ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من الأقليات megfp-الموسومة-مستقبلات التي يسببها يجند ملزمه في غشاء البلازما من الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، فان بعض الطرق قابله للتطبيق للكشف عن احداث التجميع وقياس درجه التجميع. هنا ، ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من mEGFP-الموسومة-مستقبلات المتجانسات في غشاء الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B). N & B هو أسلوب مشابه للتحليل الطيفي للعلاقة الفلورية (FCS) والرسم البياني للعد الفوتون (PCH) ، والتي تستند إلى التحليل الإحصائي للتقلبات في كثافة الفلورية من الفلورية التي تنشر داخل وخارج الاضاءه حجم خلال فتره المراقبة. علي وجه الخصوص ، N & B هو تبسيط PCH للحصول علي معلومات عن متوسط عدد البروتينات في مخاليط القلة. وتوصف شده تذبذب الكثافة بالسطوع الجزيئي للفلوكوفيري ومتوسط عدد الفلوبوهورس داخل حجم الاضاءه. التالي ، لا يعتبر N & B سوي اللحظتين الاولي والثانية من توزيع السعه ، وهما متوسط الكثافة والتباين. هذا هو ، في الوقت نفسه ، وقوه وضعف الأسلوب. لأنه يتم النظر في لحظات فقط ، N & B لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكنه فقط يقدر متوسط حاله قله العدد من الخليط. ومع ذلك ، فانه يمكن تطبيقها علي سلسله زمنيه صغيره نسبيا (بالمقارنة مع أساليب لحظه أخرى) من الصور من الخلايا الحية علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد تقلبات الوقت من كثافة مضان. فانه يقلل من الوقت الفعلي لكل بكسل إلى بضعة ميكروثانية ، مما يسمح الاستحواذ في النطاق الزمني من ثوان إلى مللي ثانيه ، وهو أمر ضروري لحركيه القلة السريعة. وأخيرا ، يمكن استكشاف مناطق الخلايا الكبيرة وكذلك المقصورات شبه الخلوية.
المقدمة
ونحن وصف إجمالي انعكاس الداخلية الفلورية-عدد والسطوع (TIRF-N & B) نهج التصوير لتحديد متوسط الدولة القلة من جزيئات مستقبلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، وتهدف إلى ربط التجمع مستقبلات ديناميات الوظيفة البيولوجية للبروتينات (الشكل 1).
عند الربط خارج الخلية وملزمه ، والمستقبلات بدء محول الاشاره داخل الخلايا اعتمادا علي التشكيل الخاصة بهم ، والقلة ، والمستقبلات المشتركة المحتملة وتكوين الغشاء. علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، المعترف بها كحدث رئيسي في الإشارات الخلوية1،2،3،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اعداد العينات
- اليوم الأول البذور هيلا الخلايا في المتوسط الكامل في تركيز من 100000-200000 خليه/مل في الاطباق الزجاجية القاع. البذور 6-8 تكرار الاطباق.
ملاحظه: في هذا المثال ، يتم تكمله المتوسطة مع 10 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط مصل (الجندي) ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 100 U/100 ميكروغرام البنسلين/ستربتوميسين. ويتم اعداد العديد من الاطباق المتماثلة. - اليوم 2-3 عندما تكون الخلايا في الكونفلوينسي الفرعية ، transfect نصف الاطباق مع البلازميد البروتين والنصف الثاني مع مرجع البلازميدات (مونومر وديمير) ، في وسط خاليه من المصل.
ملاحظه: يرصد التحويل في المصل المتوسطة الحرة تستكمل مع المضادات الحيوية ، 0.1 ٪ ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
النتائج لاثنين من الخلايا الممثلة هيلا-mEGFP-FGFR1 المصنفة في نفس الطبق الثقافة وترد في الشكل 5 والجدول التكميلي 1. تم القبض علي الخليتين في وقت 0 دقيقه (الشكل 5a، اعلي) و 7 دقيقه (الشكل 5a، أسفل) بعد أضافه FGF2 ligand.
ويبين الشكل 5 أيضا نتائج خليتين من الخلاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
N & B يتطلب العديد من الاحتياطات في اختيار نموذج الخلية واستراتيجية وضع العلامات. ويمكن تطبيقه فقط علي الخلايا الحية التي لا تزال ملتزمه بثبات خلال وقت التقاط الصورة. ويمكن التعامل مع التقلبات الاضافيه الناجمة عن النزوح الجامد للخلية بأكملها مع نهج استعاده الصورة المناسبة38. ومع ذلك ، عموما عندما تتحرك الخلية ، وغشاء الخلية أيضا تشوات ، وتشوه هيكل ، وإنتاج الفرق الكبيرة الاضافيه ، ويدخل قيود خطيره علي تحليل البروتينات الغشائية. في هذا العمل ، يتم التعبير عن بناء الفلورسنت في خط الخلية هيلا لان FGF.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويدعم هذا المركز وزاره الاستخبارات والابتكار واليقع والمؤسسة المناصرة للمؤسسة الخيرية ، وهو أحد مراكز الامتياز في سيفيرو اوتشوا (سيف-2015-0505). ويدعمنا أيضا الصندوق الأوروبي للتنمية الاقليميه "Una manera de هاجر Europa". وتنوه جامعه كاليفورنيا بالدعم المقدم من الرابطة الايطاليه للبحث عن السرطان ، وجمعيه البحوث الدولية للسرطان (المعروفة الآن باسم بحوث السرطان في جميع انحاء العالم) ، ووزارة الصحة الايطاليه. وتقر تحكيم بان "مؤسسه بيانكا ديل مؤنتي دي لومباردي" لدعمها الجزئي لعمله مع الزمالة الكهروضوئية "Progetetetalita ايفانو Becchi" 2011-2012.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر مقلوب سريع 3 ألوان LEICA AM TIRF MC ، مع محاذاة TIRF أوتوماتيكية SMI. تم تجهيز المجهر بصمام ثنائي 488 نانومتر ليزر, 100x 1.46 زيت TIRF الهدف, مرشحات Ex / Em Bandpass في 490/20 و 525/50, درجة الحرارة / CO2< / sub> حاضنة وكاميرا Andor DU 8285 VP EMCCD. يتم تشغيل المجهر بواسطة برنامج Leica LIF. | Leica Microsystems، Wetzlar، ألمانيا | ||
| ألبومين من مصل الأبقار 98٪ minimun | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية | A7906-100G | |
| DMEM بدون فينول أحمر مع 25 ملي هيبس | جيبكو ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 21063029 | مصل مستخدم خال من المصل للفحص المجهري |
| DMEM عالي الجلوكوز GlutaMAX I | GIBCO THERMO FISHER Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10566-016 | تستخدم لكامل متوسط |
| الفوسفات المخزن الملحي 10x (PBS) Biowest | ، Nuaill & ، France | X0515-500 | |
| نظام تقسيم الانبعاثات القياسات الضوئية DV2 | TeledynePhotometrics ، توكسون ، أريزونا ، مصل | ||
| الأمريكي ، مؤهل ، البرازيل | GIBCO Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10270106 | مكمل مكمل معطل بنسبة 10٪ للوسط الكامل |
| قاع زجاجي 35 مم معقم 1.5 أطباق | MatTek ، Ashland ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | P35G-0.170-14-C | غير مطلي ، سمك الزجاج 0.17 ميكرون |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| عنق الرحم البشري (HeLa) ، خلايا مكون حيواني خال من المصل (AC) | Millipore-Sigma ECACC ، دارمشتات ، ألمانيا | CB_08011102 | |
| iXonEM + 897 EMCCD (إضاءة خلفية) كاميرا ANDOR التي يتم التحكم فيها بواسطة برنامج ANDOR Solis | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | تستخدم هذه الكاميرا, المثبتة في منفذ إضافي من المجهر, للحصول على N& السلسلة الزمنية B | |
| Matlab قابلة للتنفيذ N & الوحدة الروتينية B | للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، مدريد ، إسبانيا | تنزيل في https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks، Inc. ناتيك ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | https://www.mathworks.com/products/matlab.html< / a> | |
| Penicillin: Streptomycin لزراعة الأنسجة 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية | LONZA 17-602E | مكمل للمتوسط في Penicillin / Streptomycin 100 U / 100 & micro. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 وحدة ناقلات التعبير | لأبحاث الأورام النسائية ، المعهد الأوروبي للأورام IRCCS ، ميلانو ، إيطاليا | زاماي وآخرون ، 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI وحدة ناقلات التعبير | للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، مدريد ، إسبانيا | Hellriegel et al. ، 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI وحدة ناقلات التعبير | للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، مدريد ، إسبانيا | Hellriegel et al. ، 2011 | |
| المؤتلف FGF2 | PeproTech EC، Ltd. ، لندن ، المملكة المتحدة | حل Ligand: 20 نانوغرام / مل من FGF2 في PBS مكمل بنسبة 0.01٪ BSA. | |
| بيروفات الصوديوم GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | مكمل غذائي 1 ملي مولار |
| لكاشف الإرسال المتوسط TransIt-LT1 | MirusBio LLC ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر | GIBCO Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 25200056 | |
| سائل غمر من النوع F 10 مل | Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا | 11513 859 | |
| مكمل غذائي UltraPure BSA (50 مجم / مل) | غذائي ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1٪ للوسط بدون أحمر الفينول المستخدم في التعدين |
المراجع
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
