مقالة منهجية

القياس الكمي لالتصاق خلايا الورم في أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية

DOI:

10.3791/60531

⸱

فبراير 9, 2020

 ,  ,  , 
1Molecular Oncology Center, Hospital Sírio-Libanês

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية (LN). يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN المنضمة عن طريق المجهر الخفيف وتأكيدها من خلال طريقة تعتمد على الفلورسينس ، مما يعطي مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلايا السرطانية الملزمة لLN parenchyma.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقد الليمفاوية التي تستنزف الورم ليست مجرد مرشحات للنفايات الناتجة عن الورم. وهي واحدة من المواقع الإقليمية الأكثر شيوعا من الإقامة المؤقتة من الخلايا السرطانية المنشورة في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من السرطان. الكشف عن هذه الخلايا السرطانية LN المقيمة هو علامة حيوية هامة المرتبطة سوء التكهن وقرارات العلاج المصاحب. وقد أشارت نماذج الماوس الأخيرة إلى أن الخلايا السرطانية المقيمة LN يمكن أن يكون مصدرا كبيرا للخلايا الخبيثة للانبثاث البعيد. القدرة على قياس مدى التهيفية للخلايا السرطانية إلى LN parenchyma هو مقياس حاسم في البحوث التجريبية التي تركز على تحديد الجينات أو مسارات الإشارات ذات الصلة للنشر اللمفاوي / النقيلي. لأن LNs هي هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة مع مجموعة متنوعة من المظاهر والتراكيب في أقسام الأنسجة اعتمادًا على مستوى القسم ، يصعب تكرار المصفوفات تجريبيًا في المختبر بطريقة يتم التحكم فيها بالكامل. هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد LN. باستخدام أقسام المسلسل من نفس LN، ونحن تكييف الطريقة الكلاسيكية التي وضعتها برودت لاستخدام التسميات غير المشعة والعد مباشرة عدد الخلايا السرطانية الملتزمة في منطقة سطح LN. يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN-المنضمة بواسطة المجهر الخفيف وأكد من خلال طريقة تستند إلى الفلورسينس، وإعطاء مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلية ملزمة لLN parenchyma، وهو دليل موحية من التعديلات الجزيئية في ربط تقارب integrins إلى ارتباطها LN-ligands.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانبثاث السرطاني هو السبب الرئيسي لفشل العلاج والجانب المهيمن الذي يهدد الحياة من السرطان. كما افترض قبل 130 عاما، والنتائج انتشار النقيلي عندما نخبة من الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs، "البذور") اكتساب قدرات بيولوجية محددة التي تسمح لهم للتهرب من المواقع الأولية وإقامة النمو الخبيث في مواقع بعيدة ("التربة")1. في الآونة الأخيرة ، ظهرت العديد من المفاهيم الجديدة المتعلقة بعلاقات "البذور والتربة" ، مثل تحريض المنافذ premetastatic (تصور بأنها "تربة خصبة" اللازمة لازدهار "البذور" ) ، والبذر الذاتي للأورام الأولية من قبل DTCs ، و "البذور" السكون في الأعضاء الثانوية ونموذج التقدم الموازي للانبثاث2.

بالنسبة لمعظم الأورام الخبيثة الصلبة ، يمكن أن تقيم DTCs ويتم اكتشافها في العديد من الأعضاء المتوسطة ، مثل نخاع العظام والغدد الليمفاوية (LNs) في المرضى الذين يعانون من أو بدون دليل على الانبثاث السريري. لأن LNs استنزاف الورم هي الموقع الأول للانتشار الإقليمي للDTCs، LN الوضع هو مؤشر التنبؤ ية الهامة وغالبا ما يرتبط مع قرارات العلاجالمصاحب3. بالنسبة لبعض أنواع الأورام ، فإن الارتباط بين حالة LN والنتائج الأسوأ قوي ، بما في ذلك الرأس والرقبة4،5، الثدي6، البروستاتا7، الرئة8، المعدة9، القولون والمستقيم10،11 وسرطان الغدة الدرقية12.

LNs هي أجهزة صغيرة في الجهاز اللمفاوي ، مغطاة بخلايا شبكية ومحاطة بالأوعية اللمفاوية. هذه الأجهزة ضرورية للغاية لعمل الجهاز المناعي13. تعمل LNs كمنصات جذب للخلايا المناعية المتداولة ، مما يجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا التي تقدم المستضدمع معًا14. ومع ذلك، تجذب LNs أيضًا الخلايا السرطانية المتداولة. على مدى عقود، تم تصوير LNs كطرق سلبية للنقل للخلايا السرطانية النقيلية. ومع ذلك ، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الخلايا السرطانية قد تسترشد أيضًا نحو LNs عن طريق التكتيك الكيميائي (chemokines) و / أو العظة (عناصر مصفوفة خارج الخلية) التي يفرزها البطانة اللمفاوية15. وكمثال على ذلك، فإن التعبير المفرط لمستقبلات CCR7 في الخلايا السرطانية يسهل توجيه خلايا الورم الميلانيني النقيلي نحو LNs التي تستنزف الورم16. بالإضافة إلى ذلك ، توفر بروتينات LN خارج الخلية سقالة لاصقة لتجنيد وبقاء الخلايا السرطانية المتداولة17. في الواقع ، توفر LNs التي تستنزف الأورام تربة خصبة لبذر DTCs ، والتي يمكن الحفاظ عليها في الدول التكاثرية أو الخاملة بواسطة إشارات بيئية صغيرة LN محددة18. والمصير النهائي لهذه البلدان النامية النامية المقيمة في الجيش الوطني مثير للجدل؛ تشير بعض الأعمال إلى أن هذه الخلايا هي مؤشرات سلبية للتقدم النقيلي19، في حين يقترح آخرون أنهم مؤسسي المقاومة على الأرجح (عن طريق المواقع الأولية ذاتية البذر) و / أو بمثابة خزانات خلوية للانبثاث (نشر "بذور" لنمو السرطان الثالث)20،21. في الآونة الأخيرة ، وذلك باستخدام نماذج ما قبل السريرية ، وقد ثبت أن جزءا صغيرا من هذه DTCs LN المقيمين غزت بنشاط الأوعية الدموية ، ودخلت في الدورة الدموية واستعمرت الرئتين21.

وبالنظر إلى أن وجود الخلايا السرطانية في LNs هو علامة لعدوانية السرطان والغازية ، في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين طريقة كلاسيكية طورها Brodt22 لقياس التصاق الخلايا السرطانية إلى LNs في المختبر. سمح لنا استخدام إجراء اختبار قائم على الفلورسينس بتطوير بروتوكول منخفض التكلفة وسريع وحساس وصديق للبيئة (غير مشع) للكشف عن التعديلات اللاصقة بين الخلايا السرطانية وأقسام التبريد LN. باستخدام خلايا سرطان الثدي MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من التعبير الجيني NDRG4 والمقاطع المجمدة جرذ LN لتجسيد الأسلوب، أظهرنا أن هذا البروتوكول سمح بارتباط جيد بين التصاق خلايا الورم إلى LNs في المختبر وLN الانبثاث لوحظ في مرضى سرطان الثدي24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استرداد LNs من جثث جديدة من الفئران Wistar البالغة الصحية التي ضحت بها خلع عنق الرحم. اتبعنا المبادئ التوجيهية للصحة الوطنية للألم والضيق في الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات والبحوث الحيوانية التابعة لمعهد البحث والتعليم في مستشفى سيريو ليبان (CEUA P 2016-04).

ملاحظة: تعتبر جميع الأنسجة المجمدة الطازجة خطرة بيولوجياً وينبغي التعامل معها باستخدام احتياطات السلامة البيولوجية المناسبة.

1. استئصال الغدد اللمفاوية والتبريد

  1. ضع جثث ًا طازجة لفئران Wistar البالغة (180-220 جم) ملقاة في الرُكَم الظهري على لوحة تشريح نظيفة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب جمع LNs حتى 30 دقيقة بعد القتل الرحيم.
  2. رش الذبيحة الفئران مع الكحول ايزوبروبيل 70٪ واستخدام الأدوات المعقمة لحصاد LN.
  3. ارفع جلد البطن بمساعدة ملاقط وافتح تجويفًا بشق ٍ سيّوي دون الإضرار بالأنسجة الأساسية ، مما يعرض لزوجة البطن. سحب الأمعاء وLNs الصدر والبطن تصبح مرئية(الشكل 1).
  4. استئصال بعناية LNs من كل الفئران مع استخدام مقص طرف حادة لتجنب إصابة الشريان الارسالية متفوقة الكذب وراء.
    ملاحظة: اعتمادًا على موقع العقدة الليمفاوية المنتزَسة، من الضروري تنظيف الأنسجة الأخرى التي تم الالتزام بها، مثل الأنسجة المسارية.
  5. حصاد LNs في 15 مل أنابيب مخروطية تحتوي على 5 مل من الفوسفات المعقم المالحة العازلة (PBS).
  6. تجاهل بشكل صحيح جثث الفئران.
  7. إزالة LNs الطازجة من برنامج تلفزيوني، لفة وتجفيف العقدة على ورقة تصفية الجافة. وضعه في طبق بيتري صغير وإضافة محلول تضمين لعينات الأنسجة المجمدة (O.C.T.) لمدة 2 دقيقة.
  8. نقل وتوجيه وجه LN إلى أسفل في موقف المطلوب في قاعدة cryomold، مع ما يكفي فقط O.C.T لتغطية ذلك. تجنب الفقاعات بالقرب من الأنسجة. سطح المقطع هو الجزء السفلي من cryomold.
  9. على الفور المفاجئة تجميد cryomold في برودة الستايروفوم مع الجليد الجاف. عندما لا يزال هناك جزء صغير من O.C.T. غير المجمدة (~ 20-35 ق)، ونقل العينة إلى رقائق الألومنيوم ووضعها في برودة مع الجليد الجاف مع الاستمرار في تجميد عينات أخرى. في النهاية، قم بتخزين جميع العينات عند -80 درجة مئوية حتى القسمة.
  10. قسم LN مع سمك قسم ضبط cryostat إلى 5-8 ميكرومتر نقل أقسام البكاء على الشرائح المجهر.
    ملاحظة: قبل المقطع، قم بإزالة العينات المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية والسماح لها بالتوازن إلى درجة الحرارة في غرفة الميكروتومي ة في cryostat عند -22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبًا. يمكن تخزين الشرائح المحتوية على LN عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

2. وضع العلامات الخلوية مع الأصباغ الفلورية

ملاحظة: تستخدم الأصباغ الفلورية على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا. نحن نفضل استخدام طويلة سلسلة dialkylcarbocyanines تسمية (DiI (C18)،الإثارة 549 نانومتر، الانبعاثات 565 نانومتر) لأنها مشرقة ومستقرة ويمكن إضافتها مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة، لا يؤثر على صلاحية الخلية أو خصائص لاصقة الخلية25،26.

  1. خلايا الإنفصال تنمو في ظل ظروف مثالية (أي في وسط كامل) وإعادة تعليق في وسط خالية من المصل بكثافة من 106 خلايا / مل.
  2. أضف 1 مل من تعليق الخلايا (106 خلايا) إلى أنبوب مخروطي a15 مل وملصق مع Dil (C18)(2 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد 5 دقيقة، قم بتحريك الأنابيب بلطف لتجنب ترسيب الخلايا وتلطيخ الخلايا الرسوبية. تتطلب الكثافات الأكبر أوقات حضانة أطول للتلطيخ الموحد. يختلف وقت الحضانة الأمثل لتلطيخ الخلايا باختلاف خط الخلية. ويمكن أن يكون أفضل كميا باستخدام FL2 تدفق التقليدية قناة الكشف عن القياس الخلوي(الشكل 2A).
  3. الطرد المركزي أنابيب التعليق المسمى في 300 × ز لمدة 4 دقيقة.
  4. إزالة supernatant وغسل مرتين في 10 مل من وسط خالية من المصل. استعادة الخلايا والكريات الحمراء. إعادة تعليق الخلايا في 106 خلايا / مل في وسط خال من المصل مع 0.1٪ الزلال مصل البقر (BSA).

3. أطباق Precoating مع حل بولي-L-ليسين أو BSA كتحكم البذر (اختياري)

ملاحظة: استخدمنا أطباق زراعة الخلايا المغلفة بـ PLL كأسطح إيجابية لمراقبة التحميل لضمان أن مجموعات تجريبية مختلفة من الخلايا السرطانية تم بذرها بنفس العدد ، وكذلك الأسطح المغلفة بـ BSA كعناصر تحكم سلبية.

  1. في ظل ظروف معقمة، لإعداد الآبار المغلفة PLL- أو BSA، إضافة 300 ميكرولتر من PLL (0.1٪ ث / v في H2O) أو BSA (مخففة في 2.5٪ ث / v في H2O) مباشرة إلى لوحة 24-well واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  2. إزالة الحل عن طريق الطموح، بلطف شطف السطح مع برنامج تلفزيوني معقم والهواء الجاف لوحة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة قبل البذر الخلية.
    ملاحظة: يجب تعديل المجلدات النهائية من PLL أو BSA وفقًا لمنطقة لوحات الآبار المختلفة.

4. البذر الفلورسنت المسمى الخلايا السرطانية على LN أقسام التبريد أو PLL / BSA المغلفة الآبار

ملاحظة: كعناصر تحكم تجريبية، استخدمنا (1) أطباق زراعة الخلايا المغلفة بـ PLL أو BSA و (2) أقسام متتالية لنفس LN لكل تجربة (انظر هذه التفاصيل في الشكل 2D)، حيث سيقلل هذا الأخير من الاختلافات الإقليمية في تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) لكل قسم LN ، والذي بدوره يمكن أن يملي معدل التصاق الخلية. لالتالي اختبار التصاق خلايا الورم, حدد جودة عالية وتسلسل LN أقسام التبريد.

  1. اغسل يُشَكُر ُ كَرْبْتَي ْرْهْ مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة ترطيب مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. منع التصاق غير محدد لأقسام التبريد مع 2.5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. استخدام المناعي هيستوكيمياء غسل الغرف ومهد الصفيحة لضمان أن كامل O.C.T تمت إزالتها أثناء غسل واحتضان.
  3. استنزاف BSA الزائدة على منشفة ورقية جافة، وتجفيف الخطوط العريضة للأقسام LN مع مسحة القطن وتطويق المقاطع باستخدام قلم PAP.
  4. لالخلايا الورم التصاق الالتصاق، إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (من الخطوة 2.4) إلى كل قسم LN مطوقة أو جيدا في لوحات 24-جيدا PLL المغلفة ووضعها في رف غرفة رطبة لمدة 1-2 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية التقليدية.
    ملاحظة: يجب تعديل الحجم النهائي لتعليق الخلية وفقًا لمنطقة LNs المحاطة المختلفة.
  5. غسل بلطف قبالة الخلايا غير الملتصقة أربع مرات مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا الفلورية المتبقية مع 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

5. القياس الكمي اليدوي للمؤشر اللاصق

ملاحظة: تم تحقيق مؤشر لاصق (أي الخلايا السرطانية /LN mm2)باستخدام هدف 10X وحساب عدد الخلايا السرطانية يدويًا ، الذي تم تحديده بسهولة عن طريق المجهر الضوئي وأكده المجهر الفلوري(الشكل 2D)، لكل مناطق العقدة الليمفاوية في العديد من الحقول المستقلة (تم الحصول عليها باستخدام برنامج ImageJ/ فيجي التابع للمعهد الوطني للصحة).

  1. استخدم مجهرًا فلوريًا بهدف 10x لالتقاط صور TIFF منفصلة في قناتين تقابلان الحقول الساطعة والفلورية الحمراء(الشكل 2D). قم بتسمية هذه الصور وحفظها بشكل منهجي.
  2. بدء ImageJ / فيجي، وفتح الصور وتعيين المقياس. من الضروري استخدام مقياس معايرة (على سبيل المثال، مسطرة ميكرومترية 1 مم)(الشكل 2C).
  3. افتح صورة المسطرة المترية (أو ميكرومتر المرحلة)، وحدد أداة الخط المستقيم وارسم خطًا مستقيمًا يحدد مسافة معروفة.
  4. في القائمة تحليل، حدد تعيين مقياس. سيتم ملء المسافة بالبكسل استنادًا إلى طول الخط المرسوم في الخطوة 5.3 (بالبكسل). سيتم ملء المسافة المعروفة بالمسافة الحقيقية (في هذه الحالة ، بالملليمترات) ووحدة الطول في وحدة حقل الطول (في هذه الحالة ، بالملليمترات).
  5. انقر على Global (تنطبق هذه المعايرة على جميع الصور المفتوحة في جلسة ImageJ/فيجي هذه) واضغط موافق.
  6. قياس كمية منطقة العقدة الليمفاوية: حدد أداة العصا وبالنقر المزدوج، افتح إعدادات أداة العصا. تعيين الوضع إلى 8-متصل. انقر في الصورة وتعيين التسامح حتى حدد جميع الغدد الليمفاوية في الصورة واضغط موافق. لقياس المنطقة، افتح التحليل | قياس (CTRL + M). يتم التعبير عن المنطقة في الوحدات التي تم تعيينها في وقت سابق.
  7. تحديد كمية خلايا الورم: فتح الصور المجهرية الخفيفة / الفلورية في برنامج فيجي. حدد الإضافات | تحليل | عداد الخلية | عداد الخلية. انقر على الصورة ليتم قياسها كميا واضغط على زر تهيئة في إطار عداد الخلية. حدد نوع العداد (1-8) وانقر على الخلايا في الصورة. لتهيئة الصورة التالية، اضغط على زر إعادة الضبط في نافذة عداد الخلية، وافتح الصورة الجديدة وكرر جميع الخطوات.
    ملاحظة: يتم التعبير عن مؤشر الالتصاق LN كعدد الخلايا السرطانية الملتصقة لكل منطقة مغطاة LN (الخلايا /مم2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نوضح الفحص من خلال تقييم إمكانات LN اللاصقة لخلايا سرطان الثدي الفلورية الحمراء MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من جين NDRG4 (يشار إليه باسم NDRG4-positive والخلايا السالبة NDRG4) ، وهو مغير سلبي من تجمع beta1-integrin على سطح الخلية24، من خلال فحص كسور خلايا الورم LN-المعتنقين للفئران. وترد أمثلة من الصور الخام لهذا البروتوكول في الشكل 2. كما لوحظ في الشكل 2B، يتم تقريب مورفولوجيا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب نشر الخلايا السرطانية في الجهاز اللمفاوي مجموعة متنوعة من الأحداث المعقدة التي تحركها الخلايا. أنها تبدأ مع انفصال الخلية من الورم الأولي وإعادة عرض مصفوفة خارج الخلية (ECM) العمارة، ويدعمها chemotaxis المستمر والهجرة النشطة من خلال اللمفاويات afferent في طريقها إلى LNs الحارس. إذا انضمت الخلايا السرطانية والبقاء على قيد الحياة في LNs، فإنها يمكن أن تنتشر بسهولة إلى الأجهزة الثانوية الأخرى. هنا نصف طريقة سهلة للتحليل الوظيفي السريع والمنخفض التكلفة للتفاعلات اللاصقة المحددة بين الخلايا السرطانية وLNs المجمدة.

<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر الدكتورة روزانا دي ليما باغانو وأنا كارولينا بينهيرو كامبوس على المساعدة التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال منح من: FAPESP - مؤسسة ساو باولو للأبحاث (2016/07463-4) ومعهد لودفيغ لأبحاث السرطان (LICR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنابيب مخروطيةكورنينج352096
2-بروبانولميرك109634
منضدة التدفق الصفحيEsco لثقافة
للقرصلايكا14020139126
ألبومين مصل الأبقارسيجما-ألدريتشA9647-100
قارورة ثقافة الخلية T-25 سم 2< / sup>Corning430372
CryostatLeicaCM1860 فرشاة التبريد بالأشعة فوق البنفسجية
مع المغناطيسLeica14018340426
DiIC18 Cell TrakerDye Dye Molecular EnginesV-22885
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Life Technologies12657-029
مجهر مضاننيكون اكليبس 80
فورما السلسلة الثانية CO2< / sub> حاضنةحراري علمي
فورمالديهايدسيجما ألدريتش252549
ماكينة حلاقة عالية المستوى يمكن التخلصمنها مكعبحضانة 14035838926
لايكا (IHC)مجهر KASVIK560030
مقلوبأوليمبوسCKX31
Isofluran 100 ملكريست á lia
السائل Bloquer Super Pap PenAbcam ، كواشف علوم الحياةab2601
درجة حرارة القطع المثلى "OCT" مركبSakura4583
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Life Technologies70011-044
Poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
RPMIGibco31800-022
الماصات المصلية 1 ملجيت بيوفيلGSP010001
الماصات المصلية 10 ملجيت بيوفيلGSP010010
الماصات المصلية 2 ملجيت بيوفيلGSP010002
الماصات المصلية 5 ملجيت بيوفيلGSP010005
الماصات المصلية 50 ملجيت بيوفيلGSP010050
ماصة مصلية Easypet 3Eppendorf
Tissue-Tek cryomoldSakura4557
Trypan Blue 0.4٪InvitrogenT10282
TrypsinInstituto Adolfo LutzATV
الخلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
  2. Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176(2017).
  3. Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
  4. Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
  5. Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
  6. McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
  7. Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
  8. Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
  9. Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
  10. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
  11. Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
  12. Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
  13. Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
  14. Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
  15. Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
  16. Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  17. Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703(2012).
  18. Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
  19. Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
  20. Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
  21. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  22. Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
  23. Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
  24. Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11(2019).
  25. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333(1989).
  26. Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
  27. Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
  28. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
  29. Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42(2010).
  30. Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DiI Cryostat PBS

مقالات ذات صلة