Method Article

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

DOI:

10.3791/60571

⸱

January 18th, 2020

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعروض هنا هو بروتوكول لتوليد ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز اللاحقة في خلايا السلف العصبية. البروتوكول بسيط وقوي وقابل للتطوير ومناسب للكشف عن المخدرات وتطبيقات الطب التجديدي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفريق في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) قد حولت القدرة علي دراسة التنمية البشرية علي المستويين البيولوجي والجزيئي وتوفير الخلايا لاستخدامها في التطبيقات التجديدية. النهج القياسية للثقافة hESC باستخدام ثقافة نوع مستعمره للحفاظ علي Hesc غير متمايزة والجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة للتمييز في طبقات جرثوميه مختلفه غير فعاله وتستغرق وقتا طويلا. المقدمة هنا هو أسلوب ثقافة خليه واحده باستخدام hESCs بدلا من ثقافة من نوع مستعمره. هذا الأسلوب يسمح الحفاظ علي السمات المميزة لل hESCs غير متمايزة ، بما في ذلك التعبير عن علامات Hescs علي مستويات مماثله لنوع مستعمره hESCs. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله للجيل الخلايا العصبية (المجلس الوطني لنواب الشعب) من نوع خليه واحده hESCs التي تنتج NPCs في غضون أسبوع 1. هذه الخلايا تعبر كثيرا عن الجينات علامة المجلس الوطني ويمكن التفريق في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes. هذا النظام الثقافة خليه واحده لل hESCs سيكون مفيدا في التحقيق في أليات الجزيئية لهذه العمليات ، ودراسات لبعض الامراض ، وشاشات اكتشاف المخدرات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاث ، والتي تفرق بعد ذلك إلى مختلف السلالات خلايا السلف متعددة القوي. هذه السلالات تؤدي فيما بعد إلى جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان. وقد حولت نظم الثقافة في المختبر القدرة علي دراسة تطور الاجنه البشرية واستخدمت كاداه قيمه للحصول علي رؤى جديده حول كيفيه تنظيم هذه العمليات علي المستويين البيولوجي والجزيئي. المثل ، فان دراسات الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) المتولدة من أعاده برمجه الخلايا الجسدية المعزولة عن المرضي البشريين توفر رؤى جديده للامراض المختلفة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للبروجنتور والخلايا المتمايزة المستمدة من hescs ان تكون مفيده للبحوث التي تنطوي علي الع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد الطبقة السفلية المؤهلة لغشاء القبو-لوحات مغلفه

  1. الذوبان ببطء في مصفوفة غشاء الطابق السفلي المؤهلة hESC (انظر جدول المواد) الحل في 4 درجه مئوية لمده لا تقل عن 2-3 h أو بين عشيه وضحيها لتجنب تشكيل هلام.
  2. لاعداد الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة لوحات ، وتمييع مصفوفة في DMEM الباردة/F12 إلى تركيز النهائي 2 ٪. تخلط جيدا ومعطف كل بئر من 6 لوحه جيدا مع 1 مل من محلول مصفوفة المخفف.
  3. احتضان الغشاء السفلي مصفوفة الصفائح المغلفة في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 3 ساعات علي الأقل أو عند 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
    ملاحظه: يمكن تخزين لوحات مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي في 4 درجه مئوية لمده 1 أسبوع قبل أزاله الحل مصفوفة ويتم ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعروض هنا هو بروتوكول محسن للحفاظ علي وتوسيع ثقافة نوع خليه واحده من hESCs وتمايزها كفاءه في خلايا السلف العصبية ، والتي تميز في وقت لاحق إلى مختلف السلالات العصبية المصب ، بما في ذلك الخلايا العصبية والاستروسيتيه.

تظهر الصور المتباينة للمرحلة التمثيلية شكل الخلية في خطوات مختلفه اثناء التكيف مع نوع المستعمرات hESCs إلى ثقافة نوع الخلية الواحدة (الشكل 1ا). ومن خلال الحالة الثقافية للخلية الواحدة ، تبين انه يمكن الاحتفاظ بالhescs المعدلة بكثافة ع.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المعايير الهامه لفحص المخدرات والعلاج بالخلايا الجذعية الطرق القابلة للتطوير والكفاءة للتفريق بين الhescs والسلالات المختلفة وتوليد اعداد كافيه من الخلايا المتمايزة. وقد نشرت مختلف طرق تمرير خليه واحده, في الخلايا التي يتم استزراعها في وجود مثبطات الصخور أو غيرها من الجزيئات الصغيرة لتحسين البقاء علي قيد الحياة, ولكن المنتجات النهائية لهذه الأساليب الثقافة هي مستعمره نوع hescs17,18,19,20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور كارل د. بورتنر (NIEHS) علي مساعدته في تحليل النظام. وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج البحوث داخل المعهد الوطني للعلوم الصحية البيئية ، والمعاهد الوطنية للصحة ، Z01-101585 إلى AMJ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 مم أطباق m-DishIbidi81156طبق ثقافة الخلايا
6 ألواح الآبار Corning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104-500
Reflection A& نظام D338-AC-050
حمض الأسكوربيكSigma AldrichA4403
B27 ملحقThermo Fisher17504044
B27 (-Vit A)Thermo Fisher12587010
BDNFالمواد البيولوجية التطبيقيةZ100065
bFGFPeprotech100-18C
الطرد المركزيDAMON / ICE428-6759
حاضنة CO2Thermo Fisher4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)غشاء القاعدةCorning 354277(تستخدم لمعظم البروتوكول هنا)
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930محلول تجميد الخلايا المنفصلة
تقنيات الخلايا الجذعية7923
DMEMثيرمو فيشر10569-010
DMEM / F12ثيرمو فيشر10565-018
دورسومورفينتوكريس3093
EGFبيبروتكAF-100-16A
مصل الأبقار الجنينيفيشر العلميSH3007003HI
FGF8المواد البيولوجية التطبيقيةZ101705
البيولوجية التطبيقيةGDNFZ101057
مصفوفة GeltrexThermo FisherA1569601مصفوفة الغشاء القاعدي
GlutaMaxThermo Fisher35050061مكمل الجلوتامين ، 100X
H9 (WA09) خط الخلايا الجذعية الجنينية البشريةWiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
Knockout DMEMThermo Fisher10829018
KnockoutSum Replacement Thermo Fisher10828028
LamininSigma AldrichL2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC الثقافة المتوسطة
N2 مكملغذائي Thermo Fisher17502001
NEAAThermo Fisher11140050
NeurobasalThermo Fisher21103049
Poly-L-ornithineSigma AldrichP3655
ROCK inhibitorTocris1254
SB431542Tocris1614
SHHالمواد البيولوجية التطبيقيةZ200617
Stemdiff السلف العصبي المتوسطتقنيات الخلايا الجذعية5833وسيط توسيع NPC
Cell R أجهزة مصفوفة المواد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Embryonic Stem CellsSingle Cell CultureNeural Progenitor CellsEmbryoid Body FormationROCK InhibitorNeural Induction MediumDopaminergic NeuronsAstrocyte DifferentiationFACS AnalysisQuantitative PCR

Related Articles