يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة والثقافة من محرك للعين ، تروشلير ، والخلايا العصبية موتور الشوكي من السابق للولادة Islmn: Gfp الفئران المحورة وراثيا

10.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60440

⸱

نوفمبر 12, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا العمل بروتوكولا لإنتاج ثقافات الخلايا المتجانسة لمحرك للعين الاوليه ، والخلية العصبية الحركية الشوكية. يمكن استخدام هذه الثقافات للتحليلات المقارنة للخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية في العين والعمود الفقري.

الملخص

الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) يحمل مقاومه ملحوظة للامراض العصبية التنكسية الحركية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) بالمقارنة مع الخلايا العصبية الحركية الشوكي (SMNs). القدرة علي عزل وثقافة الماوس الأساسي CN3s ، CN4s ، و SMNs من شانه ان يوفر نهجا لدراسة أليات الكامنة وراء هذه الثغرة الانتقائية. وحتى الآن ، تستخدم معظم البروتوكولات ثقافات الخلايا غير المتجانسة ، التي يمكن ان تجد تفسيرا للنتائج التجريبية. وللتقليل إلى ادني حد من المشاكل المرتبطة بمجموعات الخلايا المختلطة ، لا غني عن الثقافات البحتة. هنا ، يصف البروتوكول الأول بالتفصيل كيفيه تنقيه وزراعه CN3s/CN4s بالاضافه إلى نظراء SMNs من نفس الاجنه باستخدام اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: أجنه الفئران المحورة وراثيا gfp. ويوفر البروتوكول تفاصيل عن تشريح الانسجه والتفكك ، وعزل الخلايا القائم علي FACS ، وزراعه الخلايا في المختبر من CN3/CN4 ونوى SMN. يضيف هذا البروتوكول رواية في المختبر CN3/CN4 نظام الثقافة إلى البروتوكولات القائمة ويوفر في وقت واحد ثقافة SMN الأنواع النقية والمطابقة للعمر للمقارنة. التحليلات التي تركز علي الخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية ممكنة في هذا النظام الثقافي. هذا البروتوكول سوف تمكن البحوث في أليات التي تحدد تطوير الخلايا العصبية الحركية ، والضعف الانتقائي ، والمرض.

المقدمة

ثقافة الخلايا العصبية الحركية الاوليه هي أداه قويه تمكن من دراسة تطور الخلايا العصبية ، وظيفة ، والقابلية للإجهادات الخارجية. الثقافات العصبية الحركية مفيده بشكل خاص لدراسة الامراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)1,2, الذي أليات المرض غير مفهومه تماما. ومن المثير للاهتمام ، علي الرغم من وفاه خليه كبيره من الخلايا العصبية الحركية الشوكية (smns) في كل من المرضي als والفئران نموذج als ، وفاه الخلية في الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) نادرهنسبيا1،3،4،5،6 ولذلك ، فان التحليلات المقارنة للثقافات المحضة CN3s/CN4s و SMNs يمكن ان توفر أدله هامه حول أليات الكامنة وراء الضعف النسبي. ولسوء الحظ ، كان العائق الرئيسي لهذه التحاليل هو عدم القدرة علي زراعه الثقافات المنقية لهذه الخلايا العصبية الحركية.

وقد تم وصف العديد من البروتوكولات لتنقيه SMNs من النماذج الحيوانية. معظم هذه البروتوكولات استخدام التدرج الكثافة طرد10،11،12 و/أو p75ntr-الأجسام المضادة القائمة علي الخلية فرز تقنيات بالغسل13،14،15،16. طرد التدرج الكثافة يستغل حجم أكبر من SMNs نسبه إلى الخلايا الشوكية الأخرى ، في حين p75Ntr هو بروتين خارج الخلية التي أعرب عنها حصرا smns في الحبل الشوكي. وقد تم توليد ما يقرب من 100 ٪ من الثقافات smn نقيه من قبل واحد أو كل من هذين البروتوكولين11،12،14. ومع ذلك ، لم تنجح هذه البروتوكولات في توليد ثقافات CN3/CN4 لان CN3s/CN4s لا تعبر عن p75Ntr، ولم يتم تحديد علامات CN3/CN4 محدده أخرى. كما انها أصغر من SMNs ، التالي ، أكثر صعوبة لعزل استنادا إلى حجم. وبدلا من ذلك ، اعتمدت الدراسات المختبرية لCN3s أو الCN4s علي الفصل17، و18، و19، و20، و21، و17، و22،و 23، و24، و25، و26، والشريحة27،و28 ثقافة ، والتي تتكون من أنواع خلايا غير متجانسة ، ولم توجد بروتوكولات العزلة والثقافة الاوليه CN3s أو CN4s.

هنا ، يوصف بروتوكول لتصور ، والعزلة ، وتنقيه ، وزراعه CN3s ، CN4s ، وsmns من نفس اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: gfp الفئران المحورةوراثيا29 (الشكل 1، الشكل 2ا). IslMN: gfp تسمي علي وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مع gfp farnesylated التي تقوم بالتمركز إلى غشاء الخلية. هذا البروتوكول يمكن مقارنه الأنواع والعمر مطابقه لأنواع متعددة من الخلايا العصبية الحركية من أجل توضيح أليات المرضية في مرض الخلايا العصبية الحركية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع التجارب التي تستخدم المختبرات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للصحة والصحة لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية وبموافقه لجنه رعاية الماشية والاستخدام من مستشفي بوسطن للأطفال.

1. اعداد الفواصل الزمنيه قبل تشريح

  1. لتوليد الفئران الجنينية قبل الولادة لحصاد الخلايا العصبية الحركية ، تزن كل الإناث الماوس واعداد التزاوج في الوقت المناسب بين الكبار IslMN: gfp الفئران المحورة وراثيا 11.5 يوما قبل يوم من عزله الخلايا العصبية. لغرض تطوير هذا البروتوكول ، 129 S1/C57BL/6J IslMN: تم استخدام الفئران gfp ، الذين تتراوح أعمارهم بين 2 و 9 أشهر ، وتم اعداد التزاوج الموقوت في المساء.
  2. افحص الفئران الانثويه للسدادة المهبلية في الصباح التالي. النظر في التاريخ الذي يتم تحديد المكونات كيوم الجنينية (E) 0.5.
  3. تزن الفئران الإناث وفحص للجراء باستخدام الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) بين e 8.5 − 11. تحقق من علامات التزاوج الناجح.
    1. تاكيد التزاوج ناجحه عن طريق الكشف عن زيادة الوزن في الفئران الإناث (عاده > 1.5 ز علي E 9.5 إذا كان هناك أكثر من 5 − 6 الاجنه).
    2. تاكيد بصريا الاجنه تحت الموجات فوق الصوتية. يمكن اكتشاف الاجنه بسهوله عن طريق الموجات فوق الصوتية بعد E 9.5. يتم اجراء الموجات فوق الصوتية فقط علي الإناث التي اكتسبت الوزن لأنها في كثير من الأحيان الحوامل من تلك التي لا.
      ملاحظه: يمكن للفئران الإناث زيادة الوزن لأسباب أخرى غير الحمل ، لذلك فان زيادة الوزن وحدها ليست مؤشرا موثوقا به للحمل. تاكيد الموجات فوق الصوتية يمنع التضحية غير الضرورية للإناث غير الحوامل ولكن ليست حاسمه إذا لم تكن متوفرة.

2. تشريح الشروط واعداد الاداهات

  1. أداء جميع الطلاء (باستثناء حمض التنظيف من الشفتين) ، واعداد وسائل الاعلام ، وتفكك الانسجه (باستثناء طرد والحضانة) ، والعمل الثقافي في غطاء التيار الرقائقي لضمان العقم من وسائل الاعلام والخلايا العصبية الحركية الجنينية.
  2. مع الاهتمام الدقيق لتقنية عقيمه ، واجراء تشريح الانسجه خارج غطاء المحرك الرقائقي التدفق مع الحد الأدنى من خطر التلوث.
  3. تعقيم واحده لوحه تشريح ، زوج واحد من مقص ميكروتشريح ، زوج واحد من ملقط الإبهام خلع الملابس ، واثنين من أزواج من دومون #5 ملاقط ، واحد سكين ميكروتشريح ، واحده Moria ملعقة مثقبه صغيره من خلال غمر في 70 ٪ الايثانول قبل الاستخدام.

3. PDL/Laminin طلاء من الاطباق/Coverslips

ملاحظه: الثقافة فصل الخلايا العصبية الحركية الاوليه في 96 جيدا أو 24 لوحات جيدا ، اعتمادا علي عدد من الخلايا المطلوبة للتطبيق. يمكن ان تكون الخلايا غير مباشره في لوحه ثقافة الانسجه دون استخدام الشفتين إذا كانت الآبار شفافة بصريا وسمك متوافقة مع التصوير.

  1. للتطبيقات التي تتطلب الشفتين ، واعداد حمض تنظيفها ، تعقيم ، والمجففة الهواء الشفتين علي الأقل 2 أيام قبل عزل الخلايا العصبية كما هو موضح سابقا30. يمكن اعداد مجموعات من الشفتين بهذه الطريقة بشكل جيد في وقت مبكر من التجارب ويمكن تخزينها حتى 6 أشهر دون التاثير علي الجودة التجريبية.
  2. اعداد حل العمل من 20 ميكروغرام/مل بولي D-يسين (PDL) في الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) 2 أيام قبل عزل الخلايا العصبية.
    1. Aliquot PDL (1 مغ/مل) مقدما وتخزين في-20 درجه مئوية كحل الأسهم.
  3. تغطيه سطح كل كوفيرسليب أو بئر من لوحه ثقافة الانسجه مع ما يكفي من حلول pdl حل العمل (علي سبيل المثال ، 100 μl لكل بئر علي 96 لوحات جيده أو 500 μl لكل بئر علي 24 لوحات جيدا مع أو بدون الشفتين). احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  4. في اليوم التالي يغسل 3x مع المياه المعقمة.
    1. ختم لوحات مع الفيلم البارافين وتخزين لوحات PDL المغلفة غسلها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 1 شهر إذا كانت تجفف تماما بعد الغسيل النهائي.
  5. اعداد حل العمل مع 10 μL من laminin (1.1 − 1.2 mg/mL) في 1.2 مل من تلفزيوني.
    1. Aliquot laminin الأسهم (1.1 − 1.2 mg/mL) مقدما وتخزين في-80 درجه مئوية.
  6. تغطيه سطح كل كوفيرسليب أو جيدا مع ما يكفي من محلول laminin لمعطف بالتساوي السطح. احتضان لمده 2 ساعة علي الأقل عند 37 درجه مئوية قبل الاستخدام.
    ملاحظه: PDL/laminin المغلفة لوحات والشفتين يمكن تخزين ما يصل إلى 1 الأسبوع في 37 درجه مئوية ، ولكن الlaminin المغلفة الطازجة هو المفضل. أزاله laminin مباشره قبل الطلاء30. يجب عدم السماح لLaminin بالجفاف. إذا كانت لوحات ليتم تخزينها لأكثر من عده ساعات ، ينبغي ان تكون ملفوفه في فيلم البارافين.

4. اعداد تشريح ، الحركية العصبية وسائل الاعلام الثقافة ، وحلول التفكك

ملاحظه: وتشير التركيزات الواردة بين قوسين إلى التركيزات النهائية لكل كاشف.

  1. اعداد المتوسط تشريح.
    1. الذوبان في مصل الحصان الحرارة المعطلة بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية ، واعداد 1 مل aliquots ، وتخزين في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
    2. تخزين B27-الملحق (50x) في 1 مل قسامات في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام. تجنب دورات التجميد/الذوبان.
    3. الملحق الجلوتامين المخزن (100x) في 4 درجه مئوية أو-20 درجه مئوية. يقسم إلى 0.5 مل من الارصفه الغذائية في حاله التخزين عند-20 درجه مئوية.
    4. مخزن البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/ml) في 1 مل قسامات في-20 درجه مئوية. ذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
    5. 100 100 200 200 9.4 استخدام هذه الوسيلة لجمع الانسجه تشريح وجعل التعليق النهائي من الخلايا المنفصلة.
    6. أضافه 500 μL من تشريح المتوسطة إلى الفردية 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي لجمع الانسجه في اليوم السابق للعزل الخلايا العصبية. اعداد أنبوب واحد لكل نوع الانسجه التي سيتم جمعها (علي سبيل المثال ، السيطرة الايجابيه ، والسيطرة السلبية ، CN3/CN4 ، SMN) وتخزين في 4 درجه مئوية قبل الاستخدام.
    7. الجمع بين 49 mL من السبات E وسائل الاعلام منخفضه الفلورية مع 1 مل من الملحق B27 (1x) وملء 24 لوحه جيدا مع هذا المتوسط (2 مل/بئر) في اليوم السابق للعزل الخلايا العصبية. استخدم هذا الطبق لجمع أجنه الفئران. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  2. اعداد العصبية الحركية المتوسطة الثقافة.
    1. اعداد 250 μl القسامات من 25 ملم 2-mercaptoethanol في L15 المتوسطة leibovitz. يخزن عند-20 درجه مئوية.
    2. توليد 5 μl قسامات من 100 ميكروغرام/مل حلول bdnf ، cntf ، و gdnf المخفف في المياه المعقمة. يخزن في-80 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
    3. اعداد محلول فورسكولين 10 مم عن طريق أضافه 64 μL من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) إلى 5 ملغ (1.0670 μM) من فورسكولين ودوامه جيدا لأذابه تماما. ثم أضافه المياه المعقمة (1.003 مل) إلى الحل DMSO ودوامه جيدا. تخزين 12 μl القسامات من 10 مم فورسكولين في-20 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
    4. اعداد 12 μl القسامات من 100 mM ايزوبوتييلميثيلزانسيني (ibmx) المخفف في dmso. يخزن عند-20 درجه مئوية وذوبان الجليد في RT مباشره قبل الاستخدام.
    5. لجعل ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة ، مزيج 9.4 مل من متوسط نيوروقاعدي مع 200 μL من مصل الحصان (2 ٪) ، 200 μL من 50x B27 الملحق (1x) ، 100 μL من 100x الجلوتامين الملحق (1x) ، 100 μL من 10,000 U/m: البنسلين-ستربتوميسين (100 U/mL) ، و 20 μL من 25 ملم 2-mercaptoethanol (50 μM) ، ويفضل مباشره قبل الاستخدام. يمكن تنفيذ هذه الخطوة حتى يوم واحد قبل عزل الخلايا العصبية.
    6. فقط قبل استخدام, أضافه 1 μL كل من 100 ميكروغرام/مل BDNF (10 نانوغرام/مل), CNTF (10 نانوغرام/مل), و GDNF (10 نانوغرام/مل) و 10 μL من 10 مم فورسكولين (10 μM), و 10 μL من 100 mM IBMX (100 μM) لثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة. يسخن الوسط إلى 37 درجه مئوية.
  3. اعداد حلول التفكك.
    1. اعداد الحل بابين (20 ش/مل بابين و 0.005 ٪ dnase) ومحلول مثبط الزلال-ovomucoid (1 ملغ/مل المثبط ovomucoid ، 1mg/ml الزلال ، و 0.005 ٪ dnase) اتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    2. اعداد 500 μl القسامات من كل من مثبطات ovomucoid وحلول بابين وتخزين في-80 درجه مئوية. ذوبان الجليد في 37 درجه مئوية علي الفور قبل الاستخدام.

5. بطني الدماغ النصفي وتشريح الحبل الشوكي

ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات التالية باستثناء الخطوات 5.1.1 − 5.1.3 و 5.1.5 − 5.1.6 تحت مجسم تشريح الفلورية. الوقت الإجمالي لتشريح التجربة هو عاده 3 − 5 ساعة ، اعتمادا علي الكفاءة في تقنيه التشريح وعدد الخلايا العصبية الحركية المطلوبة لكل تجربه.

  1. تشريح منتصف الدماغ البطني
    1. موت ببطء الماوس الحامل تقريبا 11.5 أيام بعد الإخصاب بغاز ثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم.
    2. رش البطن جيدا مع الايثانول وأزاله الرحم باستخدام مقص التشريح المجهري وملقط الإبهام خلع الملابس. يغسل الرحم لفتره وجيزة في العقيمة التلفزيونية ، ثم نقل إلى لوحه تشريح مليئه المبردة المعقمة تلفزيونيا.
    3. أزاله IslMN: gfp-الاجنه الايجابيه بعناية من الرحم باستخدام مقص المجهرية العقيمة ، ملقط خلع الملابس الإبهام ، والملقط دومونت #5 في الجليد الباردة العقيمة التي تحت ضوء مشرق من المجهر. باستخدام المعقمة Moria مصغره مثقبه ملعقة ، نقل كل جنين إلى بئر منفصلة من 24 لوحه جيدا مليئه المبردة السبات-E منخفضه المتوسطة الفلورية تستكمل مع 1x B27. الحفاظ علي 24 لوحه جيدا علي الجليد.
    4. نقل جنين واحد إلى لوحه تشريح معقمه وتغطيه تماما مع الجليد الباردة عقيمه المحلول الملحي المتوازن هانك (HBSS).
    5. تاكد من ان يتم اجراء الخطوات تشريح تحت فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC) الاضاءه من المجهر. باستخدام ملاقط ، وأزاله الذيل ووجه الجنين دون الاضرار بالدماغ الوسطي (الشكل 2Ba). وضع الجنين عرضه مع أطرافه تمتد تحت والذيل مشيرا نحو الجبهة من المجهر ، نحو مشرح (المشار اليها بالنجمة ، الشكل 2Bb).
    6. باستخدام ملاقط ، شق فتح سقف البطين الرابع من أجل توليد فتحه صغيره. استخدم هذا الفتح لربط ملاقط في المساحة التي تم إنشاؤها بين البطين الرابع وسقفه. تشريح علي طول السطح الظهري من منقاري الجنين إلى القشرة والجانبية إلى لوحه الأرض وعمود المحرك (الشكل 2Ca, b). افتح النسيج الذي تم تشريحه بطريقه الكتاب المفتوح للكشف عن CN3 الايجابيه GFP و CN4 النوى.
      ملاحظه: سيتم الآن كشف قطعه صغيره من الانسجه من الدماغ النصفي البطني التي تحتوي علي المسسبي ، CN3 ، و CN4.
    7. افصل المخ البطني بعناية عن الجنين وأزل الانسجه السحائية باستخدام ملاقط وسكين ميكروتشريح. تشريح الثنائية CN3 ايجابيه GFP و CN4 نوى بعيدا عن لوحه الكلمة وغيرها من الانسجه المحيطة GFP السلبية باستخدام ملاقط وسكين ميكروتشريح (الشكل 2د). تعظيم عدد من الخلايا العصبية الحركية الايجابيه GFP في الانسجه المثيرة ولكن تجنب لمس أو اتلافها.
    8. إذا كان من المرغوب فيه مجموعه من نوى منفصلة CN3 و CN4 ، قطع علي طول الخط الأوسط من هذه النوى اثنين (الخط الأصفر المنقط في الشكل 2د). باستخدام ماصه P1000 ، وجمع الانسجه البطنية النصفية تشريحها مع HBSS الحد الأدنى ووضعها في المسمي 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير مليئه تشريح المتوسطة (انظر الخطوة 4.1.5). يخزن علي الجليد حتى التفكك.
    9. استمر في تجميع العقول الوسطي البطنية من أجنه اضافيه في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية (راجع الخطوة 8 للحصول علي أرقام الخلايا المثالية).
      ملاحظه: مجموعه مجمعه من ما لا يقل عن 10 العقول الوسطي البطنية التي تنتج ما يقرب من 1 × 104 CN3/CN4 الخلايا العصبية الحركية الموصي بها لان الانسجه تخضع للإجهاد اثناء التفكك والفرز.
  2. تشريح الحبل الشوكي بطني
    1. الحفاظ علي الجنين عرضه مع الراس الذي يواجه الجبهة من المجهر ، نحو dissector. عقد الجنين مع زوج واحد من ملاقط وادراج غيض من الزوج الآخر من ملاقط في الجزء الذي لم يتم فتحها من البطين الرابع.
    2. فتح بقية الدماغ المؤخر والحبل الشوكي دورسالي علي مدي روروكاودال كامل من الجنين. فتح عن طريق قطع الانسجه الظهرية ، بدءا من البطين الرابع والعمل نحو القناة المركزية من الحبل الشوكي الذيليه باستخدام ملقط كمقص (الشكل 2Ca ، b). توخي الحذر لتجنب لمس أو اتلاف الحبل الشوكي البطني خلال هذا الاجراء.
    3. عقد الجنين مع زوج واحد من ملاقط وقرصه قباله رفرف من الانسجه الظهرية علي كل جانب مع زوج آخر من ملاقط (الشكل 2Ea ، b).
      ملاحظه: تحتوي الانسجه الظهرية المثيرة علي الجلد الظهري ، والمسسبي ، والعقدة الجذرية الظهرية (DRGs) ، والدماغ الخلفي الظهري ، والحبل الشوكي. أزاله أكبر قدر ممكن من هذه الانسجه دون الاضرار النوى SMN ، لأنها لاصقه ويمكن اعتراض Smn اثناء تصفيه أو تسبب انسداد اثناء الفرز FACS.
    4. أزاله الحبل الشوكي بطني باستخدام سكين تشريح المجهرية إلى بيرس مباشره تحت SMN ايجابيه GFP. رفع الحبل الشوكي البطني مع حركات تشبه المنشار علي كلا الجانبين (الشكل 2Fa, b). قطع الحبل الشوكي البطني العائمة بشكل مستعرض مباشره فوق C1 ، حيث أول المشاريع القرن الامامي ايجابيه GFP (الشكل 2ز). أيضا ، وقطع بشكل مستعرض في الحدود العليا من الطرف السفلي (الشكل 2ز). أزاله عنق الرحم (C1)-قطني (L2-L3) جزء من الحبل الشوكي البطني بعد هذا الاجراء.
    5. ضع الحبل الشوكي البطني في الجانب الظهري وامسك بالضغط علي النسيج السلبي GFP بين الاعمده SMN الايجابيه GFP مع زوج واحد من ملاقط. أزاله المتبقية mesسبي المرفقة ، DRGs ، والحبل الشوكي الظهرية عن طريق تقليم كلا الجانبين من العمود SMN ايجابيه GFP مع سكين التشريح المجهري (الشكل 2ح). رعاية لتعظيم الخلايا العصبية الحركية الايجابيه GFP دون الاضرار بها.
    6. باستخدام ماصه P1000 ، وجمع انسجه الحبل الشوكي البطني تشريحها مع HBSS الحد الأدنى ومكان في SMN-المسمي 1.7 mL أنبوب الطرد المركزي الصغير مليئه تشريح المتوسطة. يخزن علي الجليد حتى التفكك. الاستمرار في تجميع الحبال الشوكية البطنية من أجنه اضافيه في نفس الأنبوب حتى يلبي العدد الإجمالي المتطلبات التجريبية.
      ملاحظه: جمع ما لا يقل عن ثلاثه الحبال الشوكي البطني الغلة تقريبا 2.1 x 104 smn ينصح لان الانسجه تخضع للإجهاد اثناء التفكك والفرز.
    7. جمع الخلايا العصبية الحركية الوجه والأطراف من IslMN: gfp الاجنه الماوس كما gfp-الايجابيه والسلبية gfp الضوابط لفرز الخلايا المنشطة فلوري (facs) ، علي التوالي. الأطراف هي السلبية GFP لان المحاور الايجابيه GFP من SMNs لم تمتد حتى الآن إلى الأطراف في هذه السن الجنينية.

6. تفكك الانسجه

ملاحظه: إجمالي وقت التفكك عاده 1.5 h لكل تجربه.

  1. الدافئة بابين والزلال-ovomucoid المانع المحلول قسامات إلى 37 درجه مئوية 30 دقيقه قبل التفكك.
  2. تدور بإيجاز أسفل الانسجه المجهرية بسرعة منخفضه.
  3. باستخدام ماصه P100 ، وأزاله بعناية قدر السبات E ممكن دون شفط الانسجه.
    ملاحظه: تاكد من أزاله جميع المتبقية اسبات E بعد هذه الخطوة لتجنب الحد من فعاليه التفكك بابين في الخطوة التالية.
  4. أضافه الحجم المناسب من الحل بابين (الجدول 1) لكل من أنابيب الطرد المركزي 1.7 mL التي تحتوي علي عينات الانسجه ميكروتشريح.
    ملاحظه: تم تحديد الحجم المناسب من بابين لتفكك من أجل تعظيم التفكك الفعال مع تقليل الضغط علي الخلايا.
  5. تريرات برفق 8x مع ماصه P200. تنفيذ جميع الخطوات تريلوريشن بلطف للحفاظ علي سلامه الخلايا العصبية الحركية.
  6. احتضان الأنابيب التي تحتوي علي الانسجه لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية ، والتحريض عن طريق الاصبع الوخز 10x كل 10 دقيقه. تريرات بلطف كل تعليق 8x مع ماصه P200 بعد الحضانة. تدور أسفل الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق.
  7. لضمان فعاليه تثبيط ovomucoid في الخطوة التالية ، استخدم ماصه P1000 لأزاله وتجاهل أكبر قدر ممكن من ماده طافي دون شفط الانسجه.
  8. أعاده التعليق الكريات في الحجم المناسب من الزلال-ovomucoid المثبط الحل (الجدول 1) بلطف تريريتينغ 8x مع ماصه P200.
  9. الانتظار لمده 2 دقيقه للسماح لأي قطعه المتبقية من الانسجه غير المنفصلة لتسويه إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  10. جمع أكبر قدر ممكن ماده طافي دون الشفط الانسجه غير المنفصلة باستخدام ماصه P200. نقل ماده طافي إلى جديد 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير.
  11. إذا بقيت بعض قطع الانسجه غير منفصلة بعد الخطوة 6.10 ، كرر الخطوات 6.8 − 6-10 للانسجه غير المنفصلة التي تبقي في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.7 mL الاصليه لتعظيم الغلة النهائية للخلايا المنفصلة مع تقليل الضغط علي الخلايا فصل سابقا ، الواردة في ماده طافي من الخطوة 6.10.
  12. تدور الخلايا في 300 x g لمده 5 دقائق بعناية أزاله وتجاهل ماده طافي باستخدام ماصه P1000.
  13. أعاده تعليق بيليه في الحجم المناسب من المتوسطة تشريح (الجدول 1) عن طريق التنضيد 8x باستخدام ماصه P1000. تم تحديد الحجم المناسب من التعليق النهائي بحيث كثافة الخلية لا تتجاوز 107 خلايا/مل ، والتي يمكن ان تسد تيار اله تدفق الخلوي ، ولكن أيضا بحيث لا تضعف الخلايا بشكل مفرط ، مما يؤدي إلى تباطؤ سرعه الفرز.
  14. تصفيه التعليقات من خلال مصافي الخلية 70 μm للقضاء علي اي كتل كبيره أو الانسجه غير مهضوم. نقل تعليق إلى 5 مل جولة أسفل أنابيب البوليسترين اختبار وتخزين علي الجليد حتى المطلوبة.

7-الفرز الخلوي المنشط الفلوري (FACS)

ملاحظه: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام فأرز FACS مجهزه 15 ميغاواط 405 nm الليزر البنفسجي, 100 mw 488 nm الليزر الأزرق, 75 mw 594 nm البرتقالي الليزر, و 40 mw 640 nm الليزر الأحمر. تم فرز الخلايا كما السائل غمد في العقيمة التلفزيونية تحت ظروف العقيم من خلال فوهه 100 μm. من أجل تقليل إجهاد الخلايا ، تم تعيين معدل التدفق إلى ضغط عينه من 1 − 3 ، بحيث تم الحصول علي الحد الأقصى من الاحداث 1000 − 4000 في الثانية. وعاده ما يكون الوقت الإجمالي لهذه الاختبارات 1 − 2 h لكل تجربه.

  1. اعداد الفولتية للامام والجانب مبعثر بحيث يمكن تصور السكان الخلية بشكل صحيح. اعداد الفولتية المناسبة لفرز الخلايا معقده ويتطلب عامل التشغيل FACS من ذوي الخبرة.
  2. للتمييز بين مجموعات الخلايا المختلفة ، وخلايا المؤامرة علي أساس الحجم كما هو محدد من قبل منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل التعقيد الداخلي كما هو محدد من قبل منطقه مبعثر الجانب (SSC-A). رسم بوابه حول الخلايا الحية كما هو مبين في الشكل 3Aa والشكل Ba لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة. تجميع الخلايا داخل المنطقة المسورة كعدد السكان 1 (P1).
  3. لاستبعاد كتل الخلايا والمشككات ، ارسم الخلايا P1 التالية استنادا إلى عرض التشتت الجانبي (SSC-W) مقابل SSC-A. بوابه السكان من خلايا واحده كما السكان 2 (P2) (الشكل 3Ab والشكل Bb).
  4. مؤامرة الخلايا P2 استنادا إلى العرض المبعثر إلى الامام (FSC-W) مقابل FSC-A وبوابه السكان من خلايا واحده كما السكان 3 (P3) (الشكل 3Ac والشكل Bc).
    ملاحظه: استخدام بوابتين متتاليتين في 7.3 و 7.4 يستبعد كتل الخلية والمشككات (عاليه FSC-W وارتفاع FSC-A).
  5. البوابة P3 الخلايا علي أساس GFP مقابل الوفيكوسيانين (APC). تكتشف قناه APC الفلورية التلقائية. النابض علي هذه القناة يتجنب التقاط الخلايا الفلورية التلقائية. استخدام الخلايا السلبية GFP لضبط الجهد لقناات الفلورسنت FITC/GFP. من الناحية المثالية ، وضع بوابات لهذه الخلايا السكان حوالي 102. حدد عتبات البوابة للسكان الإيجابيين من GFP 4 (P4) بشكل فردي لكل نوع من الخلايا العصبية الحركية (الشكل 3الإعلان والشكل Bd).
    ملاحظه: تعيين بوابه GFP اعلي بكثير ل SMNs من ل CN3s/CN4s من أجل الحصول علي ثقافة نقيه (الشكل 3الإعلان والشكل Bd). وهناك بوابه اقل GFP للثقافات SMN يؤدي إلى تلوث الثقافات من قبل الخلايا العصبية غير المتحركة وغير الحركية. وهذا من المرجح لان هناك منخفضه المستوي التعبير GFP في بعض الخلايا العصبية غير الحركية وغير حركيه بسبب المروج راشح. النسبة المئوية للخلايا الموجبة GFP بالمقارنة مع إجمالي الخلايا عاده 0.5 − 1.5% ل CN3s/CN4s و 1.5 − 2.5% ل SMNs. إذا كان تشريح ناجحه ، ويمكن استخدام هذه الأرقام كمعيار لتحديد الموقف المناسب لبوابه ايجابيه GFP (الشكل 3Ae والشكل يكون).
  6. تنفيذ FACS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. جمع الخلايا P4 في جديده 1.7 mL أنابيب الطرد المركزي الصغيرة مليئه 500 μL من المحركات العصبية المتوسطة للثقافة. يخزن علي الثلج حتى الطلاء.
    ملاحظه: علي الرغم من ان الخلايا يمكن فرزها مباشره في الآبار ، وهذا يؤدي إلى عدد غير متساو من الخلايا في البئر. فرز الخلايا في 1.75 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير ومن ثم لوحه يدويا من أجل تحقيق توزيع أكثر حتى الطلاء.

8. ثقافة المحركات العصبية الاوليه المنقية

  1. تمييع FACS-معزولة CN3/CN4 والمعلقات SMN مع ثقافة الخلايا العصبية الحركية المتوسطة الحرارة إلى 37 درجه مئوية إلى كثافة من 5 × 103 و 1 × 104 خلايا/مل ، علي التوالي.
    ملاحظه: واحده [ا] 11.5 ينتج جنين تقريبا 1 [اكس] 103 CN3/CN4 و 7 [اكس] 103 [سمن]. ومع ذلك ، هذه الغلة تعتمد بشكل كبير علي نقاء الانسجه تشريح ، ودقه تفكك الخلية ، والدرس المناسب من بوابات GFP خلال FACS.
  2. نقل 96 لوحات جيدا بريكواتد مع pdl و laminin من 37 درجه مئوية الانسجه الثقافة حاضنه إلى غطاء المحرك الرقائقي ويستنشق laminin من كل بئر. استخدام لوحات والشفتين علي الفور دون غسل.
  3. أضافه 200 μL من المخفف CN3/CN4 والمعلقات SMN في كل بئر من PDL/laminin المغلفة بشكل جيد 96 لوحات. يجب ان تكون كثافة الخلايا النهائية 1 × 103 و 2 × 103 خلايا/بئر ل CN3/CN4 و smn ، علي التوالي.
    ملاحظه: 96
  4. ثقافة الخلايا العصبية في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 حاضنه.
  5. تغذيه الخلايا العصبية كل 5 أيام عن طريق أزاله نصف وسائل الاعلام القديمة (100 μL) واستبدال مع نفس الحجم من المحركات الطازجة ثقافة الخلايا العصبية المتوسطة. تاكد من ان العمليات العصبية تصبح مرئية علي 1 DIV وتصبح أكثر سمكا وأطول بنسبه 14 DIV (الشكل 4). وتصبح أجسام الخلايا العصبية متضخمة وتميل إلى التجميع في الثقافات الطويلة الأجل ، ولا سيما بالنسبة إلى SMNs (الشكل 4).
    ملاحظه: اجراء جميع التغييرات المتوسطة والحل عن طريق ترك نصف حجم المتوسطة الاصليه من أجل تجنب فصل الخلايا المثقفة. ويشمل ذلك خطوات التثبيت والكيمياء المناعية (ICC). إذا تمت أزاله جميع وسائل الاعلام ، بغض بالطريقة التي بلطف ، فان معظم الخلايا فصل ويتم غسلها بعيدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكان الهدف من هذا البروتوكول هو تنقيه عاليه والثقافة علي حد سواء الابتدائية CN3s/CN4s و SMNs طويلة الأجل لتمكين التحليلات المقارنة للأليات الكامنة وراء اضطرابات الخلايا العصبية الحركية (انظر الشكل 1 والشكل 2 لنظره عامه).

وبمجرد ان تم بنجاح عزل الخلايا العصبية وزراعتها في الثقافة ، تم الحصول علي ثقافات CN3/CN4 و SMN الاوليه النقية تقريبا (الشكل 5 ا

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تاريخيا, في المختبر الدراسات من الخلايا العصبية CN3 و/أو CN4 الحركية قد اعتمدت علي ثقافات غير متجانسة مثل الفصل17,18,19,20,21, شرح17,22,23,24,25,26, وشريحة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر بريجيت Pettmann (Biogen ، كامبريدج ، MA ، الولايات الامريكيه) للتعليم في تقنيات تشريح SMN ؛ A.A. Nugent, A.P. Tenney, ع لي, E.H. نغوين, م فاروقي روز, أعضاء مختبر Engle اضافيه, والمشروع ALS أعضاء الاتحاد للمساعدة التقنية ومناقشه مدروس. تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع ALS. الاضافه إلى ذلك ، تم تمويل R.F. من قبل مؤسسه القلب اليابان/باير ياكوهين منحه البحوث في الخارج ومنحه التدريب المعاهد القومية للصحة في علم الوراثة T32 GM007748 ؛ تم دعم جي جاي من قبل برنامج التدريب المعاهد القومية للصحة/NEI في القواعد الجزيئية للامراض العين (5T32EY007145-16) من خلال Schepens معهد بحوث العين والتنمية العصبية برنامج التدريب دكتوراه زمالة (5T32EY007145-19) من خلال مستشفي الأطفال بوسطن; وكانت الشركة مدعومة من قبل NEI (5K08EY027850) ومؤسسه طب العيون في مستشفي الأطفال (جائزه كليه ديسكفري) ؛ و E.C.E. هو باحث في معهد هوارد هيوز الطبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 488-مترافق مضاد للفأر IgG (H + L) ThermoFisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-contruggated F (ab') 2 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) مكملThermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 (50x) ، خال من المصلThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP مقياس التدفق الخلويBD Bioscience- يحتوي هذا على 4 أنظمة ليزر مجهزة ب 405 و 488 و 594 و 640 نانومتر.
BD Falcon 70 & mu ; م مصافي خلايا النايلونCORNING352350لتصفية الخلايا المنفصلة قبل FACS.
BD Falcon أنابيب اختبار القاع المستديرة مع غطاء المفاجئCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene، Ltd.CYT-207
صفيحة دقيقة لثقافة الخلايا ، 96 بئر ، PS ، F-bottom (بئر مدخنة)Greiner Bio-One International655090لقد جربنا العديد من الأطباق المكونة من 96 بئرا وكان هذا هو الأفضل للثقافة والتحليلات بعد
نظارات الغطاء الدائري ICC للفحص المجهريKarl Hecht & amp مساعد1001/14استخدمنا هذا الغطاء لأن المساحة كانت كبيرة (القطر: 14 ملم).
CNTF HumanProSpec-Tany TechnoGene، Ltd.CYT-272
حمض السيكلوبيازونيك من Penicillium cyclopium< / em>Sigma-AldrichC1530CPA. أحد ضغوطات الطوارئ.
4 & رئيس الوزراء ;,6-دياميدينو-2-فينيلينودول (DAPI)ثيرموفيشر ScientificD1306
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD2650DMSO
دومون # 5 ملقط إينوكس تلميح الحجم 0.05 مم × 0.01 مم نصائح بيولوجيروبوز أداة جراحيةRS-5015
فورسكولينثيرمو فيشر العلميBP25205
GDNF الإنسانProSpec-Tany تكنوجين المحدودةCYT-305
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
هانكس محلول الملح المتوازن (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E منخفض التألقBrainBitsHELFFluorescence الذي يعيق ملاحظة تعبيرات GFP للجنين منخفضا.
مصل الحصان ، معطل بالحرارة ، من أصل نيوزيلنديثيرمو فيشر ساینتفيك26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutylmethylxanthine
LamininThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz ' s L15 متوسطالحرارة فيشر 11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
مقص تشريح دقيقRoboz أداة جراحيةRS-5913
سكين صغير 4.75 بوصة 1.7 مم × 27 مم شفرةRoboz أداة جراحيةRS-6272
ملعقة صغيرة مثقبة مورياأدوات العلوم الدقيقة10370-19
الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر إلى الخلايا العصبية من الفئة الثالثة & بيتا توبولين (TUBB3)BioLegend8012021:500 ، TUJ1
نيكون بيرفكت فوكس Eclipse Ti مجهر مضان الخلية الحية وبرامج العناصرتم التقاط صور تباين التداخل التفاضلي نيكون وصور الكيمياء المناعية لمزارع الخلايا باستخدام هذه المعدات
حمض النيتريك 90٪ ، الدخان (معتمد ACS)فيشر ScientificA202-212لشطف أغطية
أوليمبوس 1.7 مل الأنابيب الدقيقة ، ClearGenesee Scientific22-281هذه هي الأنابيب التي وصفناها "أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل" في السياق.
يتم تحضير نظام تفكك البابينWorthington Biochemical CorpLK003150محلول غراء ومحلول مثبط alubumin-ovomucoid من هذه المجموعة.
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر ساينتفيك15140-122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر ساینتفيك10010-023
بولي دي ليسين (PDL)ميليبور سيجماA-003-E
مضادة أحادية النسيلة للأرانب إلى Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 و SMZ1500 المجاهر المجسمة مع DS-Ri1 كاميرا نيكونوتم التقاط صور للأجنة والأنسجة المقطعة تحت هذه المجاهر الفلورية.
سيلجارد 170 مغلف سيليكون أسود - A + B 0.9 كجمطقم داو كورنينج1696157نصنع أطباق تشريح باستخدام هذه المجموعة.
أطباق TC المعالجة ، 100 مم × 20 ممGenesee Scientific25-202نصنع أطباق تشريح باستخدام هذا الطبق.
ملقط ضمادة Thum 4.5 "مسنن 2.2 مم عرض طرفRoboz أداة جراحيةRS-8100
محول ل LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSللموجات فوق الصوتية على إناث الفئران
آلة الموجات فوق الصوتية البيطريةGE HealthcareLOGOQ e VETللموجات فوق الصوتية على إناث الفئران
Zeiss LSM 700 سلسلة مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر وبرنامج ZenCarl Zeiss-تم التقاط صورة متحدة البؤر للجنين باستخدام هذه المعدات
مكمل يجب أن يكون أجسام تم إجراء تصوير

المراجع

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763(2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911(2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423(2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Isl1 GFP FACS 11 5 GFP
العزلة والثقافة من محرك للعين ، تروشلير ، والخلايا العصبية موتور الشوكي من السابق للولادة Islmn: Gfp الفئران المحورة وراثيا
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.