المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية
Summary
نحن وصف منصة التي تستخدم مكتبه من المضادات الحيوية القولونية المقاومة للمضادات الحيوية للحصول علي dereplication من المضادات. يمكن استنتاج هويه المضادات الحيوية التي تنتجها البكتيريا أو الفطريات من خلال نمو e. كولاي التي تعبر عن جين المقاومة الخاصة بها. وهذه المنصة فعاله اقتصاديا وذات كفاءه زمنيه.
Abstract
واحده من التحديات الرئيسية في البحث عن المضادات الحيوية الجديدة من مقتطفات المنتجات الطبيعية هو أعاده اكتشاف المركبات المشتركة. للتصدي لهذا التحدي ، يتم تنفيذ dereplication ، وهي عمليه تحديد المركبات المعروفة ، علي عينات من الفائدة. وأساليب الفصل بين الطرق ، مثل الانفصال التحليلي الذي يعقبه قياس الطيف الكتلي ، تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الموارد بكثافة. لتحسين عمليه dereplication ، قمنا بتطوير منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP). و ARP هي مكتبه من حوالي 100 الجينات مقاومه المضادات الحيوية التي تم استنساخها بشكل فردي في القولونية. هذه المجموعة سلاله لديها العديد من التطبيقات ، بما في ذلك وسيله فعاله من حيث التكلفة وطريقه سهل لdereplication المضادات الحيوية. وتنطوي هذه العملية علي تخمير الميكروبات المنتجة للمضادات الحيوية علي سطح اطباق بتري المستطيلة التي تحتوي علي وسط صلب ، مما يسمح بإفراز ونشر نواتج الأيض الثانوية من خلال الوسط. بعد فتره التخمير 6 أيام, يتم أزاله الكتلة الحيوية الميكروبية, ويضاف أجار رقيقه تراكب إلى طبق بيتري لخلق سطح أملس وتمكين نمو سلالات المؤشر e. كولاي . ثم يتم تثبيت مجموعتنا من سلالات ARP علي سطح طبق بيتري الذي يحتوي علي المضادات الحيوية. يتم احتضان اللوحة التالية بين عشيه وضحيها للسماح للنمو e. كولاي علي سطح التراكب. فقط السلالات التي تحتوي علي مقاومه للمضادات حيوية معينه (أو فئة) تنمو علي هذا السطح مما يتيح التعرف السريع علي المجمع المنتج. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح للتعرف علي منتجي المضادات الحيوية المعروفة وكوسيلة للتعرف علي تلك التي تنتج المركبات الجديدة.
Introduction
منذ اكتشاف البنسلين في 1928 ، أثبتت المنتجات الطبيعية المستمدة من الكائنات المجهرية البيئية انها مصدر غني للمركبات المضادة للميكروبات1. وتستمد حوالي 80 ٪ من المضادات الحيوية المنتجات الطبيعية من البكتيريا من جنس العقديات وغيرها من الاكاكتيميتيز ، في حين يتم إنتاج 20 ٪ المتبقية من الأنواع الفطرية1. بعض السقالات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا المستخدمة في العيادة مثل β-اكتام, التتراسيكلين, rifamycins, و الامينوغليكوسيدس, كانت في الأصل معزولة عن الميكروبات2. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع البكتيريا المقاومة للادويه المتعددة ، أصبحت اللوحة الحالية من المضادات الحيوية اقل فعاليه في العلاج3،4. وتشمل هذه العوامل المسببة للامراض “ESKAPE” (اي ، فانكوميسين مقاومه المكورات المعوية والمكورات العنقوديةالذهبية المقاومة للاكتام ، klebsiella الرئوية، الزائفة الزنجاريه، والانتيفه باومانيي، و المعوية sp.) ، وهي مجموعه فرعيه من البكتيريا التي تعتبر مرتبطة باعلي المخاطر من قبل عدد من السلطات الصحية العامة الرئيسية مثل منظمه الصحة العالمية3،4،5. ظهور وانتشار العالمي لهذه الممرضات المدرة للادويه يؤدي إلى حاجه مستمرة للمضادات الحيوية رواية3,4,5. ومما يؤسف له ان العقدين الماضيين اثبتا ان اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة من المصادر الميكروبية يزداد صعوبة6. وتشمل النهج الحالية لاكتشاف المخدرات الفحص عاليه الانتاجيه للمركبات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المنتجات الطبيعية المكتبات استخراج ، مما يسمح للاف من مقتطفات ليتم اختبارها في وقت معين2. ومع ذلك ، وبمجرد الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات ، فان الخطوة التالية هي تحليل محتويات مستخرج الخام لتحديد المكون النشط والقضاء علي تلك التي تحتوي علي مركبات معروفه أو زائده عن الحاجة7،8. هذه العملية ، التي يشار اليها باسم dereplication ، أمر حيوي لمنع و/أو خفض كبير في الوقت المستغرق في أعاده اكتشاف المضادات الحيوية المعروفة7،9. علي الرغم من ان خطوه ضرورية في اكتشاف المخدرات المنتج الطبيعي ، dereplication المعروف شاقه وكثيفه الموارد10.
من اي وقت مضي منذ beutler et al. أولا صاغ مصطلح “dereplication” ، بذلت جهود واسعه لوضع استراتيجيات مبتكره للتعرف السريع علي المضادات الحيوية المعروفة11،12. اليوم الاداات الأكثر شيوعا المستخدمة في dereplication تشمل النظم التحليلية الكروماتوغرافي مثل اللوني السائل عاليه الأداء ، والطيف الكتلي ، والنووية الرنين المغناطيسي القائم علي طرق الكشف11،13. ومن المؤسف ان كلا من هذه الأساليب يتطلب استخدام معدات تحليليه باهظه التكاليف وتفسيرات متطورة للبيانات.
في محاولة لتطوير طريقه dereplication التي يمكن تنفيذها بسرعة دون المعدات المتخصصة ، انشانا منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP)10. يمكن استخدام ARP لاكتشاف المواد المضادة للمضادات الحيوية ، وتنميط مركبات المضادات الحيوية الجديدة ضد أليات المقاومة المعروفة ، و dereplication من المضادات الحيوية المعروفة في مقتطفات مشتقه من البكتيريا المخاطية والميكروبات الأخرى. هنا ، ونحن نركز علي تطبيقه في dereplication المضادات الحيوية. يستخدم ARP مكتبه من سلالات القولونية ايزوسيكيا التي تعبر عن جينات المقاومة الفردية التي تكون فعاله ضد المضادات الحيوية الأكثر شيوعا أعاده اكتشاف14,15. عندما تزرع مكتبه e. القولونية في وجود كائن ثانوي المنتجة المستقلب, يمكن استنتاج هويه المجمع عن طريق نمو السلالات e. القولونية التي تعبر عن الجينات المقاومة المرتبطة بها10. عندما تم الإبلاغ عن ARP لأول مره ، كانت المكتبة تتكون من > 40 جينات تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 16. تم تصميم قالب dereplication الأصلي لتشمل مجموعه فرعيه من جينات المقاومة لكل فئة المضادات الحيوية لتوفير المعلومات المتعلقة بالمضادات الحيوية فئة فرعيه خلال عمليه dereplication. اليوم ، يتكون ARP من > 90 الجينات التي تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 18. باستخدام لدينا مجموعه واسعه من الجينات المقاومة ، وقد تم تطوير قالب dereplication الثانوية ويعرف باسم منصة مقاومه المضادات الحيوية الحد الأدنى (MARP). تم إنشاء هذا القالب للقضاء علي التكرار الجيني وببساطه توفير المعلومات المتعلقة بفئة المضادات الحيوية العامة التي ترتبط المستقلب dereplicated. بالاضافه إلى ذلك ، فان قالب MARP تمتلك كل من النوع البري وسلاله القصور الفائقة/efflux من e. كولاي BW25113 (e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc)، مقارنه بالتجسيد الأصلي لل ARP ، والتي فقط يستخدم سلاله فرط نفاذيه. هذا الجانب فريدة من نوعها يخلق الأنماط الظاهرية اضافيه اثناء dereplication ، مما يدل علي قدره المركبات لعبور الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبيه الجرام. هنا ، ونحن وصف بروتوكول قويه ليتم اتباعها عند المراوغة مع اما ARP و/أو MARP ، تسليط الضوء علي الخطوات الأكثر اهميه لاتباعها ، ومناقشه مختلف النتائج الممكنة.
Protocol
1. اعداد المكتبة القولونية الأسهم الجلسرين (من أجار slants)
- خط السلالات ARP/MARP e. القولونية من مرق lysogeny (LB) أجار التعرجات علي اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة (الجدول 1).
- اعداد الثقافات لكل من سلالات e. القولونية عن طريق تطعيم 3 مل من LB تحتوي علي علامة اختيار المناسبة مع مستعمره واحده. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة).
- الجمع بين 800 μL من الثقافة و 200 μL من الجلسرين 80 ٪ معقمه في كريوفيال 1.8 mL. مزيج من خلال عكس الأنابيب 3 − 4 مرات ، وتخزين في-80 درجه مئوية.
2. ARP/MARP المجمدة اعداد لوحه مكتبه الأوراق المالية
- خط السلالات ARP/MARP من الأسهم الجلسرين التي أعدت في القسم 1 علي مجموعه جديده من اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة. تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- باستخدام تقنيه العقيم ، ماصه 500 μL من الموجبة المعدلة مرق مولر هينتون (MHB) من خزان معقم في كل بئر من العقيمة 96 صفيحه بئر عميقة.
- مع لوحات أعدت في الخطوة 2.1 ، استخدم عصا قضيب لتطعيم صفيحه البئر العميقة 96 وفقا لخريطة ARP/MARP (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2). تاكد من أضافه علامة اختيار المناسبة لكل بئر. وضع غشاء الختم تنفس علي سطح لوحه البئر العميقة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية (250 دوره في الدقيقة).
- تاكد من عدم وجود ابار ملوثه بالاشاره إلى خريطة ARP/MARP. كرر إذا كانت ملوثه. باستخدام pipettor متعدد القناات ، نقل 100 μL من كل بئر من لوحه البئر العميق إلى لوحه القاع العقيمة 96-بئر الجولة. كرر هذه الخطوة لإنشاء العديد من لوحات مكتبه الأسهم المجمدة.
ملاحظه: فمن الأفضل لاعداد ما لا يقل عن 5 لوحات مكتبه في وقت للحفاظ علي من تكرار الخطوات 2.1 − 2.4 في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة. - الانتهاء من جعل ARP/MARP المجمدة لوحات مكتبه الأوراق المالية عن طريق التنضيد 100 μL من معقمه 50 ٪ الجلسرين في كل بئر ومزيج من الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
- تغطيه لوحات مع الأختام ألومنيوم المعقمة وضمان ان كل بئر مختومه بشكل فردي.
- عدد لوحات وتكريس واحد فقط المجمدة لوحه مكتبه الأوراق المالية لتطعيم قوالب جديده في وقت معين. الحفاظ علي الباقي كما النسخ الاحتياطي في حاله التلوث لوحه مكتبه الأوراق المالية المجمدة.
- وضع غطاء لوحه علي راس ختم ألومنيوم وتخزين في-80 درجه مئوية.
3. البذور الثقافة واعداد لوحه Dereplication
- باستخدام عصا قضيب ، تطعيم 3 مل من العقديات المضادات الحيوية المتوسطة (SAM) (أو المتوسطة المناسبة الأخرى للكائن الذي يجري اختباره) في أنبوب اختبار يحتوي علي حبه زجاجيه معقمه واحده (لتفتيت mycelium) مع سلاله المنتجة التي هي ان تكون [دربلاتيد]. بالنسبة للعقديات ، كشط الجراثيم برفق من سطح المستعمرة.
- باستخدام نفس عصا القضيب الخشبية ، والسيطرة علي العقم علي طبق بيتري التي تحتوي علي أجار بينيت.
- احتضان ثقافة البذور في 30 درجه مئوية مع التهوية لمده 6 أيام (250 دوره في الدقيقة) واحتضان لوحه التحكم في العقم في 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.
ملاحظه: يرجى الرجوع إلى الجدول 2 للحصول علي وصفات إعلاميه ل SAM و بينيت. التعليمات المذكورة أعلاه هي مناسبه لمعظم الاكاكتيميتيز. تغيير وسائل الاعلام النمو حسب الضرورة لغيرها من البكتيريا والفطريات. - اعداد لوحات dereplication عن طريق شفط 23 مل من أجار بينيت الدافئة في ماصه المصلية والاستغناء 20 مل بالتساوي عبر سطح طبق بيتري مستطيله (جدول المواد) ، تاركا ما تبقي من المتوسطة في الماصة لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
ملاحظه: تاكد من ان السطح المستخدمة لصب لوحات هو مستوي وتنفيذ هذه الخطوة قبل أجار قد يبرد كثيرا; سطح مستو أمر حتمي لتثبيت المكتبة في المراحل التالية. - قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع مناطق الصفيحة ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما.
- اعداد صفائح غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) باستخدام غطاء طبق بيتري مستطيل كقالب تتبع بحيث تناسب الأوراق سطح لوحه dereplication. قطع الأوراق والاوتوكلاف لهم في الحقيبة المعقمة.
ملاحظه: يسمح هذا الغشاء للكائنات الحية للرياضية علي سطحه ، في حين قد تفرز نواتج الأيض الثانوية في الوسط أدناه. مره واحده نمت ، يتم أزاله الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication. الأكثر ملاءمة ان ورقه غشاء لديه علي سطح أجار بينيت ، والأنظف نتيجة dereplication. - تحقق من لوحه التحكم في العقم للتاكد من عدم وجود ملوثات بعد 6 أيام من الحضانة. إذا كانت خاليه من التلوث ، وأزاله غطاء طبق بيتري مستطيله وماصه 200 μL من ثقافة البذور علي سطح أجار بينيت.
- نشر الثقافة بالتساوي عبر سطح اللوحة بأكملها باستخدام مسحه قطنية معقمه.
- وضع غشاء النيتروسليلوز أعدت في الخطوة 3.6 علي قمة الثقافة علي سطح طبق بيتري. تبدا من خلال محاذاة الحافة السفلية من الغشاء إلى الحافة السفلية من طبق بيتري ، وتطبيق ببطء الغشاء من الحافة السفلية إلى الحافة العليا من لوحه.
- استخدام مسحه قطنية معقمه لتخفيف اي فقاعات الهواء التي قد تكون شكلت بين واجهه أجار الغشاء ، وضمان ان الغشاء هو تدفق إلى أجار.
- وضع الغطاء مره أخرى علي صحن بيتري مستطيله ووضعه راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه. احتضان عند 30 درجه مئوية لمده 6 أيام.
4. dereplication لوحه MHB تراكب و ARP/MARP مكتبه اعداد اللوحة
- بعد 6 أيام ، وأزاله لوحه dereplication من الحاضنة 30 درجه مئوية. باستخدام ملاقط معقمه (الاوتوكلاف أو رش جيدا مع 70 ٪ الايثانول) ، وأزاله بعناية غشاء النيتروسليلوز من سطح أجار بينيت.
ملاحظه: هذه الخطوة سوف أزاله الجراثيم مسعور ونميت ميسليا علي سطح الغشاء لتوفير سطح نظيف لdereplication ، وتسهيل الخطوة 4.2. - كما هو موضح للخطوة 3.4 ، وضمان سطح العمل هو مستوي واستخدام ماصه المصلية ليستنشق 23 مل من الموجبة الدافئة أجار MHB المعدلة. إنشاء تراكب عن طريق الاستغناء عن 20 مل بالتساوي عبر سطح لوحه dereplication ، وترك ما تبقي من المتوسطة في ماصه لمنع تشكيل فقاعه الهواء.
- قم بتدوير الصفيحة برفق حتى تغطي الوسط جميع المناطق ولا تزعجها حتى يتم ضبط أجارها تماما. مره واحده تبريدها وعززت ، والعودة لوحه dereplication إلى كيس من البلاستيك مختومه وتخزينها علي الراس في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: تسمح هذه الخطوة لنشر نواتج الأيض الثانوية من المتوسطة بينيت المخمرة في تراكب أجار MHB. إذا لم يتم اعداد غشاء النيتروسليلوز بشكل صحيح سيكون هناك نمو بوغ حول حواف لوحه ، والتي لديها خصائص مسعور ان صد أجار mhb. لا تصب التراكب فوق هذه الجراثيم لأنه يمكن ان يؤدي إلى تلوث التراكب. - في نفس اليوم الذي يتم سكب التراكب ، تطعيم قالب ARP/MARP الطازجة عن طريق التنضيد 100 μL من الموجبة المعدلة MHB في كل بئر من لوحه 96-حسنا.
ملاحظه: للحد من فرصه لنشر التلوث اثناء dereplication ، واستخدام واحده ARP/MARP لوحه مكتبه فقط لdereplication 2 − 3 لوحات الدراويش. ولذلك ، تطعيم ما يكفي من 96-بئر ARP/MARP لوحات استنادا إلى عدد من السلالات التي سيتم dereplicated. - تاخذ الأسهم المجمدة ARP/MARP لوحه مكتبه من 80 درجه مئوية الفريزر. أزاله ختم ألومنيوم قبل ان يبدا التكثيف لتشكيل علي السفلي ، التالي تقليل فرصه لتلويث الآبار المجاورة في لوحه المكتبة.
- باستخدام معقمه 96 أدوات تثبيت جيدا (أو اشكال أخرى من معدات التلقيح) ، دبوس بعناية من المجمدة الأسهم ARP/MARP لوحه المكتبة وتطعيم الطازجة MHB التي تحتوي علي لوحات 96-حسنا. للحد من التلوث اثناء dereplication ، واعداد العديد من لوحات المكتبة ARP أو MARP اللازمة لفقط dereplication 2 − 3 لوحات الدراويش لكل لوحه مكتبه. تعقيم أدوات تثبيت بين تطعيم كل لوحه.
- وضع ختم ألومنيوم معقمه جديده علي قالب المجمدة مره واحده كامله والعودة إلى-80 درجه مئوية الفريزر. ضع التطعيمات ال96ه بشكل جيد داخل كيس من البلاستيك المختوم وحضن في 37 درجه مئوية مع التهوية (250 دوره في الدقيقة) لمده 18 ساعة.
ملاحظه: يمكن اعداد لوحات مكتبه الأوراق المالية المجمدة الجديدة من هذه الخطوة بعد ضمان عدم وجود تلوث. أضافه الجلسرين إلى لوحه قبل تخزين في-80 درجه مئوية كما هو موضح في الخطوة 2.5.
5. الدراويش باستخدام ARP/MARP
- قم بازاله القالب ARP/MARP من الحاضنة وتاكد من عدم وجود ملوثات. دائما الدراويش باستخدام قالب التي يتم اعدادها طازجه وليس مباشره من المخزون المجمدة.
- أزاله لوحات dereplication من 4 درجه مئوية والسماح لتتوازن إلى درجه حرارة الغرفة. إذا كان هناك التكثيف ، وفتح الاغطيه والسماح لتجف في بيئة معقمه.
- باستخدام أدوات تثبيت معقمه (أو غيرها من معدات التلقيح) ، دبوس من لوحه مكتبه ARP/MARP علي سطح تراكب أجار MHB من لوحات dereplication. يجب الحرص علي عدم اختراق أجار. تعقيم أدوات التثبيت في ما بين تطعيم كل لوحه dereplication.
- بعد تثبيت القالب علي سطح لوحات dereplication ، والسماح للقالب القالب لتجف لمده 3 − 5 دقيقه. ضع لوحات التطعيم الملقحة راسا علي عقب في كيس من البلاستيك مختومه واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- تحليل نتائج dereplication في اليوم التالي عن طريق مقارنه النمو علي لوحه dereplication إلى الآبار التي تتوافق مع ARP/MARP الخريطة (الجدول 3 والجدول 4).
Representative Results
Discussion
يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه علي كل من اكتشاف المركبات المضادة للميكروبات الجديدة والمواد المضادة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. منصة يستفيد من خصوصية عاليه الركيزة من أليات المقاومة والمضادات الحيوية الخاصة بهم ، إلى مركبات التخلص من النفط داخل مقتطفات المنتجات الطبيعية الخام. علي الرغم من ان الوقت اللازم للوحات dereplication ان تكون جاهزه طويلة (~ 2 أسابيع) ، عمليه dereplication نفسها كامله بعد فتره حضانة واحده بين عشيه وضحيها ، والتي هي سريعة بالمقارنة مع الوقت الذي يمكن ان يستغرقه لعزل وتميز مركب من مقتطفات الخام. بالاضافه إلى ذلك ، لا حاجه إلى معدات باهظه الثمن أو عاليه التخصص ، مما يجعل هذه المنصة متاحه وفعاله من حيث التكلفة.
ومن الفوائد الرئيسية الأخرى لهذه المنصة مرونتها. يمكن توسيع ARP لاحتواء جينات المقاومة التي تشمل المزيد من فئات المضادات الحيوية. ويتحقق ذلك من خلال رصد الأدبيات لظهور انزيمات المقاومة الجديدة واستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي الاساسيه لأضافه الجينات إلى مكتبه e. كولاي . وعلاوة علي ذلك ، فان قالب dereplication هو قابل للتخصيص علي أساس المستوي المطلوب من واسعه أو ضيقه نطاق الركيزة الخصوصية التي يريد الفرد لاستخدامها عند dereplication. اي مزيج من الجينات في مكتبه e. كولاي يمكن استخدامها لجعل لوحات مكتبه جديده مع القدرة علي الكشف عن المركبات مع لمحات مختلفه. علي سبيل المثال ، يمكن تطوير β-lactamase التعبير عن قالب القولونية للسماح لل dereplication محدده للغاية من β-اكتام والطبقات الفرعية المختلفة الخاصة بهم.
في حين تم تصميم هذه المنصة في البداية لبناء المركبات علي وسائل الاعلام الصلبة, كما كان يعمل في وسائل الاعلام السائلة. وهذا مفيد عند العمل مع المركبات التي تم تنقيتها بالفعل حيث يتوفر فقط كميه محدوده للاختبار ، أو عند العمل مع المركبات التي لا تنتشر بسهوله أو باستمرار في وسائل الاعلام الصلبة. وأخيرا ، في حين تم وصف هذا البروتوكول باستخدام البكتيريا القولونية BW25113 و BW25113 ΔBambΔtolc ، يمكن استخدام المنصة مع مكتبه الجينات المقاومة المعرب عنها في سلالات مختلفه من e. كولاي (dereplication قد تختلف الأنماط الظاهرية). في نهاية المطاف ، ومنصة المقاومة للمضادات الحيوية مرنه ، لديها العديد من التطبيقات ، ومفيد علي طرق dereplication الأخرى.
ولضمان الحصول علي نتائج قابله للتكرار وغير ملوثه ، من الاهميه بمكان اتباع تقنيات التعقيم والعقيم المناسبة. الفشل في القيام بذلك سوف يؤدي إلى تلوث أدوات التثبيت ، لوحه المكتبة ، أو لوحه dereplication نفسها. في حين توجد علامات للاختيار في المكتبة e. كولاي ، والتي يمكن ان تساعد علي منع التلوث الناجم عن البكتيريا في عداد المفقودين علامة ، فانه لا يمنع التلوث عبر من سلالات باستخدام نفس العلامة. للحد من خطر حدوث هذا من الضروري تعقيم أدوات تثبيت البكتيريا بعناية قبل تثبيتها من لوحه المكتبة. يجب ان يتم تثبيت كل لوحه مكتبه فقط من 3 − 4 مرات كحد اقصي قبل التخلص من القالب الجديد. وهذا يمنع انتشار التلوث عبر جميع لوحات dereplication إذا أصبحت لوحه مكتبه ملوثه اثناء عمليه التثبيت. بالاضافه إلى ذلك ، لا يتم استخدام المضادات الحيوية عند تطعيم لوحه dereplication التالي يجب توخي الحذر الشديد لمنع التلوث قبل ان يترك لتخمر لمده سته أيام. مصدر محتمل آخر للتلوث هو في تراكب أجار MHB من لوحه dereplication. إذا كانت الوسائط المتراكبه ملوثه ، فلن يظهر النمو الا بعد الاحتضان الليلي عند 37 درجه مئوية بعد التثبيت. التلوث تراكب يمكن ان تجعل من الصعب للغاية لتحليل نمو المكتبة e. القولونية علي سطح تراكب. للحد من فرص التلوث تراكب ، واعداد أجار MHB الطازجة قبل صب التراكب. فمن المستحسن انه حتى الفرد هو مريح مع هذه الطريقة ، وينبغي دائما لوحات dereplication تكون مستعدة في تكرار أو ثلاث نسخ من هذا القبيل في حاله تلوث لوحه واحده ، لا يزال يمكن استخراج البيانات من نامل لوحات غير ملوثه.
وأخيرا ، من المهم ان نلاحظ ان ARP/MARP لديه قيود. هذا البروتوكول ليست مناسبه لأزاله النسخ المتماثل من السلالات المنتجة التي تنتج أكثر من مجمع واحد النشطة بيولوجيا. وقد تم تصميم كل سلاله في المكتبة e. كولاي للتعبير عن جين المقاومة واحد. إذا كان يتم إنتاج اثنين من المضادات الحيوية من قبل الكائن الحي ، لن المقاومة الجينات تمنح مقاومه للمضادات الحيوية الثانية ، مما يؤدي إلى وفاه الخلية من كلا السلالتين. التالي ، يجب ان تؤخذ هذه الامكانيه في الاعتبار عند نتائج dereplication تشير إلى وجود مضاد حيوي رواية لأنه لا يمكن الكشف عن إنتاج المضادات الحيوية المتعددة بواسطة الحالية واحده بناء المكتبة القولونية . واحد النهج التي يمكن اتخاذها لمكافحه التحدي من سلالات التخليص التي تنتج أكثر من مضاد حيوي واحد ينطوي علي استخدام الاجراء أجار المكونات الموصوفة في ورقه ARP الاصليه من قبل كوكس وآخرون10. في هذه الطريقة ، يتم أزاله جزء من وسط الصلبة المخمرة من المنتجات المضادة للمضادات الحيوية التي تحتوي علي لوحه ووضعها علي حديقة من سلاله المؤشر ARP. يمكن ان يكون ضغط المؤشر اي من سلالات e. كولاي المقاومة في مكتبه ARP. وتستخدم بعد ذلك مناطق تثبيط للمقارنة بين النشاط الحيوي لسلاله المنتجة ضد سلالات ARP وسلاله من نوع البرية. سلالات ARP التي تشكل منطقه المثبطة من حجم انخفاض مقارنه مع سلاله البرية من نوع يمكن ان تقاوم المجمع الذي يتم إنتاجه. وقد أثبتت هذه الطريقة ان تكون فعاله في تحديد سلالات قادره علي إنتاج المضادات الحيوية متعددة10.
وباختصار ، للحصول علي أفضل النتائج عند العبث مع ARP/MARP فمن المستحسن ان يتم اعداد لوحات dereplicating في تكرار أو ثلاث نسخ. وتشمل الخطوات الهامه الأخرى في البروتوكول تعلق من لوحه مكتبه جديده (أبدا المجمدة) وأزاله أكبر قدر ممكن من الكتلة الحيوية من السلالة المنتجة خلال مرحله أزاله الغشاء. وإذا اتبعت جميع الخطوات اللازمة ، ينبغي ان يكون للمرء نتائج ناجحه لإنتاج سلاله من الاهتمام في غضون أسبوعين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
