يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى البشري لتحديد تغايرها وخصائصها الوظيفية للتطبيق المحتمل في النماذج السريرية والفسيولوجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى البشري لتحديد تغايرها وخصائصها الوظيفية للتطبيق المحتمل في النماذج السريرية والفسيولوجية.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في الأدبيات لعزله وثقافة الخلايا الظهاريه الإنسان السلوى (HAEC). ومع ذلك ، فان هذه تفترض ان ظهاره السلوى طبقه متجانسة. يمكن تقسيم الإنسان إلى ثلاث مناطق تشريحيه: منعكسة ، والمشيمة ، والسرة. كل منطقه لها ادوار فسيولوجية مختلفه ، كما هو الحال في الحالات المرضية. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتشريح الانسجه الإنسان امايون في ثلاثه أقسام والحفاظ عليه في المختبر. وفي الثقافة ، تظهر الخلايا المشتقة من الامايون المنعكس شكلا كوبويدالا ، في حين ان الخلايا الماخوذه من منطقتي المشيمة والسرة كانت حرشفية. ومع ذلك ، فان جميع الخلايا التي تم الحصول عليها لديها النمط الظاهري الظهاريه ، التي أظهرتها المناعة من البريد الكتروني. التالي ، لان المناطق المشيمة والمنعكسة في الموقع تختلف في المكونات الخلوية والوظائف الجزيئية ، قد يكون من الضروري للدراسات في المختبر للنظر في هذه الاختلافات ، لأنها يمكن ان يكون لها اثار فسيولوجية لاستخدام HAEC في البحوث الطبية الحيوية والتطبيق الواعد لهذه الخلايا في الطب التجديدي.
خلايا ظهاره الإنسان السلوى (HAEC) تنشا خلال المراحل المبكرة من النمو الجنيني ، في حوالي ثمانيه أيام بعد الإخصاب. انها تنشا من السكان من الخلايا الظهاريه الحرشفية من العدسة التي تستمد من الطبقة الأعمق من الغشاء السلوى1. وهكذا ، تعتبر HAEC بقايا الخلايا المستحثة من العدسة التي لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث من الجنين2. في العقد الماضي ، قامت مجموعات بحثيه متنوعة بتطوير طرق لعزل هذه الخلايا عن الغشاء السلوى في فتره الحمل لتوصيف خصائصها الافتراضية ذات الصلة بالتعدد في نموذج الثقافة في المختبر3،4.
وبناء علي ذلك ، وجد ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología في مكسيكو سيتي (السجل رقم 212250-21041). وكانت جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسات متفقه مع المعايير الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología ، وإعلان هلسنكي ، والمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعيار المكسيكي الرسمي لوزارة الصحة.
1-الاعداد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم عزل HAEC من كل من المناطق التشريحية الثلاثة من الغشاء السلوى ومثقف بشكل فردي في المختبر. بعد 48 h من الثقافة ، والخلايا مع النمط الظاهري الظهاريه التمسك سطح لوحه ، علي الرغم من ان وسائل الاعلام أيضا تحتوي علي الحطام الخلوي والخلايا العائمة ، والتي أزيلت بمجرد تغيير المتوسطة (الشكل 3).
خلال معالجه الثقافة الاوليه (المرور صفر ، P0) ، يمكن ان تنشا بعض المضاعفات التي يمكن ان تتداخل مع تحليل البيانات التجريبية (الشكل 4): فمن المستحسن لل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نفذنا بروتوكولا جديدا لعزل HAEC من الاغشيه الاجله. وهو يختلف عن التقارير السابقة في ان كل غشاء كان ينقسم إلى المناطق التشريحية الثلاث قبل العزلة لتحليل الخلايا من كل واحد.
واحده من الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول هو غسل الغشاء لأزاله جميع جلطات الدم ، لأنها يمكن ان تتداخل مع نشاط التريبسين عند فصل الخلايا الظهاريه. الفشل في تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح يمكن ان يؤدي إلى الحصول علي الثقافة الاساسيه مع كريات الدم الحمراء المفرطة وعدد قليل من الخلايا الظهاريه ملتصقة. إذا لم يلاحظ اي مرفق في أول 2.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
وقد دعمت أبحاثنا بمنح من المعهد الوطني لperinatología المكسيكية (21041 و 21081) و CONACYT (A1-S-8450 و 252756). نشكر جيسيكا غونزاليس نوريس وليديا يوريريا باريدس فيفاس علي الدعم الفني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية > الكواشف المزروعة < / قوية > | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 21985023 | 55 ملي مولار |
| مؤتلف بشري خال من EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات | الحرارية فيشر Scientific / Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 12430054 | مكمل بارتفاع نسبة الجلوكوز و HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific / Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| الخلايا الجذعية الجنينية FBS ، مؤهل | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 10439024 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | أي علامة تجارية | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 10010023 | 1X |
| محلول ملحي (كلوريد الصوديوم 0.9٪) | أي علامة تجارية | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin / EDTA 0.05٪ | Thermo Fisher Scientific / Gibco | 25300054 | |
| المواد التي يمكن التخلص منها < / قوية > | |||
| 100 ومايكرو ؛ مصفاة الخلية | m Corning / Falcon | 352360 | |
| 100 مم طبق ثقافة معالج TC | Corning | 430167 | |
| 24 بئر شفاف TC معالج لوحات الآبار المتعددة | Corning / Costar | 3526 | |
| 6 آبار شفافة TC معالج لوحات الآبار المتعددة | Corning / Costar | 3516 | |
| أنبوب الطرد المركزي المعقم غير الناري | أي علامة تجارية | مع مخروطي أطراف معقمة قاضية | |
| غير حرارية من 1,000 & micro; لتر ، 200 وميكرو ؛ ل و 10 & micro ؛ l. | |||
| شاشات | |||
| ماصات مصلية معقمة من 5 و 10 و 25 مل | أي علامة تجارية | ||
| قفازات جراحية معقمة | أي علامة تجارية | ||
| <قوية>معدات< / قوية> | |||
| السلامة | |||
| الطرد | المركزي | ||
| الماصات | |||
| الدقيقة حشو / | |||
| أكواب معقمة من 500 مل | |||
| تقطيع بلاستيكي معقم | |||
| مشارط معقمة ، مقص ، ملقط ، مشابك | |||
| حاوية معقمة من الفولاذ | |||
| معقمة | |||
| أنبوب دوار | MaCSmix | ||
| <قوي > الأجسام المضادة وأطقم < قوي > | < قوي > معرف الجسم المضاد < / قوي > | ||
| مضاد للكاديرين | BD Biosciences | 610181 | RRID: AB_3975 |
| Anti-KI67 | سانتا كروز | 23900 | RRID: AB_627859) |
| مضاد للنانوج | Peprotech | 500-P236 | RRID: AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID: AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID: AB_2286686 |
| إشارات الخلايا المضادة ل SSEA-4 | 4755 | RRID: AB_1264259 | |
| إشارات الخلية المضادة ل TRA-1-60 | 4746 | RRID: AB_2119059 | |
| الماعز المضادة للفأر Alexa Fluor 488 | ثيرمو فيشر Scientific | A-11029 | RRID: AB_2534088 |
| الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID: AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.