لقد صنعناها من طبق تشريح Radnoti | ||
| PE-20 أنابيب | Intramedic | 427405 | مصدر مرن |
| محول ضغط | AD | مصدر مرن | |
| S & T ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 00632-11 | مصدر برنامج مرن |
| للضغط والحجم | AD Instruments | Power lab | |
| خياطة نايلون ، 6-0 | AD الجراحي | S-N618R13 | مصدر خياطة حرير مرن |
| ، 6-0 | Deknatel عبر Braintree Scientific، Inc. | 07J1500190 | مرنة |
| 1 مل | Becton Dickinson | 309602 | المصدر مرن |
| Vannas Spring مقص | أدوات العلوم الدقيقة | 15000-08 | مصدر مرن |
| المياه Baxter | K-MOD 100 | مصدر مرن |
المراجع
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
