على الرغم من الاهتمام الطويل الأمد بأصول التنوع الحيواني ، إلا أن لدينا فهما محدودا للتغيرات الجينية التي تكمن وراء تطور التشكل وعلم وظائف الأعضاء والسلوك. برزت الرباعية المكسيكية ، Astyanax mexicanus ، كنموذج قوي لتعزيز فهمنا لكيفية تطور السمات. يوجد هذا النوع من الأسماك كنموذجين شكليين ، شكل يعيش في النهر (أسماك سطحية) بكثرة في الأنهار عبر المكسيك وجنوب تكساس ، وأشكال تعيش في الكهوف عديمة العين (أسماك الكهف) التي تزدهر في كهوف الحجر الجيري المظلمة دائما داخل منطقة سييرا ديل عبرا في شمال شرق المكسيك1. هناك 29 مجموعة كهوف معروفة نشأت من غزوتين مستقلتين على الأقل للأسماك السطحية2،3. ظلت أشكال الكهف والنهر متداخلة ويسهل تكاثرها في المختبر مما يسمح للباحثين برسم خريطة وراثية للسمات التي تتطور استجابة للضغوط الانتقائية الفريدة في الكهف. على سبيل المثال ، أدى غياب الضوء إلى تراجع العين4،5،6،7،8،9 ، الصباغ10،11،12،13،14 ، والنوم15،16،17،18،19. تم اختيار الحد من المغذيات للإفراط في تناول الطعام20 ، وزيادة الوزن21 ، وتخزين الدهون22 ؛ وقد عزز التنقل في الظلام زيادة القدرة على الشعور بالبيئة23،24،25،26،27،28. يقوم عدد متزايد من الباحثين بتسخير هذه السمكة لاستكشاف الأساس الجيني للتطور. نظرا لأن بعض السمات التكيفية في أسماك الكهف ضارة بالبشر ، فقد أصبحت أسماك الكهف أيضا جذابة للأبحاث الطبية الحيوية21،29،30،31. بهدف تعزيز قابلية التكاثر وتوفير منصة للباحثين الجدد ، توفر مجموعة طرق JoVE هذه تقنيات للتربية وقياس السمات وفحص نشاط الجينات.
كنقطة انطلاق ، فإن إجراء الإخصاب في المختبر الذي أظهره Peuß et al. يخدم 32 أغراضا متعددة لأنه يوفر طريقة للحصول على 1) هجينة كهفية / سطحية قد يكون من الصعب تكاثرها ، 2) أجنة مرحلة خلية واحدة للحقن المجهري ، و 3) عينات متطابقة مع المرحلة لتحليل الأنماط الظاهرية الجنينية. A. mexicanus تفرخ عادة أثناء الليل. Peuß et al. وصف نظام لتغيير دورة الضوء والظلام والحصول على الأسماك المعدة لجمع الأمشاج خلال ساعات العمل العادية. يعد العرض المرئي لمجموعة الأمشاج مفيدا بشكل خاص لأن هذه الخطوة تتطلب تقنية دقيقة. مقالتهم ضرورية لعدد من التطبيقات النهائية بما في ذلك مقارنة أنماط التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني.
لوك وآخرون. 33 توفير بروتوكول تهجين قوي في الموقع محسن لتصور التعبير الجيني في أجنة مكسيكية . يقومون بتبسيط هذا الإجراء متعدد الأيام باستخدام قائمة مرجعية (يتم توفيرها كملف تكميلي) ومشاركة إرشادات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. مكمل لهذه الطريقة ، Riddle et al. 34 يوضح كيفية فحص التعبير الجيني وتوطين البروتين في الأسماك المفرغة باستخدام الكيمياء المناعية الكاملة. لإجراء مقارنات ذات مغزى بين الأنماط الشكلية بعد بدء الفقس والتغذية ، من الضروري التحكم في ظروف النمو. يوضحون كيفية تربية البالغين من خلال التفريخ الطبيعي وتربية اليرقات بكثافات ثابتة على نظام غذائي روتيفر له مزايا كبيرة في محتوى المغذيات والتكلفة مقارنة بمصادر الغذاء الأخرى. يتعرف بروتوكول التلوين المناعي الخاص بهم بنجاح على المستضدات في الدماغ والأمعاء والبنكرياس في وقت متأخر يصل إلى 12 يوما بعد الفقس مما يسمح باستجواب المراحل المتأخرة من نمو الأعضاء ووظيفتها. الأهم من ذلك ، أنها توفر قائمة بالأجسام المضادة التي تم استخدامها بنجاح في A. mexicanus. الأساليب المدمجة ل Luc et al. و Riddle et al. مفيدة لتحليل آثار التلاعب الجيني.
في مجموعة الأساليب هذه ، ستال وآخرون. 35 يصف طرقا متعددة لمعالجة وظيفة الجينات في A. mexicanus بما في ذلك: الحقن المجهري مورفولينو ، والطفرات بوساطة CRISPR-Cas9 ، والتوليد المتبادل بوساطة Tol2. بالإضافة إلى إظهار حقن بيكو وفحص الأجنة المحقونة ، فإنها توفر إرشادات مفيدة لتصميم مورفولينوس ، وتوجيه الحمض النووي الريبي ، والجينات المعدلة. يشاركون النتائج التي تتحقق من صحة كل من هذه التقنيات. على سبيل المثال ، استهداف هيبوكريتين / أوركسين (HCRT) باستخدام مورفولينو مانع لصق يقلل من النشاط الحركي ويزيد من النوم في أسماك الكهف. ينتج عن تحرير OCA2 (الموضع المسبب لمهق أسماك الكهف) في الأسماك السطحية باستخدام CRISPR / Cas9 أسماك سطحية ألبينو. وإدخال مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا مدفوعا بمحفز لأسماك الزرد العصبية باستخدام Tol2 يحقق تعبيرا عصبيا شبه في كل مكان في رباعي المكسيك. يشيرون إلى أن العديد من الأدوات الجينية التي تم تطويرها في أسماك الزرد يمكن نقلها مباشرة إلى أسماك الكهف بسبب جينوماتها المتشابهة. مقالتهم هي مورد أساسي للباحثين الذين يجرون دراسات وظيفية في A. mexicanus وتكمل المقالات الإضافية التي تركز على قياس الأنماط الظاهرية ، بما في ذلك السلوك.
قللت أسماك الكهف بشكل كبير من النوم وغيرت إيقاع الساعة البيولوجية36،37،38. يقدم هذا فرصة مثيرة للتحقيق في مساهمة علم الوراثة والبيئة في التباين في النوم في الفقاريات. جاغارد وآخرون. 39 توضح كيفية بناء نظام من مواد غير مكلفة يمكن استخدامها لتسجيل النوم في مراحل الحياة المختلفة وفي سياقات مختلفة. علاوة على ذلك ، يصفون كيفية أتمتة تتبع الأسماك في هذا الإعداد والحصول على قياسات كمية للنوم والحركة. تقنيتهم قابلة للتطبيق في الفحص الدوائي والجيني عالي الإنتاجية بالإضافة إلى دراسات رسم الخرائط الجينية التقليدية.
بالإضافة إلى انخفاض النوم ، طورت أسماك الكهف اختلافات في الأنشطة الحركية المرتبطة بالبحث عن الطعام ، بما في ذلك تغيير زاوية التغذية وجذب الاهتزاز16،30،40. من الأمور الأساسية لفهم كيفية تطور هذه الأنشطة ربطها بالتغيرات التنموية. ورشام وآخرون. 41 طرقا حاضرة لتسجيل السلوكيات وربطها بالتغيرات في الصواري العصبية. الهياكل الحسية الميكانيكية الخارجية التي تستجيب لتدفق المياه. يوضحون أولا كيفية إنشاء غرف لتسجيل جاذبية الاهتزاز والنوم ، ويقدمون وصفا تفصيليا لكيفية تحديد السلوكيات باستخدام البرامج المجانية والنصوص القابلة للتخصيص. بعد ذلك ، يوضحون كيفية تصور الصواري العصبية في الأسماك البالغة الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الفلورية ومرة أخرى ، باستخدام البرامج الحرة ، كيفية تحديد عدد الصواري العصبية بطريقة شبه آلية. يرتبط جذب الاهتزاز ورقم الصاري العصبي23 ؛ توفر طريقتهم بروتوكولا خطوة بخطوة لاستجواب هذه العلاقة. يمكن استخدام طرق جاغارد وورشام للكشف عن سلوكيات إضافية ويمكن أيضا تطبيقها على أنواع أخرى من الأسماك. تنتج هذه الطرق نتائج كمية ومتسقة ضرورية لاكتشاف الأساس الجيني للتطور السلوكي.
دفعت التقنيات الحديثة لقياس وظيفة الجينات ومعالجتها الدراسات التطورية من المقارنة إلى الميكانيكية. مجتمعة ، تعمل المقالات الموجودة في مجموعة الطرق هذه كدليل إرشادي لإجراء تحقيقات في وظيفة الجينات في A. mexicanus. بينما اكتشف الباحثون اختلافات رائعة في التشكل وعلم وظائف الأعضاء والسلوك بين أشكال السطح والكهوف ، إلا أن هناك العديد من السمات التي لم يتم استكشافها بالتفصيل بعد ، ومن المحتمل أن يتم اكتشافها المزيد. مع القيام بمزيد من العمل ، ستستمر هذه السمكة الصغيرة في إحداث تأثير كبير على فهمنا للتطور.