هنا، نقدم ثلاث طرق لتقييم الهجرة العدلات والتسلل في كل من الجسم الحي وفي المختبر. ويمكن استخدام هذه الأساليب لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن الهجرة وتسلل العدلات في الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العدلات هي عضو رئيسي في الجهاز المناعي الفطري وتلعب أدوارًا محورية في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض وردود الفعل الالتهابية المرضية. يمكن تجنيد العدلات في مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines. يمكن أن يؤدي التسلل الساحق من العدلات إلى تلف الأنسجة العشوائية، كما هو الحال في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA). العدلات المعزولة من exudate الباسيتي تستجيب لchemoattractant محددة، N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)، في المختبر في ترانسويل أو زغموند غرفة المقالات. يمكن استخدام تجربة الحقيبة الهوائية لتقييم الضريبة الكيميائية للالعدلات نحو البوليس الدهني (LPS) في الجسم الحي. وكثيرا ما يستخدم نموذج الماوس التهاب المفاصل الناجم عن الساعد (AA) في البحوث RA، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية للأقسام المشتركة مع مكافحة النقوي (MPO) أو اللاستاز المضادة للالعدلات (NE) هو وسيلة راسخة لقياس قياس تسلل العدلات. يمكن استخدام هذه الطرق لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.
المقدمة
العدلات هي خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتمثل 50-70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء في البشر1. العدلات هي واحدة من المستجيبين الأولية خلال الالتهاب الحاد. يمكن تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines الصادرة عن الخلايا المقيمة في الأنسجة2،3،4، والتي تتوسطها التفاعلات بين جزيئات التصاق الخلية على سطح العدلات وخلايا بطانة الرحم الوعائية5. العدلات أساسية لاستضافة الدفاع وتلعب دورا في ردود الفعل الالتهابية المرضية بسبب قدرتها القوية على تلف الأنسجة عن طريق إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) وغيرها من ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد استعرضت جامعة بكين جميع الإجراءات التجريبية ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها بالطب الصيني.
ملاحظة: تم استخدام الفئران C57BL/6 (7-8 أسابيع من العمر).
1- عزل العدلات
- اقتناء الخلايا الطاردة للبُرُقُيّة البُرُيّة
- إعداد الطازجة 10٪ محلول البروتيوس بيبتوني في ddH2O. حساب الحجم اللازم وفقا لعدد الفئران.
ملاحظة: تعيين عدد الفئران كما N، (2N+1) مل من الحل يجب أن تذوب وتصفيتها مقدما. - رش مساحة العمل مع الإيثانول 70٪. استخدام حاقن الأنسولين لرسم 1 مل من محلول بيبتوني وفقاعات التفريغ.
- إجراء الحقن ة داخل البطن الأولى من 1 مل من محلول بيبتون لكل فأر.
- ....
- إعداد الطازجة 10٪ محلول البروتيوس بيبتوني في ddH2O. حساب الحجم اللازم وفقا لعدد الفئران.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم جمع الخلايا الطاردة البريتونية من سائل اللاعف من الفئران. أعيد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة، الطبقات على خطوتين (54.8٪/70.2٪) من تدرج الكثافة المتقطع(الشكل 1A)،والطرد المركزي عند 1500 × ز لمدة 30 دقيقة. تم استرداد العدلات (≥95٪، ~ 1 × 107 العدلات / الماوس) من الواجهة السفلية(الشكل 1B).
وأجريت تج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكولات مفصلة من العدلات عالية النقاء من الدم المحيطي7، نخاع العظام والأنسجة18 كانت متاحة لفترة طويلة. هنا نعتمد طريقة لعزل العدلات من السائل البتوني19 التي العدلات ناضجة لا تزال معطلة لمزيد من الدراسات المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة.
استخدمنا تجربة الحقيبة الهوائية لاستكشاف تسلل العدلات الناجم عن LPS في الجسم الحي. وقد تم اقتراح هذه الطريقة كطريقة محتملة لقياس تسرب الخلايا مباشرة في البيئة الالتهابية العامة في الج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 81430099 و 31500704) ، ومشاريع التعاون والتبادل الدولي (رقم المنحة 2014DFA32950) ، وبرنامج البحوث من جامعة بكين للطب الصيني ( أرقام المنح BUCM-2019-JCRC006 و 2019-JYB-TD013).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.1٪ محلول أخضر سريع | Solarbio | 8348b | انقل 20 مجم من FCF سريع في قارورة واحدة إلى دورق آخر سعة 100 مل. أضف 20 مل من H2< / sub>O في الدورق وقم بإذابة البقعة عن طريق التقليب لعمل محلول أخضر سريع بنسبة 0.1٪ ، وقم بتصفيته باستخدام فلتر Nalgene PES 75mm |
| 0.1٪ Safranin O Staining | Solution Solarbio | 8348a | انقل 20 مجم من صبغة السافرانين O في قارورة واحدة إلى دورق سعة 100 مل. أضف 20 مل من H2< / sub>O إلى الدورق وقم بإذابة البقعة عن طريق التقليب لعمل محلول تلطيخ سافرانين O بنسبة 0.1٪ ، وقم بتصفيته باستخدام مرشح Nalgene PES 75mm |
| 0.5 M محلول حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، درجة الحموضة 8.0 | سيجما | 324506 | معقمة |
| 100٪ إيثانول | بكين للأشغال | ||
| 100٪ ميثانول | بكين للأعمال | ||
| الكيميائية15 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي من مادة البولي بروبيلين | فالكون | 14-959-53 أمبير | |
| 23 جم × 1 1/4 بوصة إبرة | BD | 305120 | |
| 26 جم × 3/8 بوصة إبرة | BD | 305110 | |
| 3٪ ألبومين مصل بقري (BSA) | قم بإذابة 0.3 جم BSA في 10 مل PBS | ||
| 3٪ H2< / sub>O2< / sub> | امزج 1 مل 30٪ H2< / sub>O2< / sub> مع الميثانول مع 9 مل من الميثانول | ||
| 3،3'-diaminobenzidine (DAB) مجموعة | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 جم × 1/2 بوصة | إبرة BD | 305106 | |
| 30٪ H2< / sub>O2< / sub> | Chemical Works | ||
| 5 مل حقنة | BD | Z683574 | |
| 50 مل مخروطي البولي بروبيلين أنبوب الطرد المركزي | فالكون | 14-432-22 | |
| 50٪ مزيج الإيثانول | 500 مل 100٪ الإيثانول مع 500 مل dH2< / sub>O | ||
| 54.8٪ بيركول | ميكس 2.74 مل SIP مع 2.26 مل 1 & مرات ؛ PBS ، الوقوف ساكنا | ||
| 70٪ إيثانول | ميكس 700 مل 100٪ إيثانول مع 300 مل dH 2< / sub>O | ||
| 70.2٪ بيركول | ميكس 3.51 مل SIP مع 1.49 مل 1 & مرات ؛ PBS ، قف ساكنا | ||
| 80٪ إيثانول | ميكس 800 مل 100٪ إيثانول مع 200 مل dH 2< / sub>O | ||
| 95٪ إيثانول | ميكس 950 مل 100٪ إيثانول مع 50 مل dH 2< / sub>O | ||
| التمايز الحمضي | Beyotime | C0165S | |
| الأجسام | |||
| المضادة للأجسام المضادة للميلوبيروكسيداز | Abcam | ab208670 | |
| الأجسام المضادة للإيلاستاز المضادة للعدلات | Abcam | ab21595 | |
| محلل أمراض الدم الأوتوماتيكي | Sysmex | XS-800i | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) VWR | 0332-100G | ||
| مساعد فرويند الكامل ، 10 مجم / مل | سيجما | 1002036152 | |
| غطاء زلة | CITOGLAS | 10212432C | |
| مقياس سمك الاتصال الهاتفي | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf Microtubes ، 1.5 مل | سيجما | Z606340 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) نظام التخدير بالغاز الممتاز | PAN | P30-1302 | |
| ZS Dichuang | ZS-MV-IV | ||
| الماعز المضاد للأرانب IgG H& L (HRP) | PPLYGEN | C1309 | هذا هو الجسم المضاد الثانوي المستخدم في التلوين الكيميائي المناعي. |
| محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) | الصناعات البيولوجية ، بيث هايميك ، إسرائيل | 02-016-1A | |
| محلول تلطيخ هيماتوكسيلين | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| عديد السكاريد الدهني (LPS) | Sigma | L3012 | |
| الوسائط والمكملات | |||
| الغذائية المعدلة Safranin O-fast Green FCF الغضروف طقم وصمة | Solarbio | G1371 | |
| N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) | Sigma | 47729 | |
| محلول البنسلين ستربتومايسين ، 100 & مرة ؛ | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | كثافة التدرج متوسط |
| العازلة | نفاذية 100 & mu ؛ L Triton X-100 مع 1 لتر dH 2< / sub>O للحصول على 0.01٪ Triton X-100 | ||
| محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، 1 & مرات ؛ | امزج 90٪ ddH2< / sub>O مع 10٪ (حجم / حجم) 10 مرات ؛ PBS ، | ||
| ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، 10 مرات ؛ | يذوب 16 جم كلوريد الصوديوم ، 0.4 جم كلوريد كلوريد ، 2.88 جم من Na 2< / sub>HPO 4 & middot ؛ < / sub > 2 ساعة < sub > 2 < / sub > O ، 0.48 جم KH2< / sub>PO 4< / sub> (اللامائية) في 200 مل ddH 2 < / sub >O ، ضبط الرقم الهيدروجيني 7.4 ، المعقمة | ||
| والمعدات البلاستيكية مسحوق | |||
| البروتيوز البيبتون | أوكسيد | 1865317 | |
| المخزن المؤقت | لاسترجاعامزج 18 مل من المخزن المؤقت للاسترجاع A مع 82 مل من المخزن المؤقت لاسترجاع B ، وأضف dH 2< / sub >O إلى 1000 مل ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.0 | ||
| Retrieval Buffer A Stock ل IHC | قم بإذابة 4.2 جم حامض الستريك (C6< / sub>H5< / sub>O7 & middot ؛ < / sub >H 2 < / sub >O) في 200 مل dH < sub > 2 < / sub > | ||
| O Retrieval Buffer B Stock for IHC | يذوب 5.88 جم ثنائي هيدرات سترات ثلاثي الصوديوم (C6< / sub>H 5< / sub>Na 3< / sub >O7 < / sub > middot ؛ 2H2< / sub>0) في 200 مل dH2< / sub>O | ||
| معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) -1640 متوسط | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 | متوسط كامل RPMI-1640 يتم استكماله ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. | ||
| Shu Rui U40 إبرة حقن الأنسولين المعقمة التي يمكن التخلص منها 1 مل | BD | 328421 | |
| الشريحة | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| محلول | |||
| مخزون متساوي التوتر Percoll (SIP) امزج | 90٪ (V / V) من percoll مع 10٪ (V / V) 10 مرات ؛ PBS ، قف ثابتا لمدة 20 دقيقة | ||
| عازلة الغسيل في فحص الحقيبة | تمييع 0.5 متر EDTA إلى 10 ملي متر مع HBSS | ||
| Xylene | Beijing Chemical Works |
المراجع
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
