Method Article

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

DOI:

10.3791/60593

⸱

March 23rd, 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تطوير الجهاز العصبي الفقاري تنسيقًا دقيقًا للسلوكيات والتفاعلات الخلوية المعقدة. يمكن أن يوفر استخدام الدقة العالية في تقنيات التصوير الحي نافذة واضحة على هذه العمليات في الكائن الحي. على سبيل المثال، يمكن اتباع تقسيم الخلايا وذريتها في الوقت الحقيقي مع تشكل الجهاز العصبي. في السنوات الأخيرة، أدت التطورات التقنية في التقنيات متعددة الألوان إلى توسيع أنواع الأسئلة التي يمكن التحقيق فيها. يمكن استخدام نهج Brainbow متعدد الألوان ليس فقط للتمييز بين الخلايا الشبيهة ، ولكن أيضًا لرمز اللون متعدد المستنسخين المختلفين للخلايا ذات الصلة التي تستمد كل منها من خلية ذرية واحدة. وهذا يسمح لتحليل النسب متعددة من العديد من المستنسخين مختلفة وسلوكياتهم في وقت واحد أثناء التنمية. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى على مدى الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية. هذا مفيد بشكل خاص لمتابعة التفاعلات الخلوية بين الخلايا مثل، والتي يصعب تسمية بشكل تفاضلي باستخدام الألوان التقليدية التي يحركها المروج. يمكن استخدام نهجنا لتتبع علاقات النسب بين استنساخ مختلفة متعددة في وقت واحد. توفر مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية معلومات غنية يمكن مقارنتها كمًا عبر التلاعب الجيني أو الدوائي. في نهاية المطاف يمكن أن تساعد النتائج التي تم إنشاؤها في الإجابة على أسئلة منهجية حول كيفية تطور الجهاز العصبي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المراحل المبكرة من التنمية، تنقسم برك الخلايا السلف المتخصصة بشكل متكرر في مناطق تكاثرية، وتنتج صفائف متنوعة من خلايا الابنة. الخلايا التي ولدت خلال هذه الفترة التنموية ثم التفريق والسفر لتشكيل الأعضاء الوليدة. في الجهاز العصبي، السلفمثل غليا شعاعي تؤدي إلى خلايا عصبية غير ناضجة في مناطق البطين. كما تهاجر الخلايا العصبية بعيدا عن البطينين وناضجة, الأنسجة توسيع يشكل في نهاية المطاف هياكل معقدة للغاية من الدماغ1,,2,,3,,4,,5,,6. التنسيق بين تقسيم السلف والتمايز وهجرة الخلا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرفق بالحيوان (IACUC) في كلية لويس وكلارك على الإجراءات المتعلقة بالمواد الحيوانية.

1. الحقن الدقيق لأجنة حمار وحشي

  1. إعداد نوع البرية، والحمار الوحشي الكبار في خزانات التزاوج الجنس المنفصلة بعد الظهر قبل إجراء الحقن المجهري39،40.
  2. إعداد حل الحمض النووي في الصباح من الحقن المجهرية. تمييع hsp:Zebrabow11 الحمض النووي البلازميد إلى تركيز ~ 10 نانوغرام / μL في 0.1 mM KCl، جنبا إلى جنب مع 2.5٪ فينول الأحمر و 3.75U الأنزيم Recombinase Cre.
  3. إجراء الحقن المجهري ة لمحلول الحمض النووي في أج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا القسم أمثلة للنتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام نهج التصوير الفاصل الزمني في الجسم الحي الموضح هنا. نظهر أن استنساخ Brainbow المرمزة بلون الخلايا في منطقة البطين التكاثري من الوحش الوحشي النامية14 (الشكل 1).

عادة، عندما تم ترتيب الخلايا المسماة بقوس قزح على طول ألياف شعاعية معينة، فإنها تشترك في نفس اللون(الشكل 1D)،والتي يمكن قياسها كأوزان قناة RGB النسبية(الشكل 1E). و.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور استنساخ الخلايا السلف والخلايا العصبية في الدماغ الخلفي الحمار الوحشي النامية ومتابعتها في الجسم الحي باستخدام Brainbow والوقت الفاصل المجهر11. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع في المختبر أو الدراسات الحمراء السابقة هي القدرة على مراقبة مباشرة المنطقة التكاثرية للدماغ الفقارية في وسطها الطبيعي مع مرور الوقت. وتستند هذه التقنية إلى دراسات سابقة وصفت استنساخاً واحداً باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية. في المقابل، واستخدام hsp: Zebrabow بناء رموز ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ي. أ. بان، ج. لايفت وز. توبياس على المساهمات التقنية والفكرية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم (الجائزة 1553764) وصندوق M.J. Murdock الخيري.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ماصة نقل 1.5 مل (طرف ناعم)Globe Scientific، Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690مخفف إلى 0.2 ملي مولار في E3 لمنع تصبغ الجنين
50 مل أنابيب مخروطيةCorning352070للأجنة الصدمة للحرارة
6 أرطال من خط الصيد منالنايلون SecureLineNMT250لصنع معالجات الأجنة
7.5 مل ماصة نقلGlobe Scientific، Inc.135010
CaCl 2< / sub>SigmaC3881
لمسحات القطنPuritan867-WC No glueلصنع معالجات الأجنة
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
الحمام الجاف الرقميGenemate490016-616تستخدم لتخزين LMA عند 42 درجة ؛ نطاق
تشريح
أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجيةPrecision InstrumentsTW100F-4
حاضنةForma Scientific3158للحفاظ على الأجنة عند 28 درجة ؛ قوالب
لوحة الحقنأدوات العلوم التكيفيةTU-1
حمام مائيIsotemp فيشر Scientific2320للأجنة الصدمة للحرارة
KClAMRESCO0395ل E3 ولمحلول الحمض النووي للحقن
المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزرZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120لإنشاء ألواح حقن الاغاروز
الاغاروز منخفض الذوبان (LMA)خزانات التزاوج AMRESCOJ234
Aquaneering، Inc.ZHCT100
الميثيلين الأزرقسيجماM9140ل E3
MgSO4< / sub>Sigma9397ل E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaine-SWestern Chemical، Inc.يصنع المرق بوزن 4 مجم / مل في ماء التناضح العكسي (RO) ، ثم يضاف بالتنقيط إلى E3 إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ملي مولار لتخدير الأجنة
NaClJ.T. Baker4058-01لأطباق E3
Petri (90 مم ، 60 مم)Genesee Scientific32-107Gلإيواء الأجنة وإنشاء غرفة تصوير (60 مم)
حلقة
شركة Clover Needlecraft، Inc.354لإنشاء غرفة تصوير بطبق بتري
بالغراء الفائق (التحكم في الهلام الفائق) 1363589لوكتايتلصنع معالجات الأجنة
إبر الحقنةبيكتون ديكنسونBD329412لإزالة الأجنة
E3 C Epifluorescence World C علامات غرزة ناعمة من الفينول الأحمر Sigma P0290

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brainbow ImagingTime lapse ConfocalZebrafish Nervous SystemNeural Progenitor CellsClonal Lineage AnalysisMulticolor FluorescenceIn Vivo ImagingCell Division TrackingApoptosis DetectionInterkinetic Nuclear Migration

Related Articles