هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للحث علي ارتفاع ضغط الدم العين والضمور العصبي الزرق في عيون الفار عن طريق حقن انتراكاميرال من زيت السيليكون والاجراء لأزاله زيت السيليكون من الغرفة الاماميه للعودة ضغط العين مرتفعه العاديه.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والسيليكون عكسها الناجمة عن النفط العين ارتفاع ضغط الدم النموذج في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ارتفاع ضغط العين (IOP) هو عامل خطر موثقه جيدا لزرق. هنا نحن وصف رواية ، طريقه فعاله للحث باستمرار مستقره IOP الارتفاع في الفئران التي تحاكي مضاعفات ما بعد الجراحة من استخدام زيت السيليكون (SO) كعامل تاموناد في جراحه شبكيه الإنسان. في هذا البروتوكول ، يتم حقن SO في الغرفة الاماميه للعين الماوس لمنع التلميذ والحيلولة دون تدفق الفكاهة المائية. الغرفة الخلفية تتراكم الفكاهة المائية وهذا بدوره يزيد من IOP من الجزء الخلفي. وتنتج حقنه واحده SO الارتفاع الموثوق بها ، وكافيه ، ومستقره IOP ، والتي تؤدي إلى الضمور العصبي جلوكوكاتوس كبيره. هذا النموذج هو تكرار حقيقي من الزرق الثانوي في عيادة العين. لمزيد من تقليد الاعداد السريرية ، SO يمكن ازالتها من الغرفة الاماميه لأعاده فتح مسار الصرف الصحي والسماح تدفق الفكاهة المائية ، والتي يتم تصريفها من خلال العمل المشصي (TM) في زاوية الغرفة الاماميه. لان IOP يعود بسرعة إلى طبيعتها ، ويمكن استخدام النموذج لاختبار تاثير خفض IOP علي الخلايا العقديه الشبكية جلوكوكاتوس. هذا الأسلوب هو واضح ، لا يتطلب معدات خاصه أو تكرار الإجراءات ، يحاكي عن كثب الحالات السريرية ، ويمكن ان تكون قابله للتطبيق علي الأنواع الحيوانية المتنوعة. ومع ذلك ، قد يلزم اجراء تعديلات طفيفه.
المقدمة
الفقدان التدريجي للخلايا العقدة الشبكية (RGCs) والمحاور الخاصة بهم هو السمة المميزة للجلوكوما ، وهو مرض عصبي شائع في شبكيه العين1. وسوف تؤثر علي أكثر من 100,000,000 الافراد 40 − 80 سنه من قبل 20402. ولا يزال البرنامج هو عامل الخطر الوحيد القابل للتعديل في تطور الزرق وتطوره. من أجل استكشاف المرض ، والتقدم ، والعلاجات المحتملة من الجلوكوما ، ويمكن الاعتماد عليها ، واستنساخها ، ومحفز العين التجريبية ارتفاع ضغط الدم/الزرق النموذج الذي يتطابق مع السمات الرئيسية للمرضي البشر أمر حتمي.
يعتمد IOP علي تدفق الفكاهة المائية إلى الغرفة الاماميه من الجسم الهالهاري في الغرفة الخلفية والتدفق من خلال العمل المشصي (TM) في زاوية الغرفة الاماميه. عند الوصول إلى حاله مستقره ، يتم الحفاظ علي IOP. وعندما يتجاوز التدفق الوافد أو يقل عن التدفق الوافد ، يرتفع البرنامج أو ينخفض علي التوالي. من خلال خفض تدفق مائي اما عن طريق انسداد زاوية الغرفة الاماميه أو عن طريق اتلاف TM ، وقد أنشئت عده نماذج الجلوكوما3،4،5،6،7،8،9،10. وترتبط هذه النماذج عاده مع تلف انسجه العين لا رجعه فيه ، وارتفاع IOP في الغرفة الاماميه أيضا يسبب مضاعفات غير المرغوب فيها مثل وذمه القرنية والتهاب العين ، مما يجعل التصوير الشبكية والبصريات وظيفة الاختبارات صعبه لأداء وتفسير.
لتطوير نموذج يتغلب علي أوجه القصور هذه ، ركزنا علي الزرق الثانوي الجيد الموثق الناجم عن زيت السيليكون (لذلك) الذي يحدث كمضاعفات ما بعد العملية الجراحية لجراحه الشبكية البشرية11،12. لذلك يتم استخدامها كدك في العمليات الجراحية في الشبكية بسبب التوتر سطحه عاليه. ومع ذلك ، يمكن لذلك جسديا اوككلودي التلميذ لأنه أخف من السوائل المائية والزجاجية ، مما يمنع التدفق المائي إلى الغرفة الاماميه. تسبب العرقلة ارتفاع IOP في الغرفة الخلفية بسبب تراكم الفكاهة المائية. هذا دافع لنا لتطوير وتوصيف نموذج الماوس ارتفاع ضغط الدم العين الجديدة علي أساس الحقن انتراكاميرال SO وكتله حدقة13, مع السمات الرئيسية للجلوكوما الثانوية: كتله العفن فعاله, ارتفاع iop الكبيرة التي يمكن ان تعود إلى وضعها الطبيعي بعد أزاله SO, والضمور العصبي جلوكوكاتوس.
هنا نقدم بروتوكولا مفصلا لارتفاع ضغط الدم العين المستحثة في عينه الماوس ، بما في ذلك حقن وأزاله وقياس IOP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تمت الموافقة علي جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية (IACUC) من جامعه ستانفورد.
1. العين ارتفاع ضغط الدم التعريفي عن طريق حقن انتراكاميرال من SO
- جهزي الماصة الزجاجية لانتراكاميرال بالحقن بواسطة سحب الشعرية الزجاجية مع ساحبه ماصه لتوليد الماصات المجهرية. اقطع فتحه عند طرف الماصة الصغيرة وقم بزيادة شحذ الطرف باستخدام اله المطحنة الصغيرة لجعل مجسم مشطوف الحواف 35 ° − 40 °.
- صقل حواف المجسم وأزاله جميع الأنقاض عن طريق الغسل بالماء. الاوتوكلاف ميكروماص قبل الاستخدام.
- اعداد ابره البزل لدخول القرنية. للقيام بذلك ، نعلق ابره 32 G إلى حقنه 5 مل علي قفل Luer ، وكذلك تامينه مع الشريط. ثني الابره طرف شطبه الوجه حتى في 30 درجه.
- اعداد حاقن SO عن طريق ربط وتامين نهاية حاده 18 ز ابره علي حقنه 10 مل أولا. ثم نعلق أنبوب من البلاستيك مع ابره 18 ز علي نهاية واحده وتملا مع ذلك حسب الحاجة من خلال الطرف الآخر.
- قم بتوصيل الماصة المجهرية المعقمة بالأنبوب البلاستيكي وادفع المكبس المحقنة لملء الماصة المجهرية بالبالكامل مع SO.
2. حقن انتراكاميرال SO للعين واحده
- وضع الماوس C57B6/J الذكور 9 − 10 أسبوعا في غرفه الحث مع 3 ٪ ايزوفلواني مختلطة مع الأكسجين في 2 لتر/دقيقه لمده 3 دقائق.
- حقن داخل الجسم 2, 2, 2-تريبروموثانول في 0.3 mg/g الوزن.
ملاحظه: علي عكس الكيتامين/اكسيليازين ، 2 ، 2 ، 2-تريبروموثانول لا يسبب تمدد التلميذ واضحة. - التحقق من عدم وجود استجابه لقرصه اصبع القدم وعدم وجود حركه من شعيرات أو الذيل لتحديد قوه التخدير.
- ضع الماوس في وضع أفقي علي منصة الجراحة. للحد من حساسيتها اثناء العملية ، تطبيق قطره واحده من 0.5 ٪ هيدروكلوريد بروباراغين إلى القرنية قبل الحقن.
- اجراء شق إدخال مع 32 G بارابزل الابره في الربع superotemporal ، حوالي 0.5 ملم من limbus.
- نفق من خلال طبقات من القرنية لحوالي 0.3 مم قبل ثقب في الغرفة الاماميه. يجب الحرص علي عدم لمس العدسة أو القزحية.
- سحب الابره ببطء للإفراج عن بعض الفكاهة المائية (حوالي 1 − 2 μL) من الغرفة الاماميه من خلال النفق (البزل).
- انتظر ~ 8 دقيقه لمزيد من خفض IOP. ويمكن تحديد هذا عن طريق قياس المعاكس ، ومراقبه العين.
- قم بإدخال الماصة الزجاجية المحملة مسبقا مع SO من خلال نفق القرنية إلى الغرفة الاماميه ، مع الشطب الذي يواجه سطح القزحية.
- دفع المكبس حقنه ببطء لحقن ذلك في الغرفة الاماميه حتى القطرات حتى يغطي معظم سطح القزحية ، ~ 2.3 − 2.4 ملم في القطر.
- اترك الماص المجهري في الغرفة الاماميه لمده 10 ليالي أكثر قبل سحبه ببطء.
- دفع بلطف الجفن العلوي لإغلاق شق القرنية للحد من تسرب ذلك.
- تطبيق مرهم المضادات الحيوية (باكيتراسين-نيوميسين-بوليميكسين) إلى سطح العين.
- في جميع انحاء الاجراء ، وكثيرا ما ترطيب القرنية مع الدموع الاصطناعية.
- الحفاظ علي الماوس علي وساده التدفئة حتى تعافي تماما من التخدير.
3. أزاله SO
- اعداد نظام الري.
- اعداد محلول الري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ووضعه في زجاجه الري. رفع زجاجه محلول الري إلى 110 − 120 سم (81 − 88 مم زئبق) فوق منصة الجراحة.
- قم بإرفاق الاداره الرابعة بزجاجه محلول الري. أزاله فقاعات الهواء من الأنابيب IV. ربط ابره 33 G عازمه علي الوجه 20 ° تصل إلى أنابيب IV.
- لاعداد نظام الصرف الصحي ، وأزاله المكبس من حقنه 1 مل. نعلق ابره 33 G إلى حقنه وثني الابره إلى 20 درجه.
- أزاله SO من الغرفة الاماميه.
- حقن داخل الصفاق 2, 2, 2-تريبروموثانول (0.3 mg/g وزن الجسم). التحقق من عدم وجود استجابه لقرصه اصبع القدم لتحديد قوه التخدير وعدم وجود حركه من شعيرات أو الذيل.
- ضع الماوس علي منصة الجراحة وأمنها في الوضع الجانبي مع الشريط. تطبيق قطره واحده من 0.5 ٪ هيدروكلوريد بروباراغين إلى القرنية للحد من حساسيتها.
- جعل اثنين من الشقوق في الربع الزمني من القرنية بين ~ 2 و 5 الساعة علي حافه قطره SO باستخدام الابره 32 G بارابزل المسبقة الصنع.
- ادخل ابره الري 33 G المتصلة بمحلول الري من خلال شق القرنية واحد ، السرعة القصوى.
- ادراج آخر 33 G الصرف ابره تعلق علي حقنه دون الغطاس من خلال شق القرنية الأخرى للسماح قطره SO للخروج من الغرفة الاماميه في حين ري مع محلول الري.
- سحب ابره الصرف ، ثم ابره الري.
- حقن فقاعه الهواء في الغرفة الاماميه للحفاظ علي عمقها الطبيعي والصحافة لإغلاق شق القرنية.
- تطبيق مرهم المضادات الحيوية علي كلا العينين.
- الحفاظ علي الماوس علي لوحه الانتعاش التدفئة حتى تعافي تماما من التخدير.
4. قياس IOP مره واحده في الأسبوع
- وضع الماوس في غرفه التعريفي perfused مع 3 ٪ ايزوفلواني مختلطة مع الأكسجين في 2L/min لمده 3 دقائق.
- حقن اكسيليازين والكيتامين داخل الصفاق (0.01 ملغ اكسيليازين/ز ، 0.08 ملغ كيتامين/غرام).
- الحفاظ علي القرنية رطبه عن طريق تطبيق الدموع الاصطناعية طوال العملية.
- انتظر حوالي 15 دقيقه للسماح للتلاميذ لتمدد تماما.
- قياس iop من كلا العينين باستخدام مقياس توتر وفقا لتعليمات المنتج. احضر المقياس بالقرب من عين الفار الحفاظ علي المسافة من غيض من المسبار إلى القرنية الماوس في حوالي 3 − 4 ملم. اضغط علي زر القياس 6x لتوليد قراءه واحده. يتم الحصول علي ثلاث قراءات تم إنشاؤها من كل عين للحصول علي متوسط IOP.
- التضحية الحيوانية في 8 أسابيع بعد ذلك حقن وأداء مناعي من كامل جبل الشبكية ، RGC العد ، العصب البصري (ON) أقسام شبه رقيقه ، والتقدير الكمي من axons الباقيين علي قيد التشغيل ، والتي تم وصفها قبل13.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد فتره وجيزة من الحقن يمكننا بسهوله تحديد الفئران التي لا تنتج ارتفاع ضغط الدم العين مستقره بسبب قطرات SO كونها صغيره جدا (≤ 1.5 mm)13. وتستبعد هذه الكائنات من التجارب اللاحقة. بعد إجراءات الحقن ، أكثر من 80 ٪ من الفئران حقن حتى في نهاية المطاف مع قطرات أكبر من 1.6 مم. قمنا بقياس IOP من هذه العيون الماوس مره واحده في الأسبوع لمده 8 أسابيع بعد حقنه واحده حتى. و IOP من العين تلقي SO ظلت عاليه ، وعموما ضعف IOP من العين السيطرة المعاكس ، مشيرا إلى منع التلميذ فعاله (الشكل 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نظهر اجراء بسيطه ولكنها فعاله للحث علي ارتفاع IOP المستدامة في العين الماوس عن طريق حقن انتراكاميرال من SO. ويمكن تعلم هذا الاجراء بسرعة من قبل اي شخص لديه خبره في التشريح المجهري تحت المجهر. الخطر المحتمل الرئيسي للفشل هو تسرب SO من شق القرنية. ومع ذلك ، واحده من مزايا استخدام SO هو ان لان قطره النفط مرئية وقابله للقياس ، يمكننا بسهوله تحديد الفئران التي تلقت قطرات صغيره جدا للحث علي ارتفاع ضغط الدم العين مستقره قريبا بعد الحقن واستبعادها من التجارب اللاحقة. لقد حققنا بشكل روتيني معدل النجاح 80 ٪ واستبعد حوالي 20 ٪ ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح EY024932, EY023295, و EY028106 إلى YH.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5٪ بروباراكائين هيدروكلوريد | أكورن ، سومرست | ||
| 10 مل سينج | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G إبرة | BD | مع شطبة عادية ، طول الإبرة: 25.4 مم | |
| 2،2،2-Tribromoethanol (Avertin) فيشر | Scientific | CAS # 75-80-9 | 50 جم |
| 32G نانو | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G إبرة طب العيون | TSK / VWR | TSK3313 / 10147-200 | |
| 5 مل syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 مجم / مل ، 50 مل | |
| دموع اصطناعية | مختبرات Alcon | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS محلول الري | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| مجتذب ماصة زجاجية مزدوجة | المرحلة NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 نظام كلاسيكي | EZ | ||
| نظام Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane ، USP ، 250 مل / زجاجة |
| IV مجموعات الإدارة | EXELint / Fisher | 29081 | |
| حقن هيدروكلوريد الكيتامين | VEDCO | 50989-996-06 | كيتافيد 100 مجم / مل * 10 مل |
| آلة شطف الطحن | الصغيرة NARISHIGE | EG-401 | |
| أنابيب مصغرة EVA | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05 "ID, 0.09" OD, 10 أقدام طول |
| زيت السيليكون (SILIKON) | مختبرات Alcon | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية | WPI / Fisher | 1B150-4 | 4 بوصة. (100 مم) OD 1.5 مم معرف 0.84 مم |
| TonoLab مقياس توتر | العين الإمداد الطبي الاستعماري ، مرهم المضادات الحيوية البيطرية الفنلندية | ||
| Dechra البيطري | 1223RX | BNP مرهم للعيون ، Vetropolycin |
المراجع
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
