فصل مغلف الخلية للبكتيريا سالبة الجرام إلى كسور الغشاء الداخلي والخارجي مع التعديلات التقنية لـ Acinetobacter baumannii

ملخص

تنتج البكتيريا السالبة للجرام غشاءين منفصلين مكانًا. يتم تقسيم الغشاء الخارجي من الغشاء الداخلي بواسطة periplasm وطبقة peptidoglycan. كانت القدرة على عزل الطبقات الثنائية من هذه الميكروبات حاسمة لفهم فسيولوجيا ها ومسببات الأمراض.

الملخص

تعمل هذه الطريقة عن طريق تقسيم مغلف البكتيريا السالبة للجرام إلى كسور غشاء إجمالي وداخلي وخارجي (OM) وتختتم بمقالات لتقييم نقاء الطبقات الثنائية. وOM لديها زيادة الكثافة الإجمالية بالمقارنة مع الغشاء الداخلي، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى وجود lipooligosaccharides (لوس) وlipopolysaccharides (LPS) داخل النشرة الخارجية. جزيئات لوس وLPS هي الدهون الغليكوليبيدات الأمبيباثية التي لها بنية مماثلة ، والتي تتكون من الدهون - A disaccharolipid والأساسية oligosaccharide substituent. ومع ذلك، يتم تزيين جزيئات LPS فقط مع وحدة فرعية ثالثة تعرف باسم O-polysaccharide، أو O-مستضد. سيؤثر نوع وكمية الدهون الغليكوبيدية الموجودة على كثافة OM للكائن الحي. لذلك ، اختبرنا ما إذا كانت أغشية البكتيريا ذات محتوى الغليكوبيد المتنوع يمكن عزلها بالمثل باستخدام تقنيتنا. بالنسبة للكائنات الحية المنتجة لـ LPS ، السالمونيلا enterica serovar Typhimurium وEscherichia coli، تم عزل الأغشية بسهولة ولم يؤثر MOS O-antigen على التقسيم الثنائي الطبقات. Acinetobacter baumannii تنتج جزيئات لوس, التي لديها كتلة مماثلة لجزيئات إل بي س المستضد ناقص O; ومع ذلك ، لا يمكن فصل أغشية هذه الميكروبات في البداية. لقد قمنا بمعلل أن OM of A. baumannii كانت أقل كثافة من تلك التي من Enterobacteriaceae ، لذلك تم تعديل تدرج السكروز وعزل الأغشية. وبالتالي يمكن تكييف هذه التقنية وتعديلها لاستخدامها مع الكائنات الحية الأخرى.

المقدمة

البكتيريا سالبة الغرام تنتج اثنين من الأغشية التي يتم فصلها عن طريق الفضاء periplasmic وجدار الخلية peptidoglycan^1. الغشاء الداخلي (IM) يغلف السيتوسول وهو ثنائي طبقة متماثلة من الفوسفوليبيدات. Peptidoglycan يحمي ضد ضغط تورغور ويوفر البكتيريا مع شكل الخلية، وتعلق على الغشاء الخارجي (OM) عن طريق البروتينات الدهنية^2،3. وOM تحيط periplasm وغير المتماثلة في الغالب. تتكون النشرة الداخلية من الفوسفوليبيدات وتتكون النشرة الخارجية من غليكوليبيدات تعرف باسم ليبوليغوساكيريديس (LOS) أو ليبوبوليكيساسيدس (LPS)^4،5. عدم التماثل في الدهون والكيمياء الحيوية لجزيئات لوس / LPS في المنشور الخارجي يضفي خصائص الحاجز على سطح الخلية التي تحمي البكتيريا من المخاطر في بيئتها^6,7.

تتكون جزيئات LPS من ثلاثة مكونات: الدهون A disaccharolipid ، وoligosaccharide الأساسية ، وO-polysaccharide أو O-مستضد. الدهون A هو disaccharolipid متضاعف. تتكون core-oligosaccharides من 10-15 السكريات المعروفة باسم LPS الخام أو R-LPS. وينقسم اللب إلى المنطقة الداخلية، ويتألف من 2-كيتو-3-ديوكسي-د-مانو-حمض الثمانية وثماني سونيك (kdo) واحد أو أكثر من بقايا heptose، والمنطقة الخارجية التي تتكون عموما من الهكسوس (الجلوكوز أو الجالاكتوز) وهيبتوس، أو السكريات الأسيتاميد⁵. المنطقة الأساسية الخارجية هي أكثر متغيرة في مكوناتها وبنيتها من النواة الداخلية. في السالمونيلا spp., وقد وصفت هيكل واحد فقط الأساسية; ومع ذلك، في الإشريكية القولونية هناك خمسة هياكل أساسية مختلفة (المعينة K-12، R1، R2، R3، و R4)⁸. E. القولونية K-12 DH5α، التي نستخدمها في هذا الإجراء يحمل طفرة أن يؤدي إلى إنتاج R-LPS^9. جزيئات R-LPS تفتقر إلى moiety O-مستضد ولها وزن جزيئي مماثل لجزيئات لوس.

إضافة O-مستضد إلى R-LPS يحول هذا الجزيء إلى LPS على نحو سلس، أو S-LPS. تم بناء المستضدات O من الوحدات الفرعية الكربوهيدرات 3-4 قصيرة وتتكون من طرائق متعددة مع أطوال سلسلة متفاوتة¹⁰. بعض البكتيريا المنتجة LPS، مثل السالمونيلا enterica سيروفار تيفيموريوم(S. Typhimurium), عرض توزيع ثلاثي الوسائط من جزيئات LPS على سطحها^10,11. سلسلة طويلة جدا O-المستضدات يمكن أن تحتوي على أكثر من مائة وحدة فرعية وتزن أكثر من مائة كيلودالتون. توفر المستضدات O خصائص سطحية للبكتيريا الضرورية لمقاومة المضادات الحيوية ، والتهرب من الافتراس عن طريق البكتيريا ، وتسبب المرض.

أنواع كامبيلوباكتر، بوردتيلا، Acinetobacter، Haemophilus، النسيرية وغيرها تولد جزيئات لوس بدلا من جزيئات LPS على سطحها^12. تتكون جزيئات LOS من الدهون A وoligosaccharides الأساسية ولكنها تفتقر إلى المستضد O. هذه الأنواع من البكتيريا السلبية غرام تعديل oligosaccharides الأساسية مع السكريات إضافية وتركيبات من السكريات لتغيير خصائص السطح¹². كل من الميكروبات التي تنتجها لوس وLPS اشتقاق الفوسفات على الدهون A والجزيئات الأساسية مع moieties cationic⁷. وتشمل هذه الإضافات فوسفوإيثانولامين، والجالاكتوزامين وبدائل الأنف الأميني، والتي تعمل عن طريق تحييد الشحنة السطحية الأنيونية وبالتالي الحماية من الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية. البكتيريا سالبة الجرام أيضا تعديل بنية أوليغوساكاريد الأساسية مع بدائل متغيرة غير stoichiometric من السكريات، أو جزيئات إضافية الكدو، وتغيير عدد سلاسل أسيل على الدهون-A disaccharolipids⁷.

القدرة على عزل الدردشة من OM من البكتيريا السلبية غرام كان مفيدا لفهم دور مغلف الخلية في مقاومة مضادات الميكروبات ومرض المرض^11,12. وقد استخدمت اشتقاقات هذا النهج لاستخلاص آليات التجميع والصيانة وإعادة عرض مكونات البروتين والفوسفوليبيد والغليكبيدين لـ OM.

يقوم مختبرنا بشكل روتيني بإجراء تحليلات الدهون البكتيرية لدراسة تنظيم الدهون بوساطة البروتين ووظيفة الدهون في مجموعة متنوعة من الأنواع السلبية للجرام. تعكس الأحجام المستخدمة في البروتوكول الاستخدام الروتيني لهذا الإجراء لتحليل الفوسفوليبيدات غير الملصقة بالراديو بواسطة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة وكروماتوغرافيا سائلة جنباإلى جنب الطيف الكتلي^13،14.

يبدأ البروتوكول بتعريض تعليق مبرد للبكتيريا سالبة الجرام إلى محلول سكروز عالي السكروز وإضافة الليسوزيمي لفصل OM عن طبقة peptidoglycan الأساسية(الشكل 1)¹². ثم يتم إضافة EDTA لتسهيل اختراق الليسوزيم ، لأن عزل التقاض المقسوم يعطل تفاعلات التجسير الكهروستاتيكي ة الجانبية بين جزيئات LOS / LPS المجاورة¹⁵. البروتوكول الأصلي الذي تم تكييفلنا يتطلب تشكيل spheroplasts، شكل الخلية البكتيرية السلبية غرام التي تتكون من غشاء البلازما والسيتوسول، ولكن يفتقر إلى طبقة peptidoglycan وOM. فمن الممكن أن يتم إنتاج spheroplasts عن طريق طريقة تكييفها; ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لا تعتمد أو تنوي تشكيلها للنجاح. بدلا من ذلك ، يتم حصاد البكتيريا المعالجة lysozyme-EDTA بسرعة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في محلول السكروز من تركيز أقل قبل الانحلال المضغوط. وينبغي نظرياً أن تكون الآليات اللوائية التي قد تكون قد أُفرج عنها عن طريق تشكيل السُبل الكروية قابلة للحصاد من الخلايا الخارقة، ولكن هذا النهج غير مفصل هنا. في نهاية المطاف ، تخضع الخلايا المعالجة للتجانس التقليدي وتحلال الدم ، مما يعزز كفاءة وتكرار إجراء فصل الغشاء^16.

بعد الانزل ، يتم جمع الأغشية الإجمالية عن طريق ultracentrifugation وتطبيقها على تدرج كثافة السكروز متقطع ة لكسور IMs و OMs. النهج الكلاسيكي يستخدم التدرج أكثر مستمرة التي تتكون من ما لا يقل عن خمسة حلول السكروز مختلفة^11،12. التدرج المتقطع في بروتوكولنا يتكون من ثلاثة حلول السكروز ويقسم الطبقات الثنائية إلى كسرين متميزين^17. جزيئات لوس وLPS داخل OMs من البكتيريا سالبة الغرام محرك المغلف لتقسيم إلى أعلى البني منخفضة الكثافة IM جزء وأسفل أبيض عالي الكثافة OM كسر(الشكل 1 والشكل 2).

Acinetobacter baumannii هي أهم مسببات الأمراض البشرية المقاومة للأدوية التي تنتج جزيئات LOS في OM الخاصة بهم وإقامة مغلف الخلية التي يصعب فصل^18،19. يشير العمل الأخير إلى أن اشتقاق البروتوكول الذي نقدمه هنا يمكن استخدامه لتقسيم الطبقات الثنائية لهذه الكائنات^20. لذلك، اختبرنا بروتوكولنا على A. baumannii 17978. في البداية، كان الإجراء غير كاف. ومع ذلك، قمنا بتعديل تركيز السكروز من محلول الكثافة الوسطى وتحسنت كثيرا فصل(الشكل 2). تم استخدام فحص NADH dehydrogenase وإجراءات استخراج كشف LOS/LPS لتأكيد الانفصال عن A. baumannii، من النوع البري S. التيفيموريوم واثنين من O-مستضد نقص الأنماط الجينية البكتيرية; وهي، galE-متحولة S. التيفيموريوم وسلالة مختبرية، E. coli DH5α(الشكل 3 والشكل 4).

الغرض من هذا العمل هو توفير نهج مبسط لعزل أغشية البكتيريا السلبية الجرامية بشكل مستنسخ. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة العديد من أنواع الجزيئات المرتبطة بالأغشية لهذه الميكروبات.

البروتوكول

1. الكواشف العامة وإعداد وسائل الإعلام لاستخراج الغشاء

1. وسائل الإعلام النمو البكتيرية: إعداد وتعقيم 1 لتر من وسائل الإعلام مرق في تنظيفها تماما وأوتوكلاف 2 L قارورة.
2. العازلة العامة لإعادة التعليق (1 M تريس المؤقت درجة الحموضة 7.5; 50 مل): حل 6.05 غرام من قاعدة تريس في 30 مل من H₂O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 مع 5 M HCl. ضبط الصوت النهائي إلى 50 مل مع Ultrapure H₂O.
3. مخزون رئيسي من محلول التقطير الكحيب (0.5 M EDTA pH 8; 100 مل): أضف 18.6 غرام من رباعي اتلاسيتات الإيثيلين ثنائي الصوديوم·2H₂O إلى 80 مل من H₂O. Stir بقوة وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 مع NaOH. ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 100 مل مع Ultrapure H₂O.
   ملاحظة: الملح ثنائي الصوديوم من EDTA لن تذوب حتى يتم تعديل درجة الحموضة من المحلول إلى ~ 8.0 بإضافة NaOH.
4. المخزن المؤقت الأوزموطي A (0.5 M السكروز, 10 mM تريس درجة الحموضة 7.5; 1 L): وزن 171.15 غرام من السكروز ونقل إلى 1 L اسطوانة. إضافة 10 مل من 1 M تريس درجة الحموضة 7.5. ضبط لحجم النهائي من 1 L مع ultrapure H₂O. مخزن في 4 درجة مئوية.
5. ليسوزيمي (10 ملغ/مل؛ 5 مل): وزن 50 ملغ من (بياض الدجاج البيض) والليسوزيم وتذوب في 5 مل ultrapure H₂O. مخزن في 4 °C.
6. مُخفف مُثل التَقْرَب (1.5 mM EDTA؛ 500 مل): أضف 1.5 مل من 0.5 متر EDTA (الخطوة 1.3) إلى 497.5 مل فائق النقاء H₂O. Store عند 4 درجات مئوية.
7. العازلة الأوزموتيك B (0.2 M السكروز, 10 mM تريس درجة الحموضة 7.5; 2 L): وزن 136.8 غرام من السكروز ونقل إلى اسطوانة 2 L. إضافة 20 مل من 1 M تريس درجة الحموضة 7.5. ضبط حجم النهائي إلى 2 L مع ultrapure H₂O. مخزن في 4 درجة مئوية.
8. Nuclease العامل المشارك (1 M MgCl₂; 10 مل): حل 2.03 غرام من MgCl₂· 6H₂O في 8 مل من Ultrapure H₂O. ضبط حجم الصوت إلى 10 مل. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
9. كوكتيل حل Nuclease بما في ذلك إنزيمات RNase و DNase: انظر جدول المواد. تخزين في -20 درجة مئوية.
10. كوكتيل مثبط بروتياز: انظر جدول المواد. تخزين ها 4 درجة مئوية.
11. منخفضة الكثافة isopycnic محلول التدرج السكروز (20٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5 الحل؛ 100 مل): تزن 20 غرام من السكروز ونقلها إلى اسطوانة 200 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer pH 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع فائقة H₂O. مخزن في درجة حرارة الغرفة.
12. متوسطة الكثافة isopycnic محلول التدرج السكروز (53٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1mM تريس درجة الحموضة 7.5 الحل؛ 100 مل): تزن 53 غرام من السكروز ونقلها إلى اسطوانة 200 مل تخرج. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer pH 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع فائقة H₂O. مخزن في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إعداد هذا الحل في اسطوانة تخرج لضمان الدقة بسبب ارتفاع نسبة السكروز. إضافة شريط اثارة المغناطيسي ويحرك حتى يذوب السكروز تماما في الحل. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات.
13. عالية الكثافة isopycnic محلول التدرج السكروز (73٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5 الحل؛ 100 مل): تزن 73 غرام من السكروز ونقلها إلى اسطوانة 200 مل تخرج. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer pH 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. ضبط حجم النهائي إلى 100 مل مع فائقة H₂O. مخزن في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إعداد هذا الحل في اسطوانة تخرج لضمان الدقة بسبب ارتفاع نسبة السكروز. يُضاف شريط التحريك المغناطيسي ويُحرّك حتى يذوب السكروز تمامًا. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات.
14. معزولة غشاء-مخزن المخزن المؤقت (10 mM تريس الحاجز درجة الحموضة 7.5; 1 L): إضافة 1 مل من 1 M تريس عازلة درجة الحموضة 7.5 إلى قارورة 1 L وضبط وحدة التخزين النهائية إلى 1 لتر مع فائقة H₂O.
15. α-نيكوتيناميد أدينين dinucleotide (NADH) (10 ملغ / مل الحل): إعادة تعليق 10 ملغ من NADH في Ultrapure H₂O. إعداد مخزونات جديدة, أسبوعيا. تخزين في -20 درجة مئوية.
16. محلول الفينول مراوغ مع 10 mM تريس HCl، درجة الحموضة 8.0، 1 mM EDTA: انظر جدول المواد. تخزين الحل في 4 درجة مئوية.
17. Lipopolysaccharide هلام مجموعة وصمة عار: انظر الجدول من المواد.
18. برادفورد كاشف: انظر جدول المواد.
    ملاحظة: يجب إعداد كافة الحلول والوسائط خلال أسبوع إجراء الملاحظة لضمان نتائج متسقة.

2. إعداد البكتيريا لاستخراج الغشاء

1. سلسلة البكتيريا من مخزونات الجلسرين المجمدة على لوحات أجار الطازجة. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية بمجرد تطوير المستعمرات. Inoculate مستعمرة واحدة في أنبوب 5 مل مليئة وسائل الإعلام مرق والثقافة البكتيريا كما هو مطلوب بين عشية وضحاها.
2. مرة أخرى تمييع الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها إلى 1 لتر من وسائل الإعلام مرق المفضلة والثقافة البكتيريا حتى يتم تحقيق الكثافة البصرية المطلوبة.
   ملاحظة: ينصح بتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في 1 لتر من وسائط المرق للأنماط الجينية المتحولة التي تكون عرضة لقمع الأنماط الظاهرية للنمو ، ولكن بعض البكتيريا السلبية للجرام تنمو ببساطة أبطأ من غيرها. إذا لم يكن من الممكن تحقيق كثافة ثقافية كافية عن طريق التطعيم أحادي المستعمرة ، فإن تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها إلى 1 لتر من الوسائط هو استراتيجية واحدة لمزامنة النمو. يختلف تكوين الغشاء البكتيري حسب مرحلة نمو الثقافة (اللوغاريتمي مقابل المرحلة الثابتة)^13. وينبغي إجراء منحنيات النمو قياس التغير في الكثافة البصرية للثقافات البكتيرية كدالة للوقت مع جميع السلالات لربط كثافة الثقافة مع مرحلة النمو.
3. تعيين القوارير التي تحتوي على ثقافات مرق على الجليد. قراءة الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD₆₀₀₎وحساب حجم الثقافة التي تعادل بين 6.0 و 8.0 × 10¹¹ وحدات تشكيل مستعمرة بكتيرية (cfu). لـ"س. Typhimurium، وهذا يتوافق مع 1 L من الثقافة في OD₆₀₀ من بين 0.6-0.8، منذ OD₆₀₀ من 1.0 يساوي ما يقرب من 1.0x10⁹ cfu/mL. أضف هذا الحجم إلى أنبوب الطرد المركزي وتأكد من بقاء الثقافات المتبقية على الجليد حتى يتم استخدامها.
4. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية في 7،000-10،000 × ز في زاوية ثابتة عالية السرعة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: تبريد مسبق وصيانة أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة منخفضة. الحفاظ على العينات على الجليد خلال الإجراء بأكمله.
5. Decant وتجاهل supernatant بعناية.
   ملاحظة: يمكن أن تكون فلاش بيليه المجمدة و / أو المخزنة في -80 درجة مئوية إذا كانت كسور الغشاء لن يتم استخراجها على الفور. ومع ذلك ، فمن المستحسن المضي قدما مباشرة مع الانبلج البلازمي في نفس اليوم يتم حصاد الخلايا ، ويوصى خصوصا للأنواع غير المعوية البكتيرية.

3. تفكك الغشاء الخارجي وبلازموبلاس

1. إذا ثب الكريات الخلية على الجليد إذا كانت مخزنة مسبقا في -80 درجة مئوية والاحتفاظ العينات على الجليد لبقية الإجراء. إعادة تعليق كل بيليه الخلية داخل أنبوب الطرد المركزي في 12.5 مل من المخزن المؤقت A. إضافة شريط ضجة مغناطيسية لتعليق الخلايا.
2. أضف 180 ميكرولتر من 10 ملغم/مل ليسوزيم (تركيز نهائي قدره 144 ميكروغرام/مل) إلى كل خلية إعادة تعليق. الحفاظ على العينات على الجليد أثناء التحريك لمدة 2 دقيقة.
3. إضافة 12.5 مل من 1.5 mM EDTA الحل إلى كل خلية إعادة تعليق ومواصلة التحريك على الجليد لمدة 7 دقيقة إضافية.
4. Decant التعليق في أنبوب مخروطي 50 مل والطرد المركزي في 9،000-11،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
5. التخلص من المواد الخارقة في حاوية نفايات المخاطر البيولوجية والاحتفاظ الكريات على الجليد.
6. إضافة 25 مل من المخزن المؤقت B إلى بيليه الخلية.
7. إضافة 55 ميكرولتر من 1 M MgCl₂، 1 μL من كاشف RNase / DNase nuclease (لتجنب مشاكل اللزوجة المرتبطة بالبكتيريا التي تخضع للانحلال البلازمي قبل التجانس) ، و 1 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات البروتياز إلى حجم المخزن المؤقت B الذي يجلس فوق بيليه الخلية
8. إعادة تعليق بيليه في خليط B المخزن المؤقت. الأنابيب بقوة والدوامة حتى مراقبة حل متجانس.
   ملاحظة: من المهم جداً أن يكون لديك حل متجانس قبل الانتقال إلى الخطوة 4 من هذا البروتوكول. يجب أن تحتوي الخلايا التي أعيد تعليقها على خليط كعكة لزج مثل المظهر والاتساق.
9. دوامة كل عينة لمدة 15 s. الاحتفاظ تعليق على الجليد والمضي قدما إلى الخطوة 4.

4. التجانس المضغوط والليسيس

ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق للانزل. سونيكيشن ليست مثالية بسبب توليد الحرارة. يمكن تحقيق الانزل التناسي ولكن غالبا ما يكون غير فعال. لذلك ، نوصي بإنلز الضغط العالي. يمكن تحقيق فقدان الضغط العالي باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات. نقترح آلات التجانس، مثل الصحافة الفرنسية أو Emusliflex. نحن نعمل مع العديد من أنواع البكتيريا السلبية الجرامية التي تختلف استجابتها لحلول السكروز الأوسمول العالية. تعمل خطوة التجانس عالية الضغط على تحسين الكفاءة والتكرار والغلة.

1. بريل خلية الصحافة الفرنسية في 4 درجة مئوية أو إدراج لفائف معدنية من آلة المتجانس على الجليد.
2. صب العينة في خلية الضغط الفرنسي أو اسطوانة عينة المتجانس وجلب الخلية تحت ضغط التجانس المطلوب (10،000 psi ينبغي أن تكون كافية عند استخدام الصحافة الفرنسية أو 20،000 psi عند استخدام المتجانس).
3. ضبط معدل تدفق المنفذ إلى انخفاض واحد تقريبًا في الثانية مع الحفاظ على الضغط إذا استخدم الصحافة الفرنسية.
4. جمع خلية تسيل في أنابيب مخروطية 50 مل مع الحفاظ على عينات على الجليد.
5. كرر الخطوات 4.2-4.4 ثلاث إلى خمس مرات لتحقيق الانزلات الكامل ، ويشار إليه عادة من خلال الزيادة التدريجية في شفافية العينة.
   ملاحظة: يجب غسل غرفة العينة وتوازنها مع المخزن المؤقت B بين العينات.
6. حافظ على الخلايا المعطلة على الجليد.

5. إجمالي كسر الغشاء

1. الطرد المركزي العينات البكتيرية مبلكلة في 6169 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية لبيليه المتبقية مواد الخلايا سليمة. (على سبيل المثال، الخلايا البكتيرية غير المنبأة).
2. توزيع الجزء المتبقي من supernatant، الذي يحتوي الآن على الأغشية المتجانسة في زجاجة بولي كربونات للحصول على ultracentrifugation.
   تنبيه: إذا لزم الأمر، يمكن موازنة عينات الخلايا عن طريق التخفيف مع المخزن المؤقت B.
3. Ultraالطرد المركزي الخلية يليس في 184500 × ز لمدة 1 ساعة على الأقل، في 4 درجة مئوية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة بين عشية وضحاها دون التأثير على نوعية الأغشية.
4. تجاهل ما تبقى من supernatant موجودة في أنبوب ultraالطرد المركزي والاحتفاظ الكريات غشاء على الجليد(الشكل 1).
5. إعادة تعليق الكريات الغشاء في 1 مل من محلول التدرج isopycnic-sucrose منخفضة الكثافة باستخدام متجانس الزجاج النفوق. استخدم ماصة بستر زجاجية لنقل متجانس العينة إلى أنبوب ميكروطرد مركزي 1.5 مل واحتفظ به على الجليد.
   ملاحظة: إذا كان تحليل تكوين الغشاء الكلي فقط مرغوبًا فيه ، فاستبدل 1 مل من محلول الانحدار منخفض الكثافة isopycnic-sucrose لـ 1 مل من المخزن المؤقت للغشاء المعزول. الخطوة 5.5 هي نقطة النهاية للعزلة إذا كانت عينات الغشاء البكتيري الكلي فقط مرغوبة. تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى مطلوب مزيد من التحليل المصب.

6. كثافة التدرج Ultracentrifugation لفصل الأغشية المزدوجة

1. جمع العدد المناسب من البولي بروبلين 13 مل أو أنابيب مفتوحة فائقة الوضوح المحدد لدوار دلو يتأرجح وultraالطرد المركزي.
2. عقد الأنبوب في وضع يميل قليلا وإعداد التدرج السكروز عن طريق إضافة ببطء حلول السكروز من كثافة أعلى إلى كثافة أقل في الترتيب التالي:
   2 مل من 73٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5
   4 مل من 53٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5
   1. بعد ذلك، أضف كسر الغشاء الكلي (1 مل)، والذي تم إعادة تعليقه في محلول السكروز بنسبة 20% w/v (الخطوة 5.5). تجنب خلط كسر الغشاء مع محلول السكروز الذي يقع تحته. يجب أن تكون التقسيمات مرئية بين كل من هذه الطبقات.
   2. وأخيرا، ملء أنبوب مع منخفضة الكثافة isopycnic-سكروز التدرج الحل (حوالي 6 مل). يجب ملء البولي بروبلين وأنابيب مكشوفة فائقة الوضوح بأكبر قدر ممكن (2 أو 3 مم من أعلى الأنبوب) لدعم الأنبوب.
3. تعديل لAcinetobacter baumannii 17978
   1. تكييف تدرج السكروز المعدلة للاستخدام مع عينات بكتيرية مختلفة. لA. baumannii، التدرج السكروز التالية التي أتاحت فصل أكثر اكتمالا من الأغشية(الشكل 2).
      2 مل من 73٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5
      4 مل من 45٪ ث / ضد السكروز، 1 mM EDTA، 1 mM تريس درجة الحموضة 7.5
   2. بعد ذلك، أضف كسر الغشاء الكلي (1 مل)، والذي تم إعادة تعليقه في محلول السكروز بنسبة 20% w/v (الخطوة 5.5). تجنب خلط كسر الغشاء مع محلول السكروز الذي يقع تحته. يجب أن تكون التقسيمات مرئية بين كل من هذه الطبقات.
   3. وأخيرا، ملء أنبوب مع منخفضة الكثافة isopycnic-سكروز التدرج الحل (حوالي 6 مل). يجب ملء البولي بروبلين وأنابيب مكشوفة فائقة الوضوح بأكبر قدر ممكن (2 أو 3 مم من أعلى الأنبوب) لدعم الأنبوب.
4. Ultraالطرد المركزي العينات باستخدام الدوار دلو يتأرجح في 288،000 × ز و 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: بالنسبة للوحدات المستخدمة في الخطوات السابقة، نوصي بأوقات الطرد المركزي بين 16 ساعة و23 ساعة.
5. قطع نهاية P1000 تلميح ماصة حوالي 5 ملم من هذه النقطة. قم بإزالة طبقة المراسلة الفورية العلوية البنية باستخدام الماصة. نقل كسر IM إلى زجاجة البولي لultracentrifugation.
6. اترك حوالي 2 مل من محلول السكروز فوق واجهة 53-73٪ لضمان عدم تلوث OM الأبيض السفلي بجزء المراسلة الفورية. كرر إجراء الأنابيب من الخطوة 6.4 لكسر OM(الشكل 1).
   ملاحظة: ويمكن أيضا أن يتم جمع الأغشية عن طريق ثقب أنابيب الطرد المركزي في الجزء السفلي باستخدام إبرة وجمع الأغشية ككسور dropwise.
7. ملء الفراغ المتبقي من أنبوب ultraالطرد المركزي مع المخزن المؤقت تخزين غشاء معزول ومزيج عن طريق الانعكاس أو الأنابيب. احتفظ بالعينات على الثلج.
8. جمع الأغشية المغسولة والمعزولة الآن عن طريق ultrarifugation في 184500 × ز لساعة واحدة و 4 درجة مئوية.
9. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الأغشية عن طريق التجانس التنوقية. إضافة 500-1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت التخزين. جمع العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل.
10. تخزين عينات الغشاء البكتيري في -20 درجة مئوية.

7. تأكيد انفصال الطبقات الثنائية

ملاحظة: يمكن أن يحدث فصل غير كامل للطبقات الثنائية بسبب خطأ فني أو تكوين مغلف الخلية الفريد لبعض الأنواع. لتأكيد الانفصال، ننصح باستخدام اثنين من المقالات المستقلة لتحديد درجة التلوث المتبادل بين الطبقات. يكتشف المناعي الأول النشاط الأنزيمي لـ NADH dehydrogenase ، والذي يوجد حصريًا في المراسلة الفورية. يكتشف الفحص الثاني وجود LOS أو LPS، والذي يوجد في الغالب في OM.

1. التأكد من عزل OMs من IMs
   1. قياس تركيز البروتين في كل جزء غشاء معزول باستخدام قياس بروتين برادفورد.
   2. أضف حجم العينة المقابلة بين 50 و 500 ميكروغرام من البروتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ بـ 2 مل. يختلف التركيز حسب الأنواع ، ولكن 50 ميكروغرام عادة ما يكون كافيا ً للEnterobacteriaceae. إضافة حجم مناسب من 10 mM تريس المخزن المؤقت لتحقيق حجم إجمالي 990 μL. نقل المحتوى إلى cuvette للقياس الطيفي.
   3. أضف 10 ميكرولتر من محلول 10 ملغ/مل من NADH إلى العينة وحدّص الامتصاص الأولي عند 340 نانومتر.
   4. مواصلة قياس امتصاص كل 30 s لمدة 5 دقيقة.
   5. تجميع البيانات والرسم البياني التغيير في امتصاص (ص المحور) مقابل التغير في الوقت (المحور س) لكل كسر غشاء(الشكل 3).
2. التأكد من أن IMs معزولة عن OMs
   1. أضف حجم العينة المقابلة بين 50 و 500 ميكروغرام من البروتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ بـ 2 مل. يختلف التركيز حسب الأنواع البكتيرية ، ولكن 50 ميكروغرام عادة ما يكون كافيا ً للEnterobacteriaceae. ملء إلى حجم النهائي من 100 ميكرولتر مع الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا، والتي يشار إليها فيما بعد باسم المرحلة المائية.
   2. إضافة 5 ميكرولتر من بروتينات K (تخزين 800 U/mL) إلى المرحلة المائية واحتضان بين عشية وضحاها في 59 درجة مئوية.
   3. دافئ ة 10 مل aliquot من الفينول تريس المشبعة لمدة 10 دقيقة في 68 درجة مئوية.
   4. تدور عينات المرحلة المائية التي عولجت مع Proteinase K وإضافة الفينول "الساخن" المشبع بتريس بنسبة 1:1 مع المرحلة المائية ، والدوامة بقوة واحتضان عند 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   5. نقل عينات بيضاء حليبي الآن من 68 درجة مئوية إلى حمام المياه الجليدية واحتضان لمدة 10 دقيقة.
   6. طرد العينات في 2100 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   7. نقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد وتخزين الأنبوب في -20 درجة مئوية إذا لم يتم استخدام العينة على الفور.
   8. تمييع العينات في المخزن المؤقت تحميل SDS وتحميل آبار هلام التدرج تريس الجليسين 4-20٪.
   9. الكتروفلورية لمدة 45 دقيقة أو حتى صبغ الجبهة هو في الجزء السفلي من هلام.
   10. وصمة عار هلام باستخدام مجموعة تلطيخ LPS بعد تعليمات الشركة المصنعة.

النتائج

توفر هذه التقنية وسيلة فعالة لعزل IMs و OMs للبكتيريا سالبة الجرام. ويوضح الخطوط العريضة للإجراء بأكمله(الشكل 1). بشكل عام، تطبيع الثقافات إلى OD₆₀₀ من 0.6-0.8 في 1 لتر من وسائل الإعلام، أو الحصاد بين 6.0 و 8.0 × 10¹¹ الخلايا البكتيرية سوف تضمن أن يتم جمع كمية مناسبة من المواد الغشاء لفصل لاحقة.

عند التبيلات وultracentrifuging lysate ، فإن الكريات الغشاء البني اللزج ة تكون مرئية في الجزء السفلي من أنبوب ultraالطرد المركزي. بعد كشط، dounce-الت...

المناقشة

هذه الطريقة سوف تستمر في مساعدة الباحثين في فهم دور مغلف الخلية في علم وظائف الأعضاء البكتيرية ومسببات الأمراض. بعد خطوات ultrarifugation متتابعة يمكن الحصول على مجموع منقى، الداخلية، وOM كسر. يمكن أن تكون هذه الأغشية في عزلة لاختبار الفرضيات المتعلقة بتوطين بروتين الأغشية ووظيفتها ، والنقل والاتجار عبر البريبلازم ، وتكوين الطبقات الثنائية الفردية في ظل ظروف بيئية مختلفة. ويمكن أيضا ً إجراء دراسات بيولوجية تستكشف مشاركة مكونات OM الفردية في الإمراض، مثل بروتينات لوس/LPS وOM، في نماذج الحيوانات والخلوية باستخدام كسور غشاء...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
زجاجات طرد مركزي سعة 1 لتر ، PC / PPCO ، سرعة فائقة ، مع غطاء مانع للتسرب ،	VWR	525-0466
1 لتر Pyrex مع غطاء درجة حرارة عالية	VWR	10416-312
2,000 مل قارورة Erlenmeyer ، فم ضيق	VWR	10545-844
4-20٪ جل بروتين صغير مسبقة الصب ، 12 جيدا	BIORAD	4561095
4x عينة Laemmli عازلة 10 مل	BIORAD	1610747
50 مل أنابيب طرد مركزي معقمة من مادة البولي بروبيلين	VWR	89049-174
7 مل مخالط الأنسجة مع اثنين من المدقة الزجاجية	VWR	71000-518
70 مل تجميع زجاجة البولي	كربونات بيكمان كولتر لعلوم	الحياة 355622
مسحوق أجار	VWR	A10752
B10P منضدة مقياس الأس الهيدروجيني مع مسبار الأس الهيدروجيني	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV / UF - TOC (إصدار مقاعد البدلاء)	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase Nuclease	MilliporeSigma	70746-3
EDTA ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم 99.0-101.0٪ ، بلورات ، كاشف حيوي فائق النقاء درجة البيولوجيا الجزيئية ، JT Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	شركة أفيستين
Fiberlite F13-14 × 50cy دوار بزاوية ثابتة	ThermoFisher Scientific	75006526
حمض الهيدروكلوريك 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker	Fischer Scientific	15-453-211
LB Broth Miller	VWR	214906
Lysozyme ، بياض البيض ،	VWR	VWRV0063
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	سيجما ألدريتش	M2670
NADH	سيجما ألدريتش	10107735001
أوبتيما XPN-80 - IVD	بيكمان كولتر لعلوم الحياة	A99839
منتجات فارمكو   كحول نقي 200 برهان GL 4 / CS & nbsp ؛	فيشر العلمي	NC1624582
الفينول ، متوازن مع 10 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملي EDTA ، الكاشف الحيوي ، للبيولوجيا الجزيئية	سيجما - ميليبور	P4557
بيرس كوماس بلس (برادفورد) طقم الفحص	Thermofisher	23238
Pro-Q الزمرد 300 طقم بقع جل عديد السكاريد الدهني	Thermofisher	P20495
Proteacease -50 ، خالي من EDTA	G Biosciences	786-334
Proteinase K ، علم الأحياء الجزيئي من الدرجة	نيو إنجلاند Biolabs	P8107S
هيدروكسيد الصوديوم & GE ؛ 99.99٪	VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus أجهزة الطرد المركزي	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
السكروز	MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti دوار دلو متأرجح	بيكمان كولتر علوم الحياة	331362
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (TRIS ، تروميتامول) > 99.9٪ (أساس مجفف) ، درجة البيولوجيا الجزيئية فائقة النقاء ، JT Baker	VWR	JT4109-6
Type 45 Ti دوار التيتانيوم ذو الزاوية	الثابتة بيكمان كولتر لعلوم	الحياة 339160
أنبوب فائق الوضوح ، 14 × 89 مم	بيكمان كولتر لعلوم الحياة	344059
Vortex-Genie 2	VWR	102091-234