Method Article

التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة

DOI:

10.3791/60484

⸱

November 26th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد. ميزه هذا الأسلوب لا يسمح فقط لتنظيم سرعات التدفق في الموقع ولكن أيضا تمكن التحكم الديناميكي ، مثل بشكل دوري ضبط سرعات التدفق صعودا وهبوطا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقه لاستخدام درجه الحرارة لضبط سرعات التدفق من السوائل النشطة ثلاثية الابعاد (3D) المستندة إلى الميكروبات ، والقائمة علي الميكروتوبولي. هذا الأسلوب يسمح لضبط السرعات في الموقع دون الحاجة إلى تصنيع عينات جديده للوصول إلى سرعات مختلفه المرجوة. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الطريقة تمكن التحكم الديناميكي في السرعة. ركوب الدراجات في درجه الحرارة يؤدي إلى تدفق السوائل بسرعة وبطء ، بشكل دوري. ويستند هذا التحكم علي خصائص Arrhenius من رد فعل kinesin-ميكروتوبولي ، مما يدل علي مدي سرعه تدفق متوسط تسيطر عليها من 4-8 μm/ثانيه. الطريقة المعروضة ستفتح الباب لتصميم الاجهزه الصغيرة التي تكون فيها معدلات التدفق في القناة قابله للتوقد محليا دون الحاجة إلى صمام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتختلف المادة الفعالة عن المسالة السلبية التقليدية بسبب قدرتها علي تحويل الطاقة الكيميائية إلى عمل ميكانيكي. المواد التي تمتلك هذه القدرة يمكن ان تتكون من الكائنات الحية أو غير الحية مثل البكتيريا والحشرات ، الغرويات ، الحبوب ، وخيوط خلوي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. تتفاعل هذه الكيانات المادية مع جيرانها. علي نطاق أوسع ، انها ذاتية التنظيم في الدوامات المضطربة مثل (الاضطراب النشط) أو تدفقات المواد11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. وقد ادي فهم التنظيم الذاتي للمسالة النشطة إلى تطبيقات مختلفه في المكوكات الجزيئية ، والاجهزه البصرية ، والحساب الموازي21،22،23. يتطلب إحضار التطبيقات إلى المستوي التالي التحكم خارج التنظيم الذاتي. علي سبيل المثال ، وضعت Palacci وآخرون الغروانيه المغلفة التي ذاتية الدفع فقط عندما تتعرض للضوء الأزرق المتحكم به يدويا ، مما ادي إلى ظهور البلورات الحية24. إنشات morin وآخرون السيطرة علي الغرويات كوينكه المتداول باستخدام حقل كهربائي الخارجية انضباطي ، مما ادي إلى يتدفقون الغرويه في قناه مثل مضمار السباق25. وتبين هذه الاعمال السابقة دور الرقابة المحلية في التطبيقات وتقدم قاعده المعارف الخاصة بالمادة الفعالة.

في هذه المقالة ، نركز علي التحكم في السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى kinesin ، والتي تعتمد علي الميكروبات (MT). تتكون السوائل من ثلاثه مكونات رئيسيه: MTs ، كينيسن المحركات الجزيئية ، والاستنزاف. يحث ال يستنزف قوه استنزاف ان يربط ال [MTs], اي يكون فيما بعد سدت بمحرك عناقيد. هذه المحركات المشي علي طول MTstoward نهاية زائد. عندما زوج من سد متسيس انتيمتوازي ، المحركات المقابلة المشي في اتجاهين معاكسين. ومع ذلك ، فان المحركات منضمة في كتله وغير قادره علي المشي بعيدا ، لذلك فانها بالتعاون الشريحة أزواج من MTs (الخيوط انزلاق ، الشكل 1ا). تتراكم هذه الديناميكيات المنزلقة ، مما يسبب حزما من MTsto تمتد حتى تصل إلى نقطه عدم الاستقرار الخاصة بهم وكسر (حزم اكستيسسيل ، الشكل 1ب)26. الحزم مكسوره صلبت بالاستنزاف قوه, اي فيما بعد يمدد ثانيه, والديناميات تكرار. خلال عمليه الديناميكيات المتكررة ، حركات الحزمة يحرك السائل القريب ، مما يحفز التدفقات التي يمكن تصورها عن طريق المنشطات مع المتتبعين علي نطاق ميكرون (الشكل 1ج). وقد ميزت سانشيز et al. و henkin et al السرعات المتوسطة من المتتبعين ، ووجدت ان السرعات كانت قابله للتوقد من خلال تفاوت تركيزات الفوسفات الثلاثي (ATP) ، والاستنزاف ، والتكتلات الحركية ، و MTs19،27. ومع ذلك ، كانت هذه التوبيليتي موجودة فقط قبل تخليق السوائل النشطة. بعد التوليف ، وفقدت tunability ، والسوائل المنظمة ذاتيا في طريقتهم الخاصة. للسيطرة علي نشاط السوائل النشطة بعد التوليف ، Ross.et al. ذكرت طريقه باستخدام الضوء تنشيط البروتينات الحركية ، مما يسمح للنشاط السوائل ليتم ضبطها وإيقافها باستخدام ضوء28. في حين ان التحكم في الضوء ملائم من حيث تنشيط السوائل محليا ، فان الطريقة تتطلب أعاده تصميم هياكل بروتينات المحركات ، إلى جانب تعديل المسارات البصرية في المجهر. هنا ، ونحن نقدم وسيله سهله الاستخدام للسيطرة علي تدفقات السوائل محليا دون تعديل المجهر مع الحفاظ علي هيكل المحرك سليمه.

ويستند طريقتنا لضبط تدفق السائل النشط محليا علي القانون arrhenius لأنه تم الإبلاغ عن رد فعل kinesin-MT لزيادة مع درجه الحرارة29,30,31,32. وأظهرت دراساتنا السابقة ان الاعتماد علي درجه الحرارة من متوسط سرعه تدفق السوائل النشطة يتبع المعادلة Arrhenius: v = اكسب (-ea/RT) ، حيث هو عامل ما قبل الاسي ، R هو ثابت الغاز ، ea هو الطاقة التنشيط ، و T هو درجه حرارة النظام33. ولذلك ، النشاط السوائل حساسة للبيئة درجه الحرارة ، ودرجه حرارة النظام يحتاج إلى ان تكون متسقة لتحقيق الاستقرار في أداء السيارات ، التالي ، فان سرعه تدفق السوائل34. في هذه المقالة ، ونحن نظهر استخدام الاعتماد علي درجه حرارة المحرك لضبط باستمرار سرعات تدفق السوائل النشطة عن طريق ضبط درجه حرارة النظام. كما اننا نظهر اعداد عينه سائله نشطه ، تليها تركيب العينة علي مرحله المجهر التي يتم التحكم في درجه حرارتها عن طريق برامج الكمبيوتر. زيادة درجه الحرارة من 16 درجه مئوية إلى 36 درجه مئوية يسرع متوسط تدفق سرعات من 4 إلى 8 μm/ثانيه. بالاضافه إلى ذلك ، فان القدرة علي الانعكاس قابله للعكس: زيادة متكررة وخفض درجه الحرارة بالتعاقب يسرع ويبطئ التدفق. وتنطبق الطريقة الموضحة علي مجموعه واسعه من الانظمه التي تمتثل فيها ردود الفعل الرئيسية لقانون arrhenius ، مثل فحص المزلق المنزلق29و30و31و32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-اعداد الMTs

تحذير: في هذه الخطوة نقوم بتنقية الأنابيب من نسيج الدماغ البقري. الدماغ البقري قد يسبب البديل Creutzfeldt-جاكوب المرض (vCJD)35. ولذلك ، ينبغي جمع نفايات المخ والحلول ذات الصلة ، والزجاجات ، ونصائح الماصة في كيس من النفايات البيولوجية والتخلص منها باعتبارها نفايات بيولوجية خطره وفقا لقواعد المؤسسة.

  1. تنقيه الأنابيب من الدماغ البقري (تعديل من Castoldi وآخرون36).
    1. نقل حوالي 1.5 كيلوغرام من الادمغه البقرية الطازجة من مسلخ محلي إلى غرفه الجامعة الباردة. اثناء النقل ، وتخزين العقول في العازلة الفوسفات (20 مم الجناح2PO4، 150 Mm nacl ، pH 7.2) علي الجليد.
      ملاحظه: لتعظيم الغلة النهائية من الأنابيب ، والكمية الاوليه من الأنابيب الوظيفية في انسجه الدماغ الطازجة هو المفتاح. العقول الطازجة تحتوي علي أنابيب أكثر وظيفية. للحصول علي العقول الطازجة من المسلخ ، ونحن نوصي طلب الجزار لتوفير العقول من الأبقار المذبوحة مؤخرا. يجب ان لا يكون الدماغ أكبر من 3 ساعات عند بدء الاجراء ، لان تقليل الوقت بين الذبح وبدء الإجراءات سينتج عوائد أفضل.
    2. التجانس وتوضيح العقول.
      1. تنظيف الدماغ باستخدام الرؤوس القشرية لقطع الاوعيه الدموية والنسيج الضام إلى قطع أصغر وأزالها من الدماغ باليد.
        ملاحظه: يجب ان تكون العقول التي تم تنظيفها الوردي.
      2. تزج انسجه المخ تنظيفها في 1 لتر من العازلة ديالبلمره (DB: 50 mM 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك ، 1 مم CaCl2، pH 6.6) لكل كيلوغرام من الدماغ.
      3. تجانس العقول مع خلاط المطبخ.
      4. الطرد المركزي حل الدماغ المتجانس في 10,000 x g و 4 درجه مئوية ل 150 دقيقه.
    3. تتبلمر MTs (البلمره الاولي).
      1. جمع ومزج ماده طافي مع كميات متساوية من الحلول التالية في 37 درجه مئوية: الجلسرين ، عاليه الحرارة أنابيب العازلة (hmpb: 1 متر الأنابيب ، 10 مم mgcl2، 20 مم الاثيلين جلايكول-bis (β-امينوهيول الأثير)-n ، n ، n ' ، n'-رباعي 6.9 حامض
      2. أضافه 1.5 mM ATP و 0.5 mM غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) إلى الخليط.
      3. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
    4. ديبوليميريزي MTs (أول ديبوليبوليتي MT).
      1. بيليه MT بواسطة يطرد في 151,000 x g و 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
      2. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق كل بيليه MT في 10 مل من 4 درجه مئوية DB.
      3. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه.
      4. الخلط بين الخليط كل 5 دقائق مع طرف ماصه لتجنب الترسب MT.
        ملاحظه: الخليط يجب ان تتحول واضحة في 30 دقيقه ، مما يدل علي الانتهاء من ديالبلمره MT.
    5. تتبلمر MTs (ثاني طن متري البلمره).
      1. توضيح الحل عن طريق يطرد في 70,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
      2. جمع ومزج ماده طافي مع كميات متساوية من 37 درجه مئوية الجلسرين و hmpb.
      3. أضافه 1.5 mM ATP و 0.5 mM GTP إلى الخليط.
      4. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    6. كرر الخطوة 1-1-4 ، استبدال hmpb مع المخزن المؤقت تجميع برينكلي (brb) 80 (80 mm أنابيب ، 1 مم mgcl2، 1 mm egta ، pH 6.8) ، تليها توضيح الخليط تطهيرها من قبل يطرد في 79,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    7. جمع العملاق. قياس الامتصاص 280 nm مع مطياف. تحديد تركيز الأنابيب باستخدام قانون البيره لامبرت (معامل الانقراض من الأنابيب: 1.15 (مغ/مل)-1سم-1)37،38.
    8. تخزين البروتين في-80 درجه مئوية.
  2. أعاده تدوير الأنابيب (تعديل من Castoldi et al.36).
    ملاحظه: لتعزيز نقاء الأنابيب ، يتم بلمره الأنابيب المنقية وديبوليميريزيد مره أخرى.
    1. تتبلمر MTs عن طريق خلط الأنابيب المنقية (الخطوة 1.1.7) مع 500 μm ديثيوثريتول (dtt) و 20 μm gtp ، تليها 30 دقيقه من الحضانة في 37 درجه مئوية.
    2. بيليه الMTs.
      1. تحميل 1 مل من وساده الجلسرين (80 mM أنابيب ، 1 مم MgCl2، 1 مم egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 6.8) في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
      2. وضع MTs بلمره علي راس وساده.
      3. جهاز الطرد المركزي في 172,000 x g ل 90 دقيقه في 37 درجه مئوية.
    3. ديبوليميريزي الMTs.
      1. أزاله الفائقة ووسادة.
      2. أعاده تعليق كل بيليه MT في 150 μL من 4 ° c MT العازلة (M2B: 80 mM أنابيب ، 2 مم MgCl2، 1 MM Egta ، pH 6.8).
      3. احتضان الخليط علي الجليد لمده 30 دقيقه.
      4. اجتر الخليط بطرف ماصه كل 5 دقائق. يجب ان يتحول الخليط بوضوح.
    4. توضيح الخليط بواسطة يطرد في 172,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    5. جمع العملاق. قياس تركيز البروتين. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  3. تسميه الأنابيب مع صبغ الفلورسنت39.
    1. تتبلمر MTs. خلط الأنابيب المنقية (الخطوة 1.1.7) مع 500 μM DTT و 16.7 μM GTP ، واحتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    2. بيليه الMTs.
      1. مكان 1 مل من 37 درجه مئوية وساده عاليه الحموضة (0.1 M NaHEPES ، 1 مم MgCl2، 1 MM egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 8.6) في أنبوب الطرد المركزي.
      2. وضع بلمره MTs علي وساده.
      3. جهاز الطرد المركزي في 327,000 x g ل 50 دقيقه في 37 درجه مئوية.
    3. تسميه الأنابيب.
      1. أعاده تعليق كل بيليه MT مع 700 μL من 37 درجه مئوية العازلة التسمية (0.1 M NaHEPES ، 1 مم MgCl2، 1 مم egta ، 40 ٪ v/v الجلسرين ، pH 8.6).
      2. اخلطي التعليق مع الفائض المولي من 10 إلى 20 من الصبغة الفلورية الحمراء البعيدة مع استر النجاح.
      3. احتضان الخليط في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في الظلام للسماح MTs للرد مع استر من صبغه الفلورسنت.
      4. وقف رد فعل العلامات التي تشبع استر من صبغ تعليق مع 50 mM K-الغلوتامات ، احتضان لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية.
    4. بيليه المسمي MTs: كرر الخطوة 1-3-2 ، استبدال وساده عاليه الحموضة مع وساده منخفضه الحموضة (80 mM أنابيب ، 2 مم MgCl2، 1 مم egta ، 60 ٪ v/v الجلسرين ، pH 6.8).
    5. ديبوليميريزي MTs.
      1. تجاهل الفائق والوسادة.
      2. أعاده تعليق بيليه في 700 μL من 4 ° c M2B.
      3. احتضان التعليق علي الجليد.
      4. اجتت كل 5 دقائق بطرف ماصه حتى يصبح المحلول واضحا.
    6. توضيح الحل تطهيرها من قبل يطرد في 184,000 x g و 4 درجه مئوية ل 35 دقيقه.
    7. عزز نقاء محلول الأنابيب المسمي من خلال تكرار الخطوات 1.2.1 – 1-2.
    8. قياس تركيز البروتينات وصبغه الفلورسنت. استخدم هذه القياسات لتحديد تركيز الأنابيب وكسور الأنابيب المسمية ، والتي تعرف بأنها نسبه تركيزات الصبغة الفلورية إلى الأنابيب.
    9. تخزين حل الأنابيب المسمية في-80 درجه مئوية.
  4. تتبلمر MTs (اعتمد من سانشيز وآخرون19):
    1. خلط الأنابيب المعاد تدويرها (الخطوة 1-2) مع المسمي الأنابيب (الخطوة 1.3.9) في نسبه التي تعطي 3% المسمية الجزء الأنبوبي.
    2. مزيج 8 ملغ/مل من خليط الأنابيب مع 1 مم DTT و 0.6 mM غوانوزين ' [(α ، β)-ميثيلينو] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP) ، تليها 30 دقيقه من الحضانة في 37 درجه مئوية.
    3. بعد الحضانة ، اننيل MTs في درجه حرارة الغرفة في الظلام لمده 6 ساعات.
    4. Aliquot وتخزين في-80 درجه مئوية.

2. توليف مجموعات كينيسن

ملاحظه: البكتيريا موجودة بشكل مطلق ويمكن ان تنمو في وسائل الاعلام وتلوث عمليه التحضير. لمنع التلوث ، يجب القيام بالإجراءات التي تنطوي علي ملامسه ثقافات الخلايا (علي سبيل المثال ، وضع الأنابيب) بالقرب من اللهب. يجب تعقيم أدوات مثل القوارير والماصات ونصائح الماصة والوسائط واللوحات قبل الاستخدام.

  1. التعبير عن كينيسن المحركات في اساسيكشيا القولونية40.
    1. تحويل الخلايا.
      1. ماصه 1 μl من K401-bccp-H6 البلازميد إلى 10 μl من الخلايا المختصة.
      2. احتضان علي الجليد لمده 5 دقائق.
      3. صدمه الحرارة في 42.5 درجه مئوية ل 45 s.
      4. احتضان الخلايا علي الجليد لمده 2 دقيقه للسماح الانتعاش.
      5. خلط الخلايا مع 300 μL من المضادات الحيوية 2XYT (5 غرام/لتر كلوريد الصوديوم ، 10 غرام/لتر الخميرة استخراج ، 16 غرام/لتر الترتوني).
      6. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
        ملاحظه: ما لم يتم تحديد ، مراقبه نمو الخلية غير مطلوب اثناء الحضانة.
    2. تطعيم اللوحات الاعلاميه.
      1. نشر ثقافة الخلية علي لوحه 2XYT (10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم ، 5 غرام/لتر الخميرة استخراج ، 10 غرام/لتر التريتوني ، 15 غرام/لتر أجار ، 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين ، 25 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول).
      2. احتضان لوحه راسا علي عقب في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
    3. تطعيم الوسائط السائلة.
      1. من اللوحة الليلية ، حصاد مستعمره واحده معزولة مع طرف ماصه.
      2. إخراج غيض في قارورة تحتوي علي 50 مل من 2XYT.
      3. احتضان ويهز وسائل الاعلام الثقافة في 37 درجه مئوية و 200 دوره في الدقيقة لمده 12-16 ح.
    4. قم بتوسيع الخلايا.
      1. مزيج 2.5 mL من ثقافة الخلية في 500 مل من 2XYT.
      2. احتضان ويهز 500 mL الثقافة في 37 درجه مئوية و 250 دوره في الدقيقة لمده 3-6 ساعة.
    5. الحث علي التعبير عن البروتين.
      1. اثناء الحضانة ، ورصد نمو الخلايا عن طريق قياس الامتصاص في 600 نانومتر ، وذلك باستخدام 2XYT كمرجع. قياس الامتصاص كل دقيقه 60 ، حتى تصل إلى OD600 = 0.3. ثم قياس الامتصاص كل 30 دقيقه حتى تصل إلى 0.5-0.6.
      2. السماح للخلايا بالنمو حتى يصل الامتصاص إلى OD600 = 0.5 – 0.6
      3. أضافه 24 ميكروغرام/مل البيوتين و 1 مم ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) إلى ثقافة الخلية.
        ملاحظه: يستخدم iptg للحث علي التعبير عن البروتين من المحركات كينيسن ، والتي يتم المفتاحية مع البيوتين كربوكسيل البروتين الناقل (bccp) وسته histidines (H6). يتم استخدام العلامة H6 في عمليه التنقية (الخطوة 2.2) ، في حين ان BCCP يربط جزيئات البيوتين المضافة إلى المحركات التي تم التعبير عنها.
      4. احتضان ويهز ثقافة الخلية في 20 درجه مئوية و 250 لفه في الدقيقة لمده 12-20 ساعة.
    6. حصاد الخلايا عن طريق يطرد في 5,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. تجاهل supernatant. تخزين كريات الخلية في-80 درجه مئوية.
  2. تنقيه بروتين المحرك كينيسن (تعديل من spriestersbach وآخرون41):
    1. تعليق الخلية بيليه (الخطوة 2-1-6) مع حجم متساو من المخزن المؤقت تحلل (أنابيب 50 mM ، 4 مم MgCl2، 50 μM ATP ، 10 ملم 2-mercaptoethanol (السم) ، 20 مم ايميدازول ، pH 7.2) ، تليها أضافه قرص واحد من مثبطات الانزيم البروتيني ، 2 ملغ من فلوريد السلفونيل البيرفلوروكتاني (pmsf) ، و 2 ملغ من lysozyme.
    2. Lyse الخلايا عن طريق تجميد فلاش في النيتروجين السائل (LN) 3x وذوبان خليط الخلية.
      ملاحظه: بعد ليسينج ، يجب ان يصبح الخليط لزج.
    3. توضيح خليط الخلايا التي يطرد في 230,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    4. جمع ماده طافي وتتدفق من خلال عمود الجاذبية ، تليها غسل العمود مع 10 مل من تحلل العازلة.
      ملاحظه: يجب ان تظل البروتينات التي تحتوي علي علامة H6 ، مثل كينيسن K401-bccp-H6 ، في العمود.
    5. التملص من البروتين الموسومة مع 5 مل من المخزن المؤقت eluate (50 mM أنابيب ، 4 مم MgCl2، 50 μM ATP ، 500 mm ايميدازول ، pH 7.2). جمع تدفق-من خلال التسلسل في 1 مل الكسور. لتحديد الكسور المحتوية علي البروتين ، امزج 3 μL من كل كسر مع 100 μL من صبغه التريفينيلميثان. يجب ان تتحول الكسور المحتوية علي البروتين إلى اللون الأزرق. الجمع بين هذه الكسور وتمييع 5x مع تحلل العازلة.
    6. تركيز محلول البروتين.
      1. تحميل الحل في أنبوب فلتر الطرد المركزي.
      2. جهاز الطرد المركزي في 3,000 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
      3. يهز الأنبوب برفق والطرد المركزي مره أخرى حتى حجم الحل هو < 3 مل.
    7. قياس تركيز البروتين مع مطياف (معامل الانقراض: 0.549 (مغ/مل)-1سم-1)42،43. تمييع البروتين إلى 1 مغ/مل في حين أضافه 35 ٪ ث/الخامس السكروز.
    8. يخزن عند-80 درجه مئوية.
  3. قياس تركيزات كينيسن مع هلام الكهربائي (المعدلة من تايلور وآخرون44).
    ملاحظه: لقياس تركيز كينيسن مع هلام الكهربائي ، أنابيب هو سلم التركيز المثالي بسبب نقاء عاليه وتركيزه القابل للقياس عن طريق مطياف (الشكل 2ا)36.
    1. اعداد العينات الأنابيب مع تركيزات 0.25 ، 0.5 ، 0.75 ، 1.00 ، و 1.25 mg/mL. مزيج 15 μl من كل عينه الأنابيب وعينه كينيسن (خطوه 2.2.8) بشكل منفصل مع 5 μl من عينه العازلة (200 mm تريس-HCl ، 8 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، 400 mm dtt ، 0.2 ٪ بروموفينول الأزرق ، 40 ٪ الجلسرين ، pH 6.8) واحتضان في 90 درجه مئوية لمده 3 دقائق.
    2. جهز الكهربائي
      1. قفل هلام الكهربائي في مربع هلام.
      2. ملء مربع مع تشغيل المخزن المؤقت (50 mM MOPS ، 50 mM قاعده تريس ، 0.1 ٪ SDS ، 1 ملليمتر ايثيلليندياتيتاتاستيك حمض (أدتا) ، pH 7.7).
        ملاحظه: تاكد من ان مستوي المخزن المؤقت اعلي الفتح العلوي للهلام.
    3. تحميل 10 μl من البروتين سلم القياسية ، وعينات الأنابيب ، وعينه كينيسن في الآبار منفصلة وتطبيق 200 V عبر هلام لمده 45 دقيقه.
    4. هلام تلطيخ.
      1. احتضان وصخره هلام مع المغلي (حوالي 95 درجه مئوية) وصمه عار محلول A (0.5 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ v/v حمض الخليك ، 25 ٪ ايزوبروبانول) لمده 5 دقائق ، ثم شطف هلام مع الماء منزوع الأيونات (DI).
      2. كرر مع حلول وصمه عار B (0.05 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ الخامس/الخامس حمض الخليك ، 10 ٪ ايزوبروبانول) ، C (0.02 g/L triفينيلبيراسيتام الميثان صبغ ، 10 ٪ الخامس/الخامس حمض الخليك) ، و D (10 ٪ v/v حمض الخليك) ، بالتتابع. احتضان وصخره الهلام في المياه DI بين عشيه وضحيها.
    5. افحص الهلام. تحويل صوره هلام إلى صوره الرمادي ، تليها عكس الأسود والأبيض وتعزيز التباين للكشف عن عصابات البروتين الساطع في الخلفية السوداء.
    6. قياس سطوع كل نطاق عن طريق جمع قيم البكسل. تطبيق الخطية تناسب C = aB + b، حيث b هو سطوع النطاق الأنبوبي ، C هو التركيز المقابلة ، و a و b هي المعلمات المناسبة. تحديد تركيز كينيسن Ck باستخدام سطوع الفرقة كينيسن Bk لحساب المعادلة الخطية: Ck = aBk + B.
  4. الكتلة المحركات كينيسن.
    1. مزيج 1.5 μm كينيسن (خطوه 2.2.8) مع 120 μm dtt و 120 nM سترافيدين. احتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه.
    2. يخزن عند-80 درجه مئوية.

3. اعداد الشرائح الزجاجية المغلفة بولياكرياميد والشفتين (تعديل من Lau et al.45)

  1. تحميل الشرائح الزجاجية الجديدة والزجاج coverslips في الحاويات المقابلة. دمج الشرائح والشفتين في 1 ٪ v/v المنظفات في الماء DI ثم يغلي الماء في الميكروويف.
  2. قم بنسخ الشرائح والشفتين لمده 5 دقائق ثم اشطفها بالماء DI لأزاله المنظفات.
  3. دمج ونسخ الشرائح والشفتين في الايثانول لمده 5 دقائق شطف مع المياه DI.
  4. الدمج والمزج بين الشرائح والشفتين في هيدروكسيد البوتاسيوم 100 مم (KOH) لمده 5 دقائق. شطف مع المياه DI.
  5. احتضان الشرائح والشفتين في محلول سيلان (1 ٪ حمض الخليك و 0.5 ٪ 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت في الايثانول) لمده 15 دقيقه ثم شطف مع الماء دي.
  6. احتضان الشرائح والشفتين في محلول اكريلاميد (2 ٪ ث/ث اكريلاميد ، 0.7 ملغ/مل persulfate الأمونيوم ، و 0.0035 ٪ v/v تيتراميثيليثيلينيدياميني في المياه دي) ل ≥ 3 ح.
  7. تخزين الشرائح والشفتين في محلول اكريلاميد.

4. اعداد السوائل النشطة المستندة إلى المحرك ، والتي تعتمد علي الطن المتري

  1. اعداد السوائل النشطة (المعدلة من سانشيز وآخرون19).
    ملاحظه: توضح الخطوات التالية عمليه تحضير 100 μL من سائل نشط باستخدام أسهم المثال. الحجم النهائي قابل للتطوير ، ويمكن تعديل تركيزات الأسهم المثال طالما يتم الحفاظ علي التركيز النهائي لكل مكون.
    1. مزيج 16.7 μl من 8 مغ/مل MTs (خطوه 1.4.4) مع 6.7 μl من 1.8 μM كينيسن مجموعات المحركات (الخطوة 2-4) ، و 1.1 μl من 500 mm dtt في الملح العالي M2B (M2B + 3.9 mm mgcl2).
    2. حزمه MTs عن طريق أضافه 11.4 μL من 7 ٪ ث/ث البولي إيثيلين غليكول (PEG).
    3. تنشيط المحركات كينيسن عن طريق أضافه 2.8 μl من 50 mM ATP.
    4. الحفاظ علي تركيزات ATP عن طريق أضافه 2.8 μl من الأوراق المالية البيروفات كيناز/اللاكتات نازعه (PK/ldh) و 13.3 μl من 200 ملم فوسففينول بيروفات (PEP).
    5. الحد من تاثير التصوير الضوئي عن طريق أضافه 10 μL من 20 مم Trolox ، 1.1 μL من 3.5 mg/mL catalase ، 1.1 μL من 20 ملغ/مل اكسيداز الجلوكوز ، و 1.1 μL من 300 ملغ/مل الجلوكوز.
    6. تتبع حركه السائل عن طريق أضافه 1.6 μL من 0.025% v/v جزيئات التتبع.
    7. أضافه M2B عاليه الملح لتحقيق حجم إجمالي 100 μL.
      ملاحظه: أوامر الخلط في الخطوات 4-1-1-4.1.6 قابله للتبادل. ومع ذلك ، مره واحده ATP ، MTs ، والمحركات مختلطة ، والمحركات تبدا في استهلاك ATP في حين يخطو علي طول MTs. يتم تنشيط العينة مع عمر محدود بسبب الوقود المحدود (ATP و PEP) ، التالي يجب ان تبدا التجربة علي الفور. يجب ان تحتوي علي السائل النشط النهائي 1.3 ملغ/مل MT ، 120 nM كينيسن مجموعات المحركات ، 5.5 mm dtt ، 0.8 ٪ ث/ث PEG ، 1.4 mm ATP ، 2.8 ٪ v/الخامس PK/ldh ، 27 مم PEP ، 2 مم trolox ، 0.038 mg/ml catalase ، 0.22 ملغ/مل اكسيداز الجلوكوز ، 3.3 ملغ/مل الجلوكوز ، و 0.0004 ٪ v/v الغروانيه في ارتفاع الملح M2B
  2. اعداد عينه في قناه تدفق (المعدلة من ششاناكار وآخرون46):
    1. شطف الشرائح الزجاجية المغلفة بولياكرياميد والمشبك (الخطوة 3.7) مع المياه DI. تجفيف النظارات مع الهواء المضغوط. ضعها علي سطح مستو ونظيف.
    2. قطع شريطين من الأفلام الشمع مع عرض 3 ملم وبنفس طول الزجاج كوفيرسليب (20 ملم). ادراج الشرائط بين الشريحة و كوفيرسليب كفواصل قناه.
    3. التمسك الزجاج إلى الفيلم الشمع عن طريق وضع الزجاج الشمع مجمع علي لوحه الساخنة 80 درجه مئوية لأذابه الشمع. اثناء الذوبان ، اضغط علي المشبك برفق بطرف ماصه لكي يلتزم بشكل موحد بفيلم الشمع علي الأسطح الزجاجية. بعد التصاق ، وتبريد مجمع الزجاج إلى درجه حرارة الغرفة.
    4. تحميل السوائل النشطة (الخطوة 4.1) إلى قناه التدفق. ختم القناة مع الغراء الاشعه فوق البنفسجية.

5. مراقبه درجه حرارة العينة

  1. بناء اعداد التحكم في درجه الحرارة (المعدلة من التصاميم في لووينسوهن et al. وو et al.47،48،49).
    1. اعداد كتله تبريد ألمنيوم.
      1. مطحنه لوحه ألومنيوم مع ابعاد ما يقرب من 30 مم × 30 مم × 5 مم.
      2. حفر قناه داخلية من خلال لوحه (الشكل 3ا) وتثبيت التجهيزات خرطوم في نهايات القناة.
      3. ربط كل المناسب إلى أنبوب المياه.
      4. توصيل أنبوب واحد إلى مضخة خزان الأسماك في خزان المياه في حين تمديد الأنبوب الآخر إلى الخزان.
        ملاحظه: ستقوم المضخة بتوزيع مياه الخزان من خلال قنوات ألمنيوم الداخلية للحفاظ علي درجه حرارة الكتلة عند درجه حرارة الغرفة تقريبا.
    2. سلك بروده حراريه (TEC) و thermosensor إلى وحده تحكم في درجه الحرارة. قم بتوصيل وحده التحكم بالكمبيوتر باستخدام منفذ USB (الشكل 3B).
    3. سلك وحده تحكم درجه الحرارة إلى تيار مباشر (DC) إمدادات الطاقة. تشغيل وحده التحكم عن طريق توصيل إمدادات الطاقة إلى ماخذ كهربائيه.
    4. قم باجراء الاعداد الاولي للمجلس التنفيذي الانتقالي بعد دليل الشركة المصنعة لوحده التحكم. اختبار الإخراج TEC. فمن المستحسن للسيطرة علي وحده تحكم درجه الحرارة عن طريق البرمجيات المقدمة من قبل الشركة المصنعة ، مما يسمح بتسجيل البيانات thermosensor وأسهل التلاعب من وحده تحكم درجه الحرارة.
    5. تحديد جوانب التدفئة والتبريد للمجلس التنفيذي الانتقالي.
    6. قم بتوصيل جانب التبريد الخاص ب TEC علي كتله التبريد (الخطوة 5.1.1) باستخدام المعجون الحراري.
    7. قم بتوصيل قرص زفير إلى جانب التسخين الخاص ب TEC باستخدام عجينه حراريه.
    8. اكتمل الاعداد. سطح الياقوت و thermosensor يمكن الاتصال عينه لتبريد وتسخين العينة علي أساس درجه الحرارة ودرجه الحرارة المستهدفة.
      ملاحظه: من المستحسن ان اللجنة التنفيذية وكتله التبريد لديها ثقب مركزي الانحياز للتصوير العينات باستخدام المجهر الميداني الساطع (الشكل 3ج).
  2. استخدم اعداد التحكم في درجه الحرارة للتحكم في درجه حرارة العينة33.
    1. تحميل العينة إلى الاعداد.
      1. ضع عينه السائل النشطة (الخطوة 4.2.4) علي سطح الزفير مع الجانب المنزلق الاتصال بالسطح.
      2. تامين الشريحة الزجاجية مع الشريط الورقي.
      3. إرفاق thermosensor إلى سطح كوفيرسليب باستخدام الشريط النحاسي.
    2. جبل الاعداد علي مرحله المجهر مع الجانب كوفيرسليب التي تواجه نحو الأهداف. علي سبيل المثال ، علي المجهر المقلوب ، يجب ان الجانب كوفيرسليب الوجه إلى أسفل. تامين الاعداد مع شريط الورق والمشابك ابره مرحله المجهر إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظه: يجب ان المرحلة درجه الحرارة المقدمة العمل مع المجاهر المشتركة التي اما مقلوبه أو تستقيم. لضمان عدم نقل مرحله درجه الحرارة اثناء التجربة ، فمن الأفضل لتامين مرحله درجه الحرارة إلى مرحله المجهر مع الشريط.
    3. التحكم في درجه حرارة العينة.
      1. بدوره علي وحده تحكم درجه الحرارة ومضخة خزان الأسماك.
      2. اتبع دليل الشركة المصنعة لتعيين درجه الحرارة المستهدفة وتمكين التحكم في درجه الحرارة. فان وحده تحكم ضبط التدفئة أو التبريد السلطة علي أساس درجه الحرارة المستهدفة ودرجه حرارة العينة ، كما تقييمها من قبل thermosensor.
    4. سجل درجات حرارة العينة.
      1. اتبع دليل الشركة المصنعة لتسجيل بيانات درجه الحرارة الحرارية اثناء التجربة.
        ملاحظه: يجب الآن ان يتم التحكم في درجه حرارة العينة من قبل وحده التحكم وتسجيلها من قبل الكمبيوتر (الشكل 3د).

6. تميز نشاط السوائل النشطة (المعدلة من الأساليب من قبل henkin et al. وو et al.20,27)

ملاحظه: يتم استخدام المقاطع السابقة لاعداد عينات السوائل النشطة (الأقسام 1 – 4) والتحكم في درجه حرارتها (القسم 5). لإثبات استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي نشاط السوائل النشطة ، ومراقبه السلوكيات السوائل ، وتحليل أنشطتها ، وتميز استجابتها لدرجه الحرارة.

  1. مراقبه المتتبعين.
    1. صوره العينة مع فاصل ثابت Δt باستخدام البروتين الفلوري الأخضر (gfp) الفلورية للتقاط حركه جزيئات التتبع.
      ملاحظه: يجب اختيار Δt للسماح بتعقب حركه التتبع. القيم Δt كبيره ، مثل 100 s ، يؤدي إلى فقدان مسارات التتبع ، في حين ان القيم Δt قصيرة ، مثل 0.1 s ، منع خوارزميه تتبع من الكشف عن حركه التتبع بين الإطارات. وينبغي ان العمل Δt تسمح الازاحه المقتفي بين الإطارات لتكون داخل ~ 9 بكسل. بالنسبة لمتتبعي التصوير المتحركين بمعدل 10 ميكرومتر/ثانيه باستخدام هدف 4x ، يوصي بان تكون Δt 1 – 5 ثانيه.
    2. حفظ الصور كملفات TIFF ، اسم الملفات استنادا إلى رقم الإطار ، وتخزينها في مجلد منفصل. هذه العمليات ضرورية لضمان ان الصور المكتسبة سيتم تحليلها بشكل صحيح مع البرنامج النصي MATLAB المقدمة (الخطوة 6.2.2).
  2. تتبع المتتبعين اعتماد برنامج التتبع التي وضعتها ouellette et al.50,51):
    1. قم بتنزيل برنامج التتبع من مختبر التعقيدات البيئية ، جامعه ستانفورد (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). تاكد من ان كل ملف MATLAB في نفس المجلد.
    2. تتبع متتبعي المسارات باستخدام برنامج نصي MATLAB مخصص: particle_tracking. يقرا البرنامج النصي صور التتبع (الخطوة 6.1) ويتتبع حركه التتبع باستخدام برنامج ouellette et al.50,51. فانه إخراج ملفين: 1) الخلفية. tif ، والتي تمثل خلفيه الصورة ، و 2) تتبع. حصيره ، التي تحتوي علي مسارات الجسيمات والسرعات في كل اطار (الشكل 4ا).
  3. تحليل متوسط التتبع سرعات باستخدام النصي MATLAB مخصصه: تحليل. م. يقرا البرنامج النصي ملف التتبع (تتبع حصيره) والمخرجات متوسط سرعه القصبات مقابل الوقت ، جنبا إلى جنب مع متوسط الوقت يعني سرعه مع المتوسط المحدد ويندوز (الشكل 4ب)33.
  4. تسجيل سرعه متوسط متوسط الوقت.
  5. قياس المتوسط الزمني متوسط السرعة عن طريق تكرار التجربة (الخطوات 4 ، 5.2 و 6.1-6.4) في 10-40 درجه مئوية. استخدم السرعات المتوسطة المسجلة لرسم متوسط السرعة مقابل درجه الحرارة (الشكل 4ج)33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتطلب اعداد السوائل النشطة المستندة إلى المحركات التي تعتمد علي الطن المتري كلا من كينيسن و MTs. تم بلمره MTs من الأنابيب المسمية (الخطوات 1.3 و 1.4) التي تم تنقيتها من أدمغه الأبقار (الخطوة 1.1 ، الشكل 2ا) ، تليها أعاده التدوير لتعزيز النقاء (الخطوة 1.2 ، الشكل 2ب). تم التعبير عن بروتينات المحرك كينيسن في وتنقيتها من كولاي (الخطوات 2.1 و 2.2 ، الشكل 2ب)4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيطرة علي المادة النشطة في الموقع يفتح الباب لتنظيم الذاتي الموجهة من المواد النشطة4,5,24,28,54. في هذه المقالة ، ونحن نقدم بروتوكول لاستخدام درجه الحرارة للسيطرة علي kinesin يحركها ، والسوائل النشطة القائمة علي MT في الموقع ، استنادا إلى خصائص arrhenius من النظام29،30،31...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plasmid K401-BCCP-H6 كان هديه من الدكتور Zvonimir Dogic. تم دعم هذا البحث من قبل الدكتور كون-تا وو صندوق البدء في معهد البوليتكنيك وستر. نشكر الدكتور Zvonimir Dogic علي البروتوكولات لتنقيه وتسميه الأنابيب وتوليف السوائل النشطة. نحن ممتنون للدكتور مارك ريدلا علي خبرته في التعبير عن البروتين وتنقيته. نشكر الدكتور وليام بنيامين روجر لمساعدتنا في بناء المرحلة التي تسيطر عليها درجه الحرارة. ونحن نعترف برديس MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) لاستخدام مرفق المواد البيولوجية (BMF). ونحن نعترف الجمعية الملكية للكيمياء لتكييف الأرقام من بات وآخرون علي لينه المسالة33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-هيدروكسي -2،5،7،8-tetramethylchromane-2-carboxylic acidSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3- (Trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريلات ، 98٪ ، ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3.2 مم ID. Tygon Tubing R-3603HACH2074038أنابيب المياه
بقطر 31.75 مم غير مطلي ، نافذة الياقوتEdmund Optics43-637قرص الياقوت
3M 1181 شريط نحاسي - 1/2 بوصة عرض × 18 ياردة الطول - 2.6 مل السماكة الكلية - 27551R.S. HUGHES054007-27551شريط نحاسي
حمض الخليكSigma-AldrichA6283
محلول أكريلاميد (40٪ / الرحلان الكهربائي) ، كواشف فيشر الحيويةفيشر ScientificBP1402-1
هيدرات ملح الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات ثنائي البوتاسيومسيجما ألدريتشA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher ScientificA20006صبغة فلورية حمراء فارغة. يمكن تعليق Alexa 647 مسبقا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) قبل خلطه مع الأنابيب الدقيقة (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 وحدة تصفية الطرد المركزيSigma-AldrichUFC801024أنبوب مرشح الطرد المركزي. الوزن الجزيئي القطع: 10 كيلو دالتون
بيرسلفات الأمونيوم ، 100 جرام ، MP Biomedicalsفيشر ScientificICN802829APS
ملح الصوديوم الأمبيسلين (مسحوق بلوري) ، كواشف فيشر الحيويةفيشر ScientificBP1760أمبيسلين
المضادة للاهتزازنيكون63-7590S
Avanti J-E جهاز طردبيكمانكولتر 369001
باكتو أجار عامل التعبئة ، BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotinAlfa AesarA14207
دلو بلاستيك أبيض - 2 جالونBon84-715دلو ماء
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش746495CaCl2
Catalase من كبد البقرSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjنيكونMRD000454x الهدف الجوي
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shiftنيكون96372مكعب مرشح GFP
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5مبرد كهروحراري (TEC)
كلورامفينيكول ، 98٪ ، ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
كتلة تبريدN / AN / Aمخصص من الألومنيوم المطحون
Coomassie Brilliant Blue R-250 # 1610400Bio-Rad1610400صبغة ثلاثي الفينيل ميثان
D- (+) - الجلوكوزسيجما ألدريتشG7528
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (ACS معتمد) ، فيشر كيماوياتفيشر ScientificD128DMSO
DL-1،4-Dithiothreitol ، 99٪ ، للكيمياء الحيوية ، ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 مركب المشتت الحراريDow1446622معجون حراري
كحول إيثيلي ، 200 PROOF ACS / USP / NF GRADE 5 جالون بولي مكعبPharmco بواسطة Greenfield Global111000200CB05الإيثانول
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N '، N'-حمض التتراأسيتيكسيجما-ألدريتشE3889EGTA
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكسيجما ألدريتش798681EDTA
فيشر الكواشف الحيوية ميكروبيولوجيا المضافة وسائل الإعلام: TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Addition: مستخلص الخميرةFisher ScientificBP1422مستخلص الخميرة
Fluoresbrite YG المجهري ، درجة المعايرة 3.00 & micro ؛ مPolysciences18861جزيئات التتبع
الجلوكوز أوكسيديز من الرشاشيات النيجرسيجما ألدريتشG2133
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516
GpCppجينا بيوساينسNU-405Lجوانوزين -5 '[ (α,β)-ميثيلينو] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP)
GS Power 18 (سلك أمريكي حقيقي Ga) ، 100 قدم ، 99.9٪ تقطعت بهم السبل من النحاس الخالي من الأكسجين OFC ، أحمر / أسود 2 موصل سلك مضغوط سلك الطاقة / مكبر الصوت كابل كهربائي للسيارة والصوت والمسرح المنزليB07428NBCW أمازونسلك نحاسي
Guanosine 5'-ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدراتSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939المنظفات
HEPES ملح الصوديوم (مسحوق أبيض) ، كواشف فيشر الحيويةفيشر ScientificBP410NaHEPES
آلة خلاط عالية الأداءAIMORESAS-UP1250
خلاط له GraviTrapGE Healthcare11003399عمود الجاذبية
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758الأيزوبروبيل بيتا ؛ D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد
كحول الأيزوبروبيل 99٪فارمكو من Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 الدواربيكمان كولتر369687
L-حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدراتسيجما ألدريتشG1501K-Glutamate
Lysozyme من بياض بيض الدجاجSigma-AldrichL6876
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM2670MgCl2 & 6H2O
ملح الصوديوم MESSigma-AldrichM50572- (N-Morpholino) ملح الصوديوم حمض الإيثان سولفونيك
MOPSسيجما-ألدريتشM12543- (N-مورفولينو) حمض البروبان سلفونيك
MP-3022TE TechnologyMP-3022المزدوجة الحرارية
N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE 99٪ ، ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS مقياس الطيفالضوئي الحراري فيشر E112352 العلميمطياف
نيكون Ti2-E نيكون مجهر مقلوبنيكونMEA54000
نورلاند لاصق بصري 81منتجات نورلاندNOA81الأشعة فوق البنفسجية الغراء
Novex شارب البروتين الملون مسبقا القياسيThermo Fisher ScientificLC5800سلم البروتين القياسي
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein Gel ، 1.5 مم ، 10 آبارThermo Fisher ScientificNP0335BOXجل SDS
Optima L-90K Ultra CentrifugeBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap ، 4 بوصات عريضة ؛ 125 قدم / لفةكول بارمرEW-06720-40فيلم شمع
PE 300 نظام إضاءة فائق النطاق ، 3 مم دليل الضوء التحكم في جراب التيار الإمدادبالطاقة نيكونPE-300-UT-L-SB-40إضاءة LED باردة
فينيل ميثان سولفونيل فلوريدسيجما ألدريتش78830PMSF
ملح أحادي البوتاسيوم حمض الفوسفوينول بيروفيك ، 99٪BeanTown Chemical129745PEP
بيرس كوماس (برادفورد) مجموعة فحص البروتينThermo Fisher Scientific23200
بيرس بروتياز مثبط أقراص صغيرةThermo Fisher ScientificA32953
الأنابيبسيجما ألدريتشP67571،4-بيبيرازين ديثانيسولفونيك حمض
بلورونيك F-127سيجما ألدريتشP2443
بولي (إيثيلين جلايكول)سيجما ألدريتش81300PEG. متوسط الوزن الجزيئي 20,000 Da
هيدروكسيد البوتاسيوم (الكريات / ACS المعتمد) ، فيشر كيماويكفيشر ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W مزود الطاقة (115 فولت تيار متردد)ThermoFisher ScientificPS0300DC مصدر الطاقة لصندوق الجل
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4Aمصدر طاقة تيار مستمر لجهاز التحكم
في درجة الحرارةإنزيمات بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك من عضلة الأرانبSigma-AldrichP-0294PK / LDH
مضخة نافورة هادئة واحدة Lifegard ، 296 جالون في الساعة مضخةخزان الأسماكمن أمازونB005JWA612
Rosetta 2 (DE3) الخلايا المختصة - NovagenMillipore Sigma71403الخلايا المختصة
ميكروويف شارب ZSMC0912BS فرن ميكروويف كونترتوب شارب 900 واط ، 0.9 قدم مكعب ، ستانلس ستيلأمازونB01MT6JZMRميكروويف لغلي الماء
كلوريد الصوديوم (بلوري / معتمد ACS) ، فيشر كيميكالفيشر ScientificS271-500كلوريد الصوديوم
دوديسيل كبريتاتسيجما ألدريتشL3771SDS
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةسيجما-ألدريتشS8282NaH2PO4
ستريبتافيدين بروتينثيرمو فيشر العلمي21122
السكروزسيجما ألدريتشS7903
TC-720TE TechnologyTC-720جهاز التحكم في درجة الحرارة
قاعدة تريس ، درجة البيولوجيا الجزيئية - CAS 77-86-1 - كالبيوكيمسيجما ألدريتش648310تريس-هيدروكلوريك
نوع 45 Ti الدواربيكمان كولتر339160
النوع 70 Ti الدواربيكمان كولتر337922
النوع 70.1 Ti الدواربيكمان كولتر342184
VWR شريط وضع العلامات على المختبر للأغراض العامةVWR VWR89097-916أشرطة ورقية
نظارات VWR ذات غطاء صغير ، مربعة ، رقم 1 1/2VWR48366-227أغطية زجاجية
VWR شرائح صغيرة عادية وبلورية ، شرائحزجاجيةفاخرة VWR75799-268
XCell SureLock صندوق جل خليةصغيرة ThermoFisher ScientificEI0001
ZYLA 5.5 USB3.0 كاميرانيكونZYLA5.5-USB3أحادية اللون CCD
طاولة مركزي مقياس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002(2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102(2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114(2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375(2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470(2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688(2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1(2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246(2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564(2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486(2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601(2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037(2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102(2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142(2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102(2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333(1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006(2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304(2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microtubule Based Active FluidsKinesin Driven Flow ControlTemperature Tuning MethodFlow Speed RegulationActive Fluid PreparationFluorescent Microscopy ImagingTracer Particle TrackingTemperature Control SetupMicrofluidic Device DesignArrhenius Characteristic Analysis

Related Articles