مقالة منهجية

تقدير الألياف الكولينية في النواة باساريس من Meynert من دماغ الفأر

DOI:

10.3791/60405

⸱

فبراير 5, 2020

 ,  , 
1Laboratory for Alzheimer's Disease and Aging Research, Kansas City Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Neurology, University of Kansas Medical Center, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center, 4The University of Kansas Alzheimer's Disease Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طول الألياف العصبية داخل بنية ثلاثية الأبعاد لمنطقة الدماغ هو معلمة موثوق بها لتحديد سلامة الخلايا العصبية الهيكلية محددة أو انحطاط. هذه المقالة تفاصيل طريقة القياس الكمي ستيريولوجية لقياس طول الألياف الكوليني داخل نواة basalis Meynert في الفئران كمثال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالباً ما يرتبط طول المحاور العصبية أو الكولينية الأخرى في مناطق الدماغ المختلفة بالوظيفة المحددة للمنطقة. Stereology هو وسيلة مفيدة لتحديد ملامح الخلايا العصبية من هياكل الدماغ المختلفة. هنا نقدم بروتوكول stereology القائم على البرمجيات لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في نواة basalis من Meynert (NBM) من الدماغ الأمامي القاعدي. تستخدم الطريقة مسبار كرة الفضاء لتقديرات الطول. يتم تصور الألياف الكوليني من قبل أسيتيل ترانسفيز الكولين (ChAT) التلطيخ المناعي مع الفجل بيروكسيديز-ديامينوبنزيدين (HRP-DAB) نظام الكشف. بروتوكول تلطيخ صالح أيضا لتقدير عدد الألياف والخلايا في مختلف مناطق الدماغ باستخدام برنامج stereology. يمكن استخدام بروتوكول الاستريولوجيا لتقدير أي ملامح خطية مثل الألياف الكولينوسيبتيفية ، الألياف الدوبامين / الكاتيوكولامينرجية ، الألياف السيروتونية ، عمليات الخلايا الفلكية ، أو حتى ملامح الأوعية الدموية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التقديرات الكمية لطول و / أو كثافة الألياف العصبية في الدماغ هي معلمات هامة للدراسات العصبية. غالباً ما يرتبط طول الكوليني, الدوبامين, ومحاور عصبية السيروتونية في مناطق الدماغ المختلفة مع وظائف محددة للمنطقة. لأن توزيع هذه المحاور غير متجانسة عموما، ويستخدم الاستريولوجية القائمة على التصميم لتجنب التحيز أثناء أخذ العينات. وقد تم تصميم مسبار كرة الفضاء من stereology لتوفير تدابير فعالة وموثوق بها من الهياكل مثل خط مثل الألياف العصبية في منطقة ذات أهمية1. يجعل المسبار كرة افتراضية يتم فرضها بشكل منهجي في الأنسجة لقياس تقاطعات الخطوط مع سطح المسبار. لأنه من المستحيل وضع تحقيقات الكرة في الأنسجة للتحليل ، فإن البرنامج المتاح تجاريًا يوفر كرة افتراضية ثلاثية الأبعاد (3D) ، وهي في الأساس سلسلة من الدوائر متحدة المركز ذات الأقطار المختلفة التي تمثل سطح مسبار الكرة.

التنكس العصبي الكوليني الانتقائي هو واحد من السمات الثابتة لمرض الزهايمر (AD)2،3،4. ويعتبر انتقال الكوليني المختل ة عاملا مسببا للتدهور المعرفي في AD. الخلل الكوليني هو واضح أيضا في العديد من الاضطرابات النفسية الأخرى مثل باركنسون, الإدمان, وانفصام الشخصية. تتم دراسة جوانب مختلفة من التنكس العصبي الكوليني في النماذج الحيوانية (على سبيل المثال، الحد من أستيل5، بروتين كات6، التنكس العصبي الألياف الكولينية في محيط لويحات اميلويد6، وانخفاض في الألياف الكولينية والدوالي متشابك7،8). ويعتقد أن انحطاط الألياف يحدث في وقت سابق من فقدان الخلايا العصبية, لأن فقدان الخلايا العصبية الكولينية لا لوحظ دائما في الدراسات. معظم الخلايا العصبية الكولينية في الدماغ القاعدي وجذع الدماغ، ومحاورهم المحورية مشروع إلى مناطق مختلفة في الدماغ مثل القشريات والحصين. يقع NBM في الدماغ الأمامي القاعدي ووجد أنه أحد مناطق الدماغ المصابة بشكل شائع في AD.

ويستند أسلوب كسور من stereology على أخذ العينات العشوائية منهجية من الأنسجة على مستويات متعددة. قسم أخذ العينات الكسر (SSF) هو أخذ العينات المنهجية غير المستندة إلى الكمبيوتر من المقاطع لطريقة كسور من stereology. كسر أخذ عينات المنطقة (ASF) هو كسر منطقة من المنطقة ذات الاهتمام في القسم. سمك كسر أخذ العينات (TSF) هو كسور في سمك مقطع. يسمح لنا مسبار كرة الفضاء بتحديد ملامح الاهتمام في كرة ثلاثية الأبعاد في مواقع مجزأة. هنا نستخدم مسبار كرة الفضاء لتقدير الطول الإجمالي للألياف الكوليني في NBM من دماغ الماوس لتوضيح الإجراءات. يوفر البروتوكول الحالي تفاصيل حول معالجة الأنسجة ، وطرق أخذ العينات لعلم الستريولوجيا ، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية باستخدام الأجسام المضادة ChAT ، والستيريولوجية غير المتحيزة لتقدير طول الألياف الكولينية وكثافة الألياف في NBM من دماغ الماوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع إجراءات استخدام هذه الحيوانات من قبل لجنة الرعاية والاستخدام الطبي للمحاربين القدامى في مدينة كانساس سيتي. الفئران البالغة من العمر ثمانية عشر شهرا المبالغة في التعبير عن السويدية متحولة بيتا اميلويد بروتين السلائف (APPswe) وC57/BL6 WT littermates استخدمت للتجارب. وترد تفاصيل التربية والجينية في He et al.8.

1. الترويج ومعالجة الأنسجة

  1. تحقن الفئران باستخدام حقنة داخل البلاق مع الكيتامين (100 ملغ/كغ) وإكسيلازين (10 ملغ/كغ). قرصة إصبع ان ما يؤكد عدم استجابة قبل الاستمرار9.
  2. Transcardially perfuse مع ~ 50 مل من الجليد البارد0.1M دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS) تليها 4٪ paraformaldehyde (PFA) في 0.1M فوسفات العازلة (PB)10.
    تنبيه: PFA سامة. استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) عند العمل مع PFA.
  3. إزالة العقول10 وتزج في 4٪ PFA في 0.1 M PB في 4 درجة مئوية لتثبيت ما بعد التثبيت لمدة 24 ساعة غسل مع DPBS 3x.
  4. تغيير إلى 15٪ محلول السكروز في 0.1 DPBS بين عشية وضحاها ثم 30٪ محلول السكروز في 0.1 M DPBS لمدة 48 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
  5. إزالة الأنسجة من محلول السكروز وتجميد في غرفة بوتومي مسبقا إلى درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات المجمدة في أنابيب مختومة عند -80 درجة مئوية حتى القسمة.
  6. تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى تضمين المتوسطة (انظر جدول المواد)وجبل على قرص عينة. قطع المسلسل 30 ميكرومتر أقسام سميكة في طائرة كورونا باستخدام cryotome وجمع جميع الأقسام وبالتالي في 24 لوحات ثقافة جيدة مليئة محلول cryoprotectant (30٪ الجلسرين، 30٪ جلايكول الإيثيلين، 40٪ DPBS؛ الشكل 1A-C). تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يُفضل وضع أقسام أكثر سمكاً (على سبيل المثال، 50 ميكرومتر) عندما يكون ذلك ممكناً. تأكد من أن يتم الاحتفاظ المقاطع في ترتيب القطع وجميع الأقسام تماما في cryoprotectant. يمكن استخدام لوحة بئر 96 كبديل للوحات الآبار 24 لجمع المقاطع.
  7. تغطية الآبار مع لوحة السدادة لمنع التبخر والتجفيف. تخزين لوحات في -20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الأقسام المخزنة في -20 درجة مئوية مستقرة لعدة أشهر لChAT الكيمياء المناعية.

2. اختيار قسم منهجي للسنة الدولية للخدمات الإنسانية

ملاحظة: ينبغي إجراء دراسة تجريبية لمعرفة العدد الإجمالي للأقسام اللازمة لتحقيق معامل مقبول للخطأ (CE). قيمة CE هو تعبير عن المبلغ الإجمالي للخطأ في إجراء أخذ العينات. تمثل القيمة الأدنى الحد الأدنى من الخطأ وتعتبر قيمة CE أقل من 0.1 مقبولة من قبل البرنامج المستخدم هنا (انظر جدول المواد)11.

  1. حدد الأقسام الأولى والأخيرة لكل دماغ من خلال مقارنة الميزات المورفولوجية مع أطلس دماغ الماوس القياسي مثل فرانكلين وباكسينوس. NBM يبدأ في bregma -0.0mm وينتهي في -1.6 ملم. لذلك، يحتوي حوالي 50 أقسام NBM. العدد الإجمالي للأقسام هو واحد من المعلمات المطلوبة أثناء stereology. أعطى اختيار كلقسم 8 (SSF = 1/8) ما مجموعه 6-7 أقسام للتحليل وأسفر عن CE مقبول لكل من تقدير الحجم وتقدير طول الألياف في دراستنا التجريبية.
  2. تبدأ عشوائيا مع واحد من الأقسام الثمانية الأولى ومن ثم عينة بشكل منهجي كلقسم 8 حتى المقطع الخلفي الأخير الذي يحتوي على NBM(الشكل 1C).

3- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية

  1. نقل المقاطع cryopreserved إلى درجة حرارة الغرفة في cryoprotectant ومن ثم 0.1M الفوسفات عازلة (PB) في 6 لوحات بئر.
  2. غسل 3x في PB.
  3. احتضان في 0.3٪ H2O2 في الميثانول لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل 3x في تريس العازلة المالحة (TBS).
  5. احتضان في 0.25٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
  6. كتلة مع 10٪ مصل البقر العادي (NBS) في 0.1٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 30 دقيقة.
  7. احتضان مع تخفيف 1:1،000 من الأجسام المضادة المضادة للماعز المضادة للإنسان ChAT (انظر جدول المواد)في TBS مع 0.1٪ تريتون X-100 و 1٪ NBS لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
  8. غسل 3x في TBS في درجة حرارة الغرفة. قم بأداء جميع الاحتضان والغسيل في درجة حرارة الغرفة.
  9. احتضان مع biotinylated الأبقار المضادة للماعز الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد)لمدة 1 ساعة.
  10. غسل 3x في TBS.
  11. احتضان مع مجمع أفيدين-البيوتين-بيروكسيديز (انظر جدول المواد).
  12. غسل 3x في TBS.
  13. تطوير باستخدام حل الركيزة الركيزة الركيزة DAB تعزيز (انظر جدول المواد)وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
    تنبيه: DAB هو مادة مسرطنة مشتبه بها. وهو سام عن طريق الاتصال والاستنشاق. استخدام معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع DAB.
  14. غسل القسم بضع مرات مع الماء المقطر والاحتفاظ بها في درجة الحموضة تريس = 7.6.
  15. قم بتركيب المقاطع على الشرائح الجيلاتية. يمكن وضع جميع المقاطع من نسيج واحد على نفس الشريحة. الهواء الجاف للأقسام، وتجفيف 2x لمدة 5 دقيقة مع كل 70٪، 90٪، 95٪، و الإيثانول 100٪، ومن ثم مسح الأقسام مع اثنين من 10 دقيقة xylene غسل. Coverslip المقاطع باستخدام وسط تصاعد (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: وقت معالجة الجفاف والمقاصة يؤثر على سمك المقاطع. لذلك، يجب استخدام نفس الشروط لكافة الأقسام. وفي الدراسة الحالية، كان متوسط قيمة السماكة النهائية 21.11 ± 0.45 ميكرومتر.
  16. إبقاء المقاطع في غطاء الدخان لتجف. المقاطع الجافة جاهزة للاستريولوجيا.

4. Stereology

ملاحظة: راجع جدول المواد للمجهر والبرامج المستخدمة. سيكون هدف الغمر مع فتحة رقمية (NA) > 1.2 مفيدًا ويجب استخدامه إذا لزم الأمر. يجب تجميع الشرائح وفقًا للنمط الجيني أو مجموعة المعالجة وترميزها. يجب أن يتم إجراء التجسيد الكامل لدراسة واحدة من قبل نفس الشخص ويجب أن يكون الشخص الذي يقوم بعلم الاستريولوجية أعمى عن هوية الشرائح الفردية أو المجموعة التي تم فحصها1،12،13.

  1. فتح دراسة جديدة في البرنامج. (ملف> دراسة جديدة). سيتم فتح مربع حوار'تهيئة الدراسة'. ملء معلومات الدراسة، وذلك باستخدام مستويات متعددة (أساس الكسر)(الشكل 2A).
  2. انقر نقرًا مزدوجًا على"وحدة التخزين"ضمن المعلمات، والتي ستفتح مربع حوار وحدة التخزين. قم بتسمية ميزة الاهتمام وحدد ' منطقةعد نقطة' التحقيق. انقر فوق التالي.
  3. انقر نقرا مزدوجا على المعلمة التالية،'طول'.
    1. توفير اسم الميزة (على سبيل المثال،'L')حدد 'اسفير'التحقيق وانقر فوق التالي.
  4. بعد ذلك، انقر على مربع الحوار"دراسة التهيئة"،الذي سيفتح مربع"تهيئة الحالة". ملء معلومات الحالة. يجب ترميز المجموعات قبل بدء الدراسة. العدد الإجمالي للأقسام هو عدد الأقسام التي تبدأ من القسم الأول الذي يحتوي على منطقة الاهتمام إلى القسم الأخير الذي يحتوي على مجال الاهتمام (انظر الخطوة 2.1). الفاصل الزمني لأخذ العينات القسم هو ثمانية، لأنه تم اختيار كل قسم8 لتلطيخ المدينة العالمية للخدمات الإنسانية.
  5. يؤدي النقر فوق التالي إلى فتح مربع الحوار"تهيئة المسبار"،والذي سيقوم تلقائيًا بتعيين أدنى تكبير لاختيار المنطقة وتقدير الحجم. تأكيد الإعدادات والتحقق مما إذا كان يمكن تحديد المنطقة ذات الاهتمام في التكبير المنخفض المحدد. انقر نقرًا مزدوجًا على"الحجم" وملء 50,000 ميكرومتر3 لكل نقطة لكسر حجم المنطقة. انقر فوق "تم".
  6. تحت الكائن (عالية) التكبير، تعيين الطول في 63x أو 100x. انقر نقرا مزدوجا على'طول'لفتح مربع الحوار طول المجال وتعيين قطر الكرة إلى 10 ميكرومتر. انقر فوق القيام به.
    ملاحظة: يجب تحديد منطقة الحراسة استناداً إلى السماكة الفعلية للمقاطع. يجب على المشغل التحقق من سماكة الأقسام في مواقع متعددة لتجنب أي ضرر. إذا لزم الأمر، ضبط سمك منطقة الحراسة على أساس سمك القسم.
  7. تعيين القيم المناسبة لمنطقة الإطار وارتفاع الإطار ومنطقة الحراسة وتباعد الإطار.
    ملاحظة: تعتمد هذه القيم على عدم تجانس ملامح الكائن (الألياف) في منطقة الدراسة. مساحة الإطار من 400 ميكرومتر2،وارتفاع الإطار من 10 ميكرومتر، ومنطقة حراسة من 2 ميكرومتر، وتباعد الإطار من 300 ميكرومتر يعطي قيم CE مقبولة لتقدير طول الألياف في NBM. يجب إجراء دراسة تجريبية بهذه القيم قبل التوجه إلى الحالة التالية.
  8. اتبع التعليمات المقدمة من البرنامج بعد كل خطوة. تظهر الإرشادات إما كمربع حوار و/أو في الجزء السفلي من الشاشة.
  9. إدراج القسم 1.
  10. عند التكبير المنخفض (5x)، حدد منطقة الاهتمام من خلال جعل حدود عشوائية حول NBM. انقر على الزر التالي في الزاوية اليسرى من نافذة الفيديو. اتبع التعليمات وتأكد من أن جميع النقاط الخضراء موجودة في NBM. يمكن تضمين النقاط أو استبعادها من خلال النقر على النقاط.
    ملاحظة: لا توجد حدود محددة تعيين حول NBM. يتم تحديد الاختيار في الغالب من قبل المحقق. يمكن ملاحظة الخلايا العصبية ChAT + الكوليني لـ NBM في الكبسولة الداخلية (ic) وglobus pallidus (GP). في هذا البروتوكول ، يتم تضمين ic مع ChAT + الخلايا العصبية الكولينية وإسقاطاتها (الألياف) وGP كله في NBM(الشكل 1D).
  11. اتبع التعليمات والتغيير إلى 63x لقياسات الألياف في الكسر الحالي. يظهر مربع الحوار'سمك القسم'على الشاشة. تعيين السطح العلوي والسفلي للقسم لقياس السماكة الفعلية للقسم. يجب استخدام حركة محور Z اليدوية. انقر على القيام به.
    ملاحظة: إذا لم يكن هناك ألياف في المنطقة، يمكن تخطي الخطوة للانتقال إلى موقع الكسر التالي.
  12. حرك محور Z ببطء من الأعلى إلى الأسفل في ارتفاع الإطار للقسم ووضع علامة على جميع الألياف المتقاطعة على سطح مسبار الكرة الظاهري(الشكل 3). عند الانتهاء، انقر فوق التالي للانتقال إلى الموقع التالي.
  13. بعد الانتهاء من جميع الكسور ، سيطلب البرنامج إدراج القسم التالي. كرر الخطوات 4.9-4.12 لجميع الأقسام الستة أو السبعة من الأنسجة.
    1. في النهاية ، سيقوم البرنامج بإنشاء نتيجة للحالة تظهر قيم CE(الشكل 4). إذا كان CE مقبولاً، انتقل إلى الحالة التالية. ملف > حالة جديدة. إذا CE غير مقبول(الشكل 4A)، يوفر البرنامج توصيات لتغيير بعض المعلمات. في كثير من الحالات، تقليل تباعد الإطار يقلل من قيم CE إلى نطاق مقبول(الشكل 4B).
  14. بعد الانتهاء من جميع الحالات، وتوليد نتائج لكل حالة ومجموعة(ملف > النتائج).

5 - التحليل والإحصاءات

  1. يوفر البرنامج بيانات لكل عينة وكل مجموعة. يقوم البرنامج نفسه بحساب الكسور مثل SSF و ASF و TSF ، ويوفر الحجم المرجعي الإجمالي (VREF)والطول الإجمالي (L) للألياف في المنطقة المرجعية (في هذه الحالة ، NBM) (الشكل 4B). تصدير البيانات وحفظها أو نسخها إلى البرنامج الإحصائي المفضل بين تحليل المجموعة. ويبين الجدول 1 بيانات النتائج النموذجية للتحليل الإحصائي. تحليل كثافة الألياف (Lv) عن طريق تقسيم إجمالي طول الألياف مع الحجم المرجعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترد النتائج التمثيلية في الجدول 1 والشكل 5. المجموعة C، التي تم فك رموزها كمجموعة APPswe (APP)، كان لها طول ألياف أقل بكثير(الشكل 5B)وكثافة طول الألياف(الشكل 5C)مقارنة بنوعها البري (WILD) القمامة. وأظهرت النتائج أنه لم يكن هناك فرق كبير في حجم البنك الوطني الأول بين المجموعتين اللتين تم تحليلها(الشكل 5A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نشرح طريقة لتقدير كثافة الألياف الكولينية في NBM باستخدام مسبار كرة الفضاء (الكرة). يقدر هذا المسبار إجمالي طول الألياف في المنطقة ذات الاهتمام. يمكن تقسيم الطول الإجمالي على حجم المنطقة للحصول على كثافة الألياف. ولتقدير حجم المنطقة، استُخدمت طريقة عدد نقاط كافاليري. طريقة عدد نقاط كافالييري هي مقدر غير متحيز وفعال لحجم مرجعي ثلاثي الأبعاد لأي منطقة. تقوم الطريقة بحساب تقدير المساحة على سطح قطع مقطع عن طريق عد النقاط (التي تمثل كسور المنطقة) ثم الضرب بالمسافة بين قسمين تم تحليلهما11. لا تتطلب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى W.Z.S. من دائرة البحث والتطوير الطبي، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (مراجعة الجدارة 1I01 BX001067-01A2)، وجمعية الزهايمر (NPSPAD-11-202149)، وموارد من الغرب الأوسط الطبية الحيوية مؤسسة البحوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة ABCمختبرات ناقلاتPK6100
الأجسام المضادة ل ChATMillipore ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةAB144P
الأبقار المضادة للماعز IgG-BSantacruz BiotechnologySC-2347
مصل البقر ، الكبارSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةB9433
CryostatLieca Microsystems ، بوفالو جروف ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية
Dulbecco's Fossil Buffered SalineSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةD5652
الإيثيلين جلايكولسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية324558
الجلسرينسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةG2025
بيروكسيد الهيدروجينسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةH1009
مجموعة Immpact-DABمختبرات ناقلاتSK4105ركيزة بيروكسيداز DAB
المحسن الكيتامينويستوارد المستحضرات الصيدلانية ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية0143-9509-01
مجهرLieca Microsystems ، بوفالو جروف ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكيةAF6000مجهزة بمرحلة آلية وكاميرا رقمية ملونة IMI-tech
درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) تضمينمتوسطة علوم المجهر الإلكتروني ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية62550-12
بارافورمالديهايدسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP6148
Permount تصاعد متوسطعلوم المجهر الإلكتروني ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية17986-01
Stereologer SoftwareStereology Resource Center، Inc. سانت بطرسبرغ ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةStereologer2000مثبتة على جهاز كمبيوتر مكتبي من Dell.
Triton X-100Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT8787
Trizma BaseSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT1503قاعدة تريس
Trizma هيدروكلوريدSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT5941تريس هيدروكلوريد
زيلازينباير ، ليفركوزن ، ألمانياRompun
Xylenes ، الصفSigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO534056
محلول النسيجي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
  2. Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
  3. Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403(1976).
  4. Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
  5. Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
  6. Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
  7. Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  8. He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116(2016).
  9. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  10. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  11. Mouton, P. R. Unbiased Stereology-A Concise Guide. , Johns Hopkins University Press. (2011).
  12. West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
  13. West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49(2018).
  14. Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
  15. Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
  16. Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).
  17. Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268(2019).
  18. McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
  19. Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
  20. Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38(2018).
  21. Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ChAT HRP DAB

مقالات ذات صلة