هنا نصف طريقة جديدة للكشف عن نجاح إنشاء الدورة الدموية المشتركة من اثنين من الباربايوينتس من خلال حقن الوريد caudal من الجلوكوز، والذي يسبب الحد الأدنى من الضرر وليس قاتلا للبارابيوتر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن إنشاء إمدادات الدم المشتركة في الفئران الباربايوتيك عن طريق حقن الجلوكوز في الوريد Caudal
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Parabiosis هو طريقة تجريبية للجمع جراحيا اثنين من الحيوانات المتوازية على طول المحور الطولي للجسم. نقدم بروتوكولا للكشف عن نجاح إنشاء التشيميرة الدم في parabionts عن طريق حقن الوريد caudal من الجلوكوز. تم بناء الفئران البارابيوية. تم حقن الجلوكوز في الفأر المانح ة من خلال الوريد الذيل، وتم قياس تقلب مستوى السكر في الدم في كل من الفئران باستخدام مقياس غلوككوز الدم في نقاط زمنية مختلفة. أظهرت نتائجنا أنه بعد حقن الجلوكوز ، زاد مستوى السكر في الدم في الفئران المانحة بشكل حاد بعد دقيقة واحدة وانخفض ببطء بعد ذلك. وفي الوقت نفسه، بلغ مستوى السكر في الدم للفئران المتلقية ذروته بعد 15 دقيقة من الحقن. تم الحصول على نتائج مماثلة مع إيفانز الأزرق, تستخدم كتحكم إيجابي للجلوكوز. يشير التذبذب المتزامن لمستويات السكر في الدم إلى أن تدفق الدم بين الفئران اثنين تم إنشاؤه بنجاح.
المقدمة
Parabiosis هو طريقة النمذجة التي يتم فيها ضم اثنين من الكائنات الحية معا جراحيا وتطوير كنظام فسيولوجي واحد مع نظام الدورة الدموية المشتركة1. وقد استخدمت هذه النماذج على نطاق واسع لدراسة علم وظائف الأعضاء نظرا لميزة أن المواد التي ينتجها فرد واحد يمكن أن تعمل على كل من الحيوانات في نفس الوقت عن طريق نظام الدورة الدموية المشتركة. منذ منتصف 1800s عندما كانت التجارب الباربايوية رائدة من قبل بول بيرت2، أصبحت أساليب بناء النماذج البارابيوية موحدة. ومع ذلك ، فقد طريقة واضحة ومريحة للتحقق من نجاح إنشاء التشيهالدم. وقد أفيد أنه يمكن تقييم التداول عبر بنجاح عن طريق حقن داخل البيتونيا 0.5٪ صبغة زرقاء إيفانز في واحدة من البارابيوات تليها قياس امتصاص الأزرق إيفانز في الدم من كل من الباربايوينتس مع قارئ microplate3. طريقة أخرى تتطلب سلالة الماوس محددة تحتوي على CD45.1+ -وCD45.2+- المسمى monocytes في كل بارابيونت. ثم يتم استخدام الخلايا لتحديد التشيميرة الدم عن طريق قياس تواتر اثنين من علامات في monocytes من الطحال أو الدم4. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غالبا ما تكون قاتلة أو مرهقة للحيوانات ، وطريقة آمنة وبسيطة للتحقق السريع والموثوق به من النماذج البارابيوية أمر مرغوب فيه للغاية. في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة جديدة لهذا الغرض ، والتي تم التحقق من صحتها في نموذج الماوس من parabiosis. يتم قياس تركيز الجلوكوز في عينات الدم المسحوبة من الوريد الذيل باستخدام مقياس الجلوكوز ، ويعتبر نمط التغيرات في مستوى الجلوكوز في الفئران المانحة والمتلقية مؤشرا على تشيميرية الدورة الدموية. نحن اسمه هذا الأسلوب "طريقة تقلب الجلوكوز". لا يقتصر تطبيق طريقة التحقق هذه على الفئران ولكن يمكن توسيعها إلى نماذج مرضية متنوعة باستثناء أولئك الذين يعانون من dysregulation خطيرة من استقلاب الجلوكوز. الإجراء بسيط، توفير الوقت، وآمنة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات ورعايتها من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة هاربين الطبية.
ملاحظة: يتم سرد الأدوات والمعدات المطلوبة للطريقة في جدول المواد.
1. إعداد المواد والحيوانات
- اطلب C57BL/6 فئران ذكور بوزن يتراوح بين 20 جم-25 جم من مورد الحيوانات المختبرية القياسي.
- اعمل على تناول الفئران في دورة من الضوء 12 ساعة: 12 ساعة من الظلام عند 24-26 درجة مئوية مع وصول الإعلانية libitum إلى الماء والغذاء.
2- بارابويس
- تحقن الفئران بحقن داخل البرتونية من 20 غرام/لتر 2,2,2-تريبروموثانول بتركيز 0.1 مل/10 ز. تأكد من الحقن السليم كما هو مبين باسترخاء العضلات، والتنفس البطيء والمطرد، وفقدان انعكاس تحفيز الجلد، واختفاء منعكس القرنية.
- تطبيق مرهم العيون مع Q-تلميح لمنع جفاف العينين.
- تنفيذ إجراء parabiosis كما هو موضح سابقا5.
- وضع الفئران في موقف supine. اعمل على الإنزلاف الدقيق للجانب الأيسر من فأر ة واحدة والجانب الأيمن من الفأرة الأخرى بدءًا من حوالي 1 سم فوق الكوع إلى 1 سم تحت الركبة باستخدام آلة التكال. استخدام كريم إزالة الشعر لمسح تماما الفراء على الجلد حليق.
- مسح المناطق النابة مع iodophor. ضع الفئران على وسادة ساخنة مغطاة بوسادة معقمة.
- إنشاء شقوق الجلد الطولية بدءا من 0.5 سم فوق الكوع إلى 0.5 سم تحت مفصل الركبة باستخدام زوج من مقص حاد على الجانب كل الحيوان حليق.
- فصل الجلد من اللفافة تحت الجلد بلطف بعد شق.
- ربط olecranon والركبة من البارابيون مع خياطة 3-0.
- خياطة الجلد الحليق مع خياطة مستمرة 5-0.
- حقن 0.5 مل من 0.9٪ NaCl تحت الجلد إلى كل فأر ة لمنع الجفاف.
- حقن الترامادول (10 ملغ/25 غرام/يوم) عضليا لكل فأر لتخفيف الألم.
3. التحقق من صحة التشيميرة الدموية
- طريقة تقلب الجلوكوز
ملاحظة: تحقق من البناء الناجح لتشية الدورة الدموية بين الباربايوينت باستخدام طريقة تقلب الجلوكوز (عدم الصيام) في اليوم العاشر بعد جراحة الباربوريس.- تحقن البارابيوتينات بالحقن داخل البراتوران 20 غ/لتر 2,2,2-تريبروموثانول لكل فأر بتركيز 0.1 مل/10 جم.
- إصلاح الفئران المانحة في المثبت ذيل الماوس البصرية Venous.
- فرك الأوردة الكودالية في جناح أحد ذيل البارابيون مع كرة قطنية غارقة في الكحول 70-75٪ لتنظيف الذيل وتمدد الأوعية الدموية.
- احمل حقنة 1.0 مل تحتوي على الجلوكوز في اليد اليمنى وابق الإبرة موازية للوريد (أقل من 15 درجة).
- أدخل الإبرة في موضع يبعد حوالي 2-4 سم عن طرف الذيل.
- حقن 100 ميكرولتر من الجلوكوز (1.2 غرام/ كجم) في المتبرع في غضون 10 ق.
ملاحظة: يشير مصطلح المتبرع إلى الباربايوين تتلقي حقن الجلوكوز من خلال الوريد الذيل. المتلقي هو البارابيونة الأخرى، التي لا تتلقى الجلوكوز مباشرة. - تنظيف اللّزوبة مع iodophor. قطع أطفأ الفئران المانحة والمتلقية بمقص وجمع قطرة دم في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن الجلوكوز (دقيقة و5 دقيقة و10 دقيقة و15 دقيقة و20 دقيقة و30 دقيقة و40 دقيقة و50 دقيقة و60 دقيقة). قم بإزالة جلطة الدم في كل نقطة زمنية للجمع لتجنب المزيد من الضرر.
ملاحظة: كان حجم الدم الذي تم جمعه 10-25 ul لاختبار واحد، و 90-225 ul في المجموع. - التنقيط الدم في مركز شرائط اختبار الجلوكوز للكشف عن مستوى الجلوكوز.
- استخدام كونترستين الأزرق ايفان كتحكم إيجابي3.
- حقن 200 ميكرولتر من 0.5٪ الأزرق إيفان مضادة للبقع داخل داخل الفأر المانحة.
- 2 ساعة في وقت لاحق, القتل الرحيم البارابيوتر عن طريق الحقن داخل البريكنتال من 20 ز/لتر 2,2,2,2-تريبروموثانول لكل فأر بتركيز 0.2 مل/10 غرام, وجمع الدم من كل من الباربايوينت عن طريق ثقب القلب.
- الطرد المركزي عينات الدم في 916 x ز لمدة 15 دقيقة.
- جمع المصل من supernatant.
- تمييع المصل مع 0.9٪ NaCl في 1:50.
- قياس امتصاص عينات المصل المخفف في 620 نانومتر مع مطياف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ستة فئران متبرعة، ارتفعت مستويات السكر في الدم بشكل حاد إلى 26.5 ميكرومول/لتر (زيادة 173%) بمعدل دقيقة واحدة بعد حقن 100 ميكرولتر من الجلوكوز (1.2 جرام/كغ) عبر وريد الذيل ثم انخفضت تدريجياً إلى 13.3 ميكرومول/لتر عند 60 دقيقة. في الفئران المتلقية، زاد مستوى السكر في الدم ببطء بعد الحقن ووصل إلى مستوى الذروة الأول عند 15 دقيقة (زيادة 47٪، 12.2 ميكرومول/لتر). بناءعلى النتائج المذكورة أعلاه، تم تحديد معيار تشيميرسية الدورة الدموية على النحو التالي: 1) زيادة حادة في مستوى السكر في الدم (زيا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Parabiosis يشير إلى التقنية الجراحية لربط اثنين من الحيوانات الحية لإنشاء نظام الأوعية الدموية المشتركة بالوسائل التجريبية6،7،8. ميزة هذا النموذج هو أن المواد التي تنتجها فرد واحد يمكن أن تعمل على كل من الحيوانات في نفس الوقت. وهكذا، يمكن استخدام نموذج البارابوسيدس لاستكشاف دور مادة أو عامل في مرض ذي صلة، مما ينتج العديد من الاستنتاجات المجدية والمبتكرة. في ضوء قيمة تطبيقه كبيرة، وقد جلبت نموذج عن فهم أفضل لأمراض الجهاز القلبي ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (81570399 و 81773735) ، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين - مشروع أبحاث تحديث الطب الصيني التقليدي (2017YFC1702003) ، وهي لونغ جيانغ صندوق علوم الشباب المتميز (JC2017020).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط منحني | JZ الأدوات الجراحية ، الصين | J31340 | |
| مقص ناعم | JZ الأدوات الجراحية ، الصين | WA1030 | |
| ملقط إبرة | JZ الأدوات الجراحية ، الصين | 60017961 | |
| 2.5 مل محاقن | Agilent ، الولايات المتحدة الأمريكية | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية | T48402-5G | |
| البنسلين | سولاربيو ، الصين | IP0150 | |
| ترامادول | يجيشي ، الصين | YJT712520 | |
| مقياس السكر | روش لرعاية مرضى السكري ، إنديانا | شرائط اختبار أكيوتشيك أكتيف شرائط | |
| اختبار إيفان الزرقاء Counterstain | Solarbio ، كريم إزالة | الصيني G1810 | |
| ناير ، الولايات المتحدة الأمريكية | بطانية الاحترار LL9161 | ||
| ( وسادة التدفئة) | كينت ساينتفيك كورب ، الولايات المتحدة الأمريكية | TP-22G | |
| ماكينة حلاقة كهربائية | Codos ، الصين | CP-5000 | |
| 3-0،5-0 خياطة جراحية | مصنع شنغهاي لإبرة خياطة طبية ، الصين | SYZ 3-0 # ، SYZ 5-0 # |
المراجع
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556(2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914(2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587(2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
