مقالة منهجية

رصد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة الخلايا التائية المستمدة من قطرة من الدم المحيطي

5.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60608

⸱

فبراير 5, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine and Clinical Immunology, Osaka University Graduate School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

لقد طورنا فحصًا بسيطًا للتدفق الخلوي لتقييم ربط الأجسام المضادة لحجب PD-1 بالخلايا التائية ، مما يتطلب فقط قطرة من الدم المحيطي من مرضى السرطان.

الملخص

مثبطات نقطة التفتيش المناعية، بما في ذلك PD-1-حجب الأجسام المضادة، قد تحسنت بشكل كبير نتائج العلاج في أنواع مختلفة من السرطان. الفعالية الدوائية لهذه العلاجات المناعية طويلة الأمد ، وتمتد حتى إلى ما بعد توقف حقنها ، بسبب تركيزات الدم المستمرة. هنا قمنا بتطوير اختبار التدفق الخلوي البسيط لتقييم حالة ربط الخلية T للأجسام المضادة PD-1-حظر nivolumab وpembrolizumab. مثل اختبار الجلوكوز، يتطلب هذا الفحص قطرة واحدة فقط من الدم المحيطي. تصور الأجسام المضادة ملزمة على الخلايا التائية هو أكثر موثوقية من قياس تركيزات الدم الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكننا تحليل العديد من العلامات المميزة المتعلقة بالمناعة على الخلايا التائية المرتبطة بالأجسام المضادة لحجب PD-1. وبالتالي ، هذه هي استراتيجية بسيطة وطفيفة التوغل لتحليل التأثير الدوائي للأجسام المضادة لمنع PD-1 في مرضى السرطان.

المقدمة

PD-1-حظر الأجسام المضادة أصبحت الخيار القياسي لعلاج أنواع مختلفة من السرطان، بما في ذلك سرطان الرئة الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)1،2،3،4. أنها تظهر تأثير علاجي ملحوظ في مجموعة فرعية من مرضى السرطان الذين لم يستجيبوا للعلاج الكيميائي السامة للخلايا التقليدية. ومع ذلك ، يمكن أن تسبب مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs) ، والتي تشمل PD-1 - الأجسام المضادة المانعة ، طيفًا فريدًا ومتميزًا من الأحداث الضائرة ، التي يطلق عليها الأحداث الضائرة المرتبطة بالمناعة (irAEs)5. على الرغم من أن irAEs يمكن أن تؤثر على جميع الأنسجة تقريبًا ، إلا أنها لوحظت بشكل شائع في الجهاز الهضمي والغدد الصماء والجلد والكبد ، ويمكن أن تسبب الطفح الجلدي والغثيان والإسهال واضطرابات الغدة الدرقية6،7. بشكل عام ، تظهر معظم irAEs في غضون شهر إلى شهرين بعد بدء ICIs. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يمكن أن تحدث بعد عام واحد من بداية العلاج أو حتى بعد توقف العلاج6،7. كما أنها تسبب أعراضًا مختلفة قد يكون من الصعب التمييز بينها والأمراض الأخرى. وبالتالي، يمكن أن يكون من الصعب تشخيص irAEs على وجه السرعة ومعالجتها بشكل مناسب. يمكن أن تؤثر الـ irAEs على جميع الأنسجة ، ويتأثر ظهورها بشدة بالخلايا المناعية المتداولة ، وخاصة الخلايا التائية المرتبطة بالأجسام المضادة المانعة PD-1. لذلك ، من المهم في البيئات السريرية وجود طريقة مباشرة وطفيفة التوغل لمراقبة الخلايا التائية المستهدفة بالأجسام المضادة.

هنا ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتقييم ربط PD-1 -حظر الأجسام المضادة للخلايا التائية باستخدام قطرة من الدم كله المحيطي من مرضى السرطان الذين تلقوا nivolumab أو pembrolizumab. باستخدام هذا النهج، تمكنا من رصد كل من التالي: 1) مدة الأجسام المضادة ملزمة للخلايا التائية، 2) شغل جزيئات الخلايا التائية PD-1 بواسطة الأجسام المضادة العلاجية، و 3) حالة التنشيط والميزات المناعية للخلايا التائية. هذا الأسلوب هو تعديل تقنية تم الإبلاغ عنها مسبقاً8. كمية الدم المطلوبة هي تقريبا نفس اللازمة لاختبار الجلوكوز، والنهج لا يتطلب إثراء الخلايا أحادية النواة أو المشاركة في الاستزراع مع PD-1-حجب الأجسام المضادة. أكدنا أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن يتم باستخدام عينات مجمدة، بما في ذلك خلايا الدم الطرفية أحادية النواة (PBMCs) وخلايا من الانصباب الجنبي، والانصباب التاموي، وسائل اللاعال القصبي، والسائل النخاعي، مما يشير إلى أن هذه الاستراتيجية قد تكون مفيدة في سياق دراسة متعددة المراكز. قد تسهل هذه الطريقة التشخيص المبكر للـ irAEs ، وتساعد أيضًا على تحديد العلاجات المثبطة للمناعة المناسبة للسيطرة على أعراضها وتحديد الأوقات المثلى لبدء العلاجات اللاحقة بعد مثبطات PD-1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء أخذ العينات أثناء الإجراءات السريرية الروتينية. وتم الحصول على جميع العينات البشرية بعد أن قدم الأشخاص الموافقة المستنيرة، وفقا لإعلان هلسنكي وبموافقة مجلس المراجعة الأخلاقية لكلية الطب العليا، جامعة أوساكا، اليابان (15383 و 752).

1. إعداد عينة الدم كله وتلطيخ

  1. جمع عينات الدم الكامل في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على حمض رباعي الخليك الإيثيلين ديامين (EDTA).
    ملاحظة: يمكن إجراء جمع الدم إما باستخدام إبرة عادية أو رمح الدم.
  2. نقل 20 ميكرولتر من عينات الدم الكامل إلى 5 مل من أنابيب تدفق البوليسترين الدائرية القاع.
    ملاحظة: للحد من الربط غير محددة من الخلايا إلى أنابيب، 1 مل من 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في الفوسفات المالحة العازلة (PBS) يضاف إلى الأنابيب ودوامة لمدة 10 ثانية قبل تطبيق على العينات.
  3. إضافة 20 ميكرولتر من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
  4. أضف 10 ميكرولتر من كاشف حظر FcR الخاص بالإنسان. مزيج جيد واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحليل خلايا الدم الحمراء. مزيج جيد واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أضف 4 مل من 2٪ FBS في PBS وتدور أسفل الخلايا في 400 × ز (1500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. إزالة supernatant من قبل الطموح.
  7. كرر عملية الغسيل والتطلع الموصوفة في الخطوة 1.6.
  8. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ FBS في PBS وتقسيمها إلى أنبوبين من 50 ميكرولتر لكل منهما.
  9. إضافة الأجسام المضادة علامة السطح(الجدول 1). مزيج جيد واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: عند تنميط الحالة المناعية للخلية التّية، يمكن زيادة عدد العلامات بناءً على جودة آلة قياس التدفق الخلوي.
  10. غسل العينات 2x كما هو موضح في الخطوة 1.6.
  11. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني.

2. تدفق التحليل الخلوي

  1. إدراج أنابيب في تدفق الخلايا والحصول على الخلايا، وأساسا بعد البروتوكول الموصى به9.
  2. سجل 10،000 الأحداث باعتبارها بوابة الخلايا الليمفاوية(الشكل 1A)وبيانات تدفق التصدير وملفات .fcs للتحليل.
  3. فتح الملفات في برنامج التحليل. تصور الخلايا على مبعثر إلى الأمام (FSC) (A) مقابل مبعثر الجانب (SSC) (A) مؤامرة والخلايا الليمفاوية بوابة(الشكل 1A).
  4. بعد اختيار خلايا واحدة باستخدام FSC (H) مقابل FSC (W) و SSC (H) مقابل SSC (W)(الشكل 1B)وعرضها على CD3 مقابل CD8 أو CD3 مقابل مؤامرة CD4 ، بوابة خلايا CD8 T وخلايا CD4 T ، على التوالي(الشكل 1C).
  5. بعد اختيار الخلايا المسورة وعرضها على PD-1 مقابل مؤامرة IgG4 الإنسان، حدد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة CD8 وCD4 T الخلايا على أساس التحكم isotype(الشكل 1D).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن لاستراتيجية الجاتينغ وتحليل قياس الخلايا المتدفق(الشكل 1)الكشف عن الأجسام المضادة المانعة PD-1 الملزمة للخلايا التائية التي تم الحصول عليها من قطرة من الدم المحيطي المريض NSCLC. قبل أن يتم إعطاء PD-1-حظر الأجسام المضادة، لا توجد خلايا CD8 أو CD4 T بشرية IGG4 إيجابية، ويمكن تأكيد التعبير PD-1 بواسطة PD-1-الكشف عن الأجسام المضادة (EH12.1)(الشكل 2A). بعد إدارة nivolumab أو pembrolizumab ، يمكن الكشف عن IgG4 (nivolumab ، pembrolizumab) على الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه المقالة ، نبلغ عن طريقة تستخدم مقياس التدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة PD-1 - حظر مرتبطة بالخلايا التائية المشتقة من قطرة من الدم المحيطي ، والتي طورناها في الأصل للكشف عن nivolumab10. على الرغم من أن هذه التقنية بسيطة جدا وسهلة الأداء، ينبغي ملاحظة نقطتين مهمتين من أجل الحصول على نتائج دقيقة. واحد هو أنه للكشف عن جزيئات PD-1، ينبغي استخدام جسم مضاد مناسب يتنافس مع نيفولوماب وpembrolizumab. تم تقييم هذه المسألة في دراسة سابقة11. والآخر هو أن RBC lysis ينبغي أن ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى S.K. من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI (JP17K16045) والوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (JP18cm0106335 و 19cm0106310).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10X RBC تحلل المخزن المؤقت (متعدد الأنواع)ثيرمو فيشر العلمي00-4300-5450 مل
APC / Cyanine7 الأجسام المضادة CD4 المضادة للإنسانBioLegend300518استنساخ RPA-T4
BD FACS Canto II مقياس التدفقالخلوي BD
Brilliant Violet 510 الأجسام المضادة CD8a المضادة للإنسانBioLegend301048استنساخ RPA-T8
فوسفات دولبيكو مخزن محلول ملحيnacalai tesque14249-95500 مل
Falcon أنابيب البوليسترين المستديرة القاعSTEMCELL Technologies3520585 مل
كاشف حجب FcR ، كاشف حجبMiltenyi130-059-9012 مل
فلونجوBD
جيبكو مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر 12676029 العلمي500 مل
الماوس IgG1 أحادي النسيلة - التحكم في النمط المتشافيabcamab81200
ماوس أحادي النسيلة مضاد للإنسان IgG4 Fcabcamab99825استنساخ HP6025
ماوس أزرق المحيط الهادئ مضاد للإنسان CD3BD558117استنساخ UCHT1
PE-Cy7 ماوس مضاد للإنسان CD279 (PD-1)BD561272استنساخ EH12.1
PE-Cy7 ماوس IgG1 & kappa; التحكم في النمط المتماثلBD557646
البشري

المراجع

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Nivolumab Pembrolizumab

مقالات ذات صلة