يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر الثقافة من الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى الإنسان

7.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60551

⸱

نوفمبر 28, 2019

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى البشري لتحديد تغايرها وخصائصها الوظيفية للتطبيق المحتمل في النماذج السريرية والفسيولوجية.

الملخص

وقد تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في الأدبيات لعزله وثقافة الخلايا الظهاريه الإنسان السلوى (HAEC). ومع ذلك ، فان هذه تفترض ان ظهاره السلوى طبقه متجانسة. يمكن تقسيم الإنسان إلى ثلاث مناطق تشريحيه: منعكسة ، والمشيمة ، والسرة. كل منطقه لها ادوار فسيولوجية مختلفه ، كما هو الحال في الحالات المرضية. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتشريح الانسجه الإنسان امايون في ثلاثه أقسام والحفاظ عليه في المختبر. وفي الثقافة ، تظهر الخلايا المشتقة من الامايون المنعكس شكلا كوبويدالا ، في حين ان الخلايا الماخوذه من منطقتي المشيمة والسرة كانت حرشفية. ومع ذلك ، فان جميع الخلايا التي تم الحصول عليها لديها النمط الظاهري الظهاريه ، التي أظهرتها المناعة من البريد الكتروني. التالي ، لان المناطق المشيمة والمنعكسة في الموقع تختلف في المكونات الخلوية والوظائف الجزيئية ، قد يكون من الضروري للدراسات في المختبر للنظر في هذه الاختلافات ، لأنها يمكن ان يكون لها اثار فسيولوجية لاستخدام HAEC في البحوث الطبية الحيوية والتطبيق الواعد لهذه الخلايا في الطب التجديدي.

المقدمة

خلايا ظهاره الإنسان السلوى (HAEC) تنشا خلال المراحل المبكرة من النمو الجنيني ، في حوالي ثمانيه أيام بعد الإخصاب. انها تنشا من السكان من الخلايا الظهاريه الحرشفية من العدسة التي تستمد من الطبقة الأعمق من الغشاء السلوى1. وهكذا ، تعتبر HAEC بقايا الخلايا المستحثة من العدسة التي لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث من الجنين2. في العقد الماضي ، قامت مجموعات بحثيه متنوعة بتطوير طرق لعزل هذه الخلايا عن الغشاء السلوى في فتره الحمل لتوصيف خصائصها الافتراضية ذات الصلة بالتعدد في نموذج الثقافة في المختبر3،4.

وبناء علي ذلك ، وجد ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología في مكسيكو سيتي (السجل رقم 212250-21041). وكانت جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسات متفقه مع المعايير الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología ، وإعلان هلسنكي ، والمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعيار المكسيكي الرسمي لوزارة الصحة.

1-الاعداد

  1. اعداد حل ل 1x تلفزيوني مع أدتا. للقيام بذلك ، أضافه 500 μL من 0.5 M الأسهم أدتا إلى 500 mL من 1x تلفزيوني للتركيز النهائي من 0.5 mM أدتا.
  2. اعداد الثقافة المتوسطة ل HAEC. خذ 450 مل من ارتفاع الجلوكوز-dmem, تكمله مع 5 مل من بيروفات الصوديوم (100 mM), 50 ml من الدم البقري الجنين غير النشطة المؤهلين....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم عزل HAEC من كل من المناطق التشريحية الثلاثة من الغشاء السلوى ومثقف بشكل فردي في المختبر. بعد 48 h من الثقافة ، والخلايا مع النمط الظاهري الظهاريه التمسك سطح لوحه ، علي الرغم من ان وسائل الاعلام أيضا تحتوي علي الحطام الخلوي والخلايا العائمة ، والتي أزيلت بمجرد تغيير المتوسطة (الشكل 3).

خلال معالجه الثقافة الاوليه (المرور صفر ، P0) ، يمكن ان تنشا بعض المضاعفات التي يمكن ان تتداخل مع تحليل البيانات التجريبية (الشكل 4): فمن المستحسن لل.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نفذنا بروتوكولا جديدا لعزل HAEC من الاغشيه الاجله. وهو يختلف عن التقارير السابقة في ان كل غشاء كان ينقسم إلى المناطق التشريحية الثلاث قبل العزلة لتحليل الخلايا من كل واحد.

واحده من الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول هو غسل الغشاء لأزاله جميع جلطات الدم ، لأنها يمكن ان تتداخل مع نشاط التريبسين عند فصل الخلايا الظهاريه. الفشل في تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح يمكن ان يؤدي إلى الحصول علي الثقافة الاساسيه مع كريات الدم الحمراء المفرطة وعدد قليل من الخلايا الظهاريه ملتصقة. إذا لم يلاحظ اي مرفق في أول 2.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعمت أبحاثنا بمنح من المعهد الوطني لperinatología المكسيكية (21041 و 21081) و CONACYT (A1-S-8450 و 252756). نشكر جيسيكا غونزاليس نوريس وليديا يوريريا باريدس فيفاس علي الدعم الفني.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية > الكواشف المزروعة < / قوية >
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific / Gibco2198502355 ملي مولار
مؤتلف بشري خال من EGFPeprotechAF-100-15
مضاد حيوي مضاد للفطرياتالحرارية فيشر Scientific / Gibco15240062100X
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific / Gibco12430054مكمل بارتفاع نسبة الجلوكوز و HEPES
EDTAThermo Fisher Scientific / AmbionAM9260G0.5 M
الخلايا الجذعية الجنينية FBS ، مؤهلThermo Fisher Scientific / Gibco10439024
الأحماض الأمينية غير الأساسيةThermo Fisher Scientific / Gibco11140050100X
Paraformaldehydeأي علامة تجارية
Phosphate-Buffered SalineThermo Fisher Scientific / Gibco100100231X
محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)أي علامة تجارية
Sodium PyruvateThermo Fisher Scientific / Gibco11360070100 mM
Trypsin / EDTA 0.05٪Thermo Fisher Scientific / Gibco25300054
المواد التي يمكن التخلص منها < / قوية >
100 ومايكرو ؛ مصفاة الخليةm Corning / Falcon352360
100 مم طبق ثقافة معالج TCCorning430167
24 بئر شفاف TC معالج لوحات الآبار المتعددةCorning / Costar3526
6 آبار شفافة TC معالج لوحات الآبار المتعددةCorning / Costar3516
أنبوب الطرد المركزي المعقم غير الناريأي علامة تجاريةمع مخروطي أطراف معقمة قاضية
غير حرارية من 1,000 & micro; لتر ، 200 وميكرو ؛ ل و 10 & micro ؛ l.
شاشات
ماصات مصلية معقمة من 5 و 10 و 25 ملأي علامة تجارية
قفازات جراحية معقمةأي علامة تجارية
<قوية>معدات< / قوية>
السلامة
الطردالمركزي
الماصات
الدقيقة حشو /
أكواب معقمة من 500 مل
تقطيع بلاستيكي معقم
مشارط معقمة ، مقص ، ملقط ، مشابك
حاوية معقمة من الفولاذ
معقمة
أنبوب دوارMaCSmix
<قوي > الأجسام المضادة وأطقم < قوي >< قوي > معرف الجسم المضاد < / قوي >
مضاد للكاديرينBD Biosciences610181RRID: AB_3975
Anti-KI67سانتا كروز23900RRID: AB_627859)
مضاد للنانوجPeprotech500-P236RRID: AB_1268274
Anti-OCT4Abcamab19857RRID: AB_44517
Anti-SOX2MilliporeAB5603RRID: AB_2286686
إشارات الخلايا المضادة ل SSEA-44755RRID: AB_1264259
إشارات الخلية المضادة ل TRA-1-604746RRID: AB_2119059
الماعز المضادة للفأر Alexa Fluor 488ثيرمو فيشر ScientificA-11029RRID: AB_2534088
الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11036RRID: AB_10563566
Tunel Assay KitAbcam66110
قطنية معقمة خزانة البيولوجيةموزع ماصات آلية لوح المقاوم للصدأصينية

المراجع

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الظهارية السلوية البشريةتشريح الغشاء السلويبروتوكول الهضم الإنزيميتقنية عزل الخلاياالطرد المركزي والترشيحتحليل النمط الظاهري الظهاريالكشف المناعي عن E-cadherinمؤشر التكاثر Ki-67مناطق السرة المشيمية المنعكسةزراعة الخلايا في المختبر