بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Summary

يوضح هذا البروتوكول التسجيل في الوقت الحقيقي لعلاقات الجرعة والاستجابة الكاملة لتنشيط GPCR الناجم عن الجرعة من طبقة خلية واحدة تزرع على قطب صغير واحد باستخدام قياسات مقاومة خالية من التسمية. يزيد نظام الدوس الجديد بشكل كبير من الإنتاجية دون فقدان في دقة الوقت.

Abstract

يتم استخدام الاختبارات المستندة إلى المعاوقة الخالية من الملصقات بشكل متزايد لدراسة تنشيط GPCR الناجم عن ligand غير الغازية في تجارب زراعة الخلايا. يوفر هذا النهج في الوقت الحقيقي رصد الخلية مع دقة الوقت التي تعتمد على الجهاز وصولا الى عدة عشرات من ميلي ثانية وأنه مؤتمتة للغاية. ومع ذلك، عندما ترتفع أعداد العينات (على سبيل المثال، دراسات الاستجابة للجرعة لمختلف الليغاندات المختلفة)، قد تصبح تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية التي يمكن التخلص منها وكذلك دقة الوقت المتاحة للتسجيلات المتسلسلة من قبل البئر محدودة. ولذلك ، فإننا نقدم هنا بروتوكول إضافة ناهض المسلسل الذي لديه القدرة على زيادة كبيرة في الناتج من تخفيضات GPCR خالية من التسمية. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي ، يتم إضافة جهاز GPCR agonist بالتتابع في زيادة التركيزات إلى طبقة خلية واحدة مع مراقبة مقاومة العينة باستمرار (وضع الناضر). مع هذا النهج التسلسلي، فمن الممكن الآن لإنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة لGPCR الناقد من طبقة خلية واحدة فقط. ينطبق بروتوكول الإضافة المؤنّد التسلسلي على أنواع اقتران GPCR المختلفة ، G_q G_i/0 أو_{G s} وهو متوافق مع مستويات التعبير المؤتلفة والذاتية للمستقبلات قيد الدراسة. مستقبلات منع من قبل خصوم GPCR هو تقييم كذلك (وضع الخصم).

Introduction

يقدم هذا التقرير وصفاً مفصلاً لبروتوكول الإضافة التسلسلية الذي تم تطويره للقياس الكمي لتنشيط مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين (GPCR) التي يسببها ليغاند (GPCR) في الخلايا المزروعة بالارتباط بواسطة قياسات المعاوقة الخالية من التسمية. وتشارك مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs) في العديد من الوظائف الفسيولوجية والأمراض البشرية¹. وبسبب هذا وسهولة الوصول إليها على سطح الخلية ، GPCRs هي واحدة من أهم أهداف المخدرات. وينعكس هذا التقييم في عدد يقدر بنحو 700 دواء معتمد يستهدف الـ GPCRs، أي ما يعادل حصة تبلغ ~ 35٪ على جميع الأدوية المسوقة^2.

ويشمل استحداث عقاقير جديدة عمليتين رئيسيتين هما: '1' تحديد الجزيئات البيولوجية المستهدفة وتوصيفها الوظيفي، و'2' اكتشاف مواد الرصاص الجديدة وتطويرها لتصبح أدوية قابلة للإدارة. وفي كلتا العمليتين، يلزم استخدام أساليب فعالة لتقييم التفاعلات بين المخدِّرات والأهداف والاستجابة البيولوجية اللاحقة. مراحل مختلفة من عملية تطوير المخدرات قبل السريرية الاستفادة من أساليب مختلفة للتحليل تتراوح بين دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي بين المخدرات والهدف، على الدراسات الوظيفية على الخلايا في الثقافة، إلى التجارب على مواد الأعضاء المستأصلة أو الحيوانات بأكملها. على حد سواء ، والأهمية الفسيولوجية والتعقيد البيولوجي زيادة من السابق إلى³الأخيرة. على الرغم من أن الهدف العام هو تقليل التجارب الحيوانية ، إلا أن الدراسات الدوائية باستخدام الأعضاء المعزولة من الحيوانات المختبرية أو حتى الحيوانات الكاملة تعتبر حتمية لتوصيف شامل للمرشحين الجدد للأدوية. من حيث القراءة التحليلية ، توفر دراسات علم أدوية الأعضاء استجابة وظيفية "شاملة" متكاملة ذات أهمية فسيولوجية أعلى. ومن عيوب هذه التجارب أنها لا تتوافق مع فحص الإنتاجية العالية لأسباب تقنية وأخلاقية، وقد تم استبدالها إلى حد كبير بدراسات تستند إلى ثقافة الخلية المختبرية^4.

طرق لقياس تنشيط GPCR في ثقافات الخلايا تشمل مختلف الاختبارات الكيميائية القائمة على التسمية، والتي تكشف على وجه التحديد الرسل الثانية، وحالة الفوسفور من البروتينات الإشارات المصب، وتفعيل النسخ عبر عوامل النسخ معينة أو ligand الناجمة عن الاتجار مستقبلات داخل الخلايا^4،5. ومن عيوب هذه المقالات المستندة إلى التسميات ضرورة تسمية الخلايا بأصباغ أو علامات مشعة قد تكون ضارة. وهذا غالباً ما يتطلب تشغيل المنقّأ كـ تحديد نقطة النهاية لوقت تعرض يجب أن يتم تحديده مسبقاً. إن استخدام اختبارات نقطة النهاية المستندة إلى التسميات يعاني من هذا التوقيت المحدود والمتحيز للغاية للتجربة وخطر أن التسميات الكيميائية والمسابير قد تتداخل مع فسيولوجيا الخلايا العادية - التي قد لا يلاحظها المجرب.

في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقالات خالية من التسمية لرصد تنشيط GPCR ، مثل التقنيات القائمة على المعاوقة أو الأساليب البصرية التي تطبق صريف اتصال الرنانة^5،6. ولا يشترط وضع علامات على الخلايا من الناحية التجريبية في هذه النُهج. كما هذه القراءة المادية تعمل على إشارات السعة المنخفضة، وتعتبر هذه الأساليب غير الغازية، فإنها تسمح للرصد المستمر الخلية يحتمل في الوقت الحقيقي ووقت المراقبة محدودة فقط من قبل ثقافة الخلية وليس من قبل القراءة. على غرار عمليات القراءة من أجهزة كاملة ، وعادة ما يقدم نهج خالية من التسمية على استجابات الخلايا الشاملة ، بعيدا المصب من تنشيط مستقبلات عندما التكامل على طول شبكة الإشارات بأكملها يؤدي إلى تغييرات تعتمد على الوقت ولكن بدلا غير محددة في مورفولوجيا الخلية أو إعادة توزيع الشامل. في حين أن الاختبارات المستندة إلى المعاوقة تقيس التوقيع العازل للتغيرات في شكل الخلية^7،8، فإن القياسات التي تستخدم صريفات الموجات الرنانة حساسة للتغيرات في مؤشر الانكسار في واجهة الركيزة الخلوية الناشئة عن إعادة توزيع الكتلة الديناميكية (DMR)⁹. الطابع التكاملي يجعل أساليب خالية من التسمية حساسة للغاية للأحداث بوساطة مستقبلات بغض النظر عن نوع (ق) من البروتين G (G_س،G_i/0،G_s،G_12/13)أو α-arrestin المشاركة في سلسلة الإشارات⁶ ومناسبة تماما لمستويات التعبير الذاتية من المستقبلات.

في معيار المعاوقة خالية من المعاوقة على أساس المعاوقة نمت الخلايا في لوحات متعددة الآبار مع أقطاب coplanar الذهب فيلم المودعة في الجزء السفلي من كل بئر¹⁰. وترتبط هذه الصفائف القطب إلى محلل المعاوقة ويتم تسجيل استجابات الخلية إلى التحفيز التجريبي من الآبار الفردية عن طريق قراءات المعاوقة حل الوقت. في مقاضد GPCR نموذجي يتم إضافة ligand في تركيزات مختلفة بشكل فردي لكل فرد بشكل جيد. ثم يتم تحليل التغييرات الناجمة عن ligand في مسار وقت المعاوقة فيما يتعلق بميزات المنحنى المميزة مثل الحد الأقصى لتغيير الإشارة ، والمساحة تحت المنحنى ، وتغيير الإشارة في غضون فترة زمنية معينة أو ميل المنحنى في نقطة زمنية محددة ، من أجل تحديد فعالية وفعالية ligand^11.

قد تحد تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية من تطبيق هذه التقنية في حملات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وعلاوة على ذلك ، مع تزايد أعداد العينات التي يتعين اتباعها بالتوازي ، يزيد عدد القياسات الفردية وبالتالي يقلل من دقة الوقت المتاحة لكل بئر تدريجيا - حتى بالنسبة للتسجيلات المتعددة القنوات. في ظل هذه الظروف قد الاستجابات الخلية سريعة وعابرة الهروب من القياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الأساليب التقليدية - نهج تركيز واحد يفرض عامل وقت وتكلفة كبير على التطورات المُطَلَّبة على الأجزاء أو الأجزاء على الشريحة فيما يتعلق بملاءمتها في تحليل تفاعل ligand-GPCR.

لهذا السبب، وضعنا بروتوكول الجرعات خطوة خطوة خطوة التي تمكن من تسجيل منحنيات الاستجابة الجرعة الكاملة من تنشيط GPCR الناجم عن ligand في أحادية الخلية المستزرعة عن طريق الرصد المستمر لمعاوقة بئر واحد في حين يتم زيادة تركيز ناهدي خطوة بخطوة. يزيد بروتوكول الإضافة المغطورية التسلسلي بشكل كبير من الإنتاجية لكل بئر من تركيز واحد إلى 10 تركيزات أو أكثر ، كما هو موضح في المثال الحالي لخلايا U-373 MG البشرية ، والتي تعبر بشكل داخلي عن مستقبلات الهيستامين 1 (H1R). وبالتالي، فإن الأسلوب لديه القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير في دراسات الاستجابة للجرعة الخالية من التسمية، في حين يتم الاحتفاظ بالدقة الزمنية في الحد الأقصى الفعال.

Protocol

1. البذر الخلية على صفائف القطب الكهربائي

ملاحظة: اختيار تخطيط القطب الكهربائي هو مفاضلة بين الحساسية وعدد الخلايا قيد الدراسة. كلما كان القطب الكهربائي أصغر ، كلما كان القياس أكثر حساسية ، ولكن الأصغر هو عدد الخلايا قيد الدراسة. بالنسبة للخلايا التي تظهر تقلبات مقاومة قوية بمرور الوقت في ظل ظروف خط الأساس، يفضل وجود أقطاب كهربائية أكبر أو متداخلة.

1. ما قبل الدفء جميع الحلول اللازمة لتمرير الخلايا القياسية والبذر في حمام مائي 37 درجة مئوية. للحصول على المقالات مع الإنسان U-373 MG الخلايا التي يستغرقها: الفوسفات احتياطية المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم, 0.05% (ث/v) التربسين, خلية ثقافة المتوسطة (النسر الحد الأدنى المتوسط الأساسي (EMEM) تستكمل مع 5% (v/v) مصل ربلة الساق الجنينية (FCS), 2 m M L-الجلوتامين و 100 ميكروغرام/mL penicillin/strepmy
2. شطف طبقة الخلية من ثقافة الأسهم نمت على الجزء السفلي من قوارير الخلايا التقليدية أو الأطباق مع برنامج تلفزيوني مرتين.
3. إزالة PBS، إضافة حل التربسين (1 مل ل25 سم²⁾والسماح للخلايا احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة (ينطبق على خلايا U-373 MG).
4. السيطرة على انفصال كامل من الخلايا من الجزء السفلي من الركيزة النمو عن طريق المجهر.
5. وقف تفاعل التربسين بمجرد فصل الخلايا تماما عن طريق إضافة 9 مل من وسط ثقافة الخلية لكل 1 مل من التربسين إلى تعليق الخلية. شطف بعناية الخلايا المتبقية من الجزء السفلي من الركيزة ثقافة الخلية عن طريق الأنابيب تعليق على الركيزة.
6. جمع تعليق الخلية مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي (15 مل أو 50 مل أنبوب).
7. قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 110 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. قم بإزالة supernatant بعناية وإعادة تعليق بيليه الخلية بدقة في وسط الثقافة قبل عد الخلايا (على سبيل المثال باستخدام مقياس الهيمنتو متر لمجاهر تباين المرحلة والعد اليدوي).
9. ضبط تعليق الخلية إلى كثافة الخلية المطلوبة. للتجارب مع خلايا U-373 MG، استخدم 100 000 خلية/سم² لزراعة طبقة خلية متشنجة في غضون 48 ساعة. وهذا يترجم إلى كثافة خلايا قدرها 000 200 خلية/مل لصفائف أقطاب كهربائية ذات 8 آبار تبلغ مساحتها 0.8 سم² وحجم بئر قدره 400 ميكرولتر.
   ملاحظة: بالنسبة لتجارب تنشيط GPCR القابلة للتكرار، يجب أن تزرع الخلايا لتقوم بطبقات أحادية متجانسة على صفائف الأقطاب الكهربائية. لضمان التعبير مستقبلات السليم على سطح الخلية, يجب أن تكون الخلايا بذر ما لا يقل عن 36 ساعة قبل إجراء التجربة. اختبار كثافات الخلايا المختلفة لبذر الخلايا غالبا ما تكون ذات مغزى لتحديد أفضل الظروف التجريبية.
10. إضافة تعليق الخلية إلى آبار مجموعة القطب وترك يبيع يستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 - 15 دقيقة من أجل ضمان توزيع متجانس من الخلايا في الجزء السفلي من الآبار.
11. تنمو الخلايا لمدة 36 ساعة على الأقل في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية مع 5٪ CO₂ (تعتمد على نوع متوسط) في 37 درجة مئوية والغلاف الجوي المرطب. تغيير متوسط ثقافة الخلية 24 ساعة قبل التجربة.
12. في يوم التجربة، تفقد طبقات الخلية على صفائف الأقطاب الكهربائية عن طريق المجهر (تباين المرحلة) لضمان التغطية الكاملة للأقطاب الكهربائية مع الخلايا.

2. توازن الخلايا في وسط خالية من المصل

1. قبل الحارة المتوسطة خالية من المصل، في هذه الدراسة: وسيلة L15 Leibovitz.
2. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من الخلايا التي تزرع على صفائف الأقطاب الكهربائية واستبدلها بوسيط خالٍ من المصل تم تسخينه مسبقًا. استخدم 200 ميكرولتر لصفائف أقطاب كهربائية بتنسيق 8-well، و150 ميكرولتر لصفائف أقطاب كهربائية 96-well.
3. السماح للخلايا equilibrate في وسط خالية من المصل في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. يعتمد وقت المعادلة بشدة على نوع الخلية. على سبيل المثال، خلايا U-373 MG تحتاج إلى 2 ساعة، خلايا CHO تحتاج إلى 4 ساعة، BAEC قد تتطلب التوازن بين عشية وضحاها في المتوسط L-15.
   ملاحظة: L-15 المتوسطة هو CO₂ مستقلة ويتطلب ثاني أكسيد الكربون₂خالية من الغلاف الجوي. للتوازن في L-15 تعيين الحاضنة إلى 0 ٪ CO₂. يمكن رصد التوازن عن طريق قراءات المعاوقة ، والتي نوصي بالقيام بها للتجارب الأولى.

3- رصد توازن الخلايا مع قراءات المعاوقة

1. ضع صفيف القطب الكهربائي في حامل الصفيف المتصل لمحلل المعاوقة.
2. ضمان الاتصال منخفضة المعاوقة السليم بين الأقطاب الكهربائية ومحلل المعاوقة. هذا الاختيار يختلف بشكل فردي عن الأدوات المختلفة.
   ملاحظة: إذا فشل الصك لإجراء اتصال إلى الأقطاب الكهربائية، افتح المشبك الاتصال مرة أخرى، إعادة تعديل صفيف القطب لتحديد المواقع المناسبة داخل حامل وإعادة المحاولة.
3. حدد نوع القطب و / أو تنسيق متعدد الآبار من واجهة المستخدم للبرنامج.
4. إعداد معلمات القياس. تتوفر خيارات مختلفة.
   ملاحظة: لتحديد تردد التيار المتردد الأكثر حساسية، نشير إلى أدلة الأدب والصك لأنه يعتمد على تخطيط القطب الكهربائي ونوع الخلية قيد الدراسة. عادة، يكون تردد الاستشعار في حدود 4 كيلو هرتز – 50 كيلو هرتز. هنا، نمت خلايا U-373 MG على أقطاب كهربائية تعمل دائرية قطرها 250 ميكرومتر وتم رصدها بتردد AC 12 كيلو هرتز.
   1. في حالة توفر أوضاع الحصول على بيانات التردد الواحد والمتعدد، حدد وضع التردد الواحد لضمان أقصى دقة للوقت. سيتم إجراء القياس على هذا التردد الوحيد. بالنسبة للأجهزة الأكثر انتشارًا ، هناك عدد من الترددات المحددة مسبقًا على طول نافذة التردد المتاحة.
   2. إذا كان عدد الآبار قيد الدراسة منخفضًا أو لم يكن دقة الوقت حرجًا، فحدد تسجيلات تكرار متعددة بدلاً من ذلك. سيتم تسجيل قراءات المعاوقة في عدد محدد من الترددات لكل بئر للتحليل المتعمق في وقت لاحق.
      ملاحظة: انخفاض دقة الوقت مع زيادة عدد الترددات المسجلة لكل بئر وزيادة عدد الآبار. تختلف خيارات تحديد وضع التردد واكتساب البيانات باختلاف نوع الجهاز وإصداره.
5. ابدأ في الحصول على بيانات المقرر الدراسي الزمني.
6. اتبع مقاومة طبقة الخلية (على الأقل 2 ساعة) حتى استقرت المعاوقة. في غضون ذلك، إعداد الحلول الأعنف.
7. عندما وصلت طبقات الخلية إلى مستوى مقاومة مستقر، إما (1) انتقل إلى إضافة الناضر التسلسلي ضمن نفس التجربة أو (2) إنهاء اكتساب البيانات وبدء مجموعة بيانات جديدة لرصد تنشيط المستقبلات الناجمة عن الآضوّاد.

4. إعداد حلول الآفنيست للتجارب في وضع الآفنيست

1. حساب تركيز المحاليل الناضر ة حسب الحاجة لكل خطوة من الدوس التسلسلي وفقا للمعادلة (1). n يتراوح من 1 إلى العدد الإجمالي للإضافات التسلسلية i. x يدل على التركيز والحجم في البئر عند الخطوة n. y يدل على تركيز وحجم "الحل الذي يجب إضافته" في الخطوة n.

ملاحظة: خذ بعين الاعتبار عدد النسخ المتماثلة وحساب الحجم الإجمالي "الحل الذي يجب إضافته" لكل خطوة تركيز. يتم إعطاء نتائج عملية حسابية نموذجية في الجداول 1-4. يتطلب الأمر فكرة عامة حول نطاق التركيز الواضور ليتم دراسته اما المدى فيحدد التركيزات وعدد الأجزاء التي يجب أن تدار خلال الجمع التسلسلي. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي يتم زيادة تركيز الناضر خطوة بخطوة. لذلك ، يجب أن تؤخذ في الاعتبار كمية الناضر الموجودة بالفعل في البئر عند إضافة الجرعة التالية. عندما يكون عدد الجزيئات الناضية الموجودة بالفعل في البئر هو n_x = c_x X X_(مع التركيز الحالي c_x والحجم V_x) وعدد الجزيئات في البئر بعد الإضافة التالية هو n_{x +y}، يتم تحديد عدد الجزيئات التي سيتم إضافتها n_y بواسطة تركيز c_y والحجم V_y من الحل الذي سيتم تطبيقه على البئر (n_y = c_y y_y). After adding a portion of agonist, the new amount of agonist molecules in the well is: c_x+y ∙ V_x+y = c_x ∙ V_x + c_y ∙ V_y. ينطبق هذا الحساب على كل خطوة لاحقة. بسبب الترابط بين تركيز الآفنيست في البئر وكمية الناضر في الأجزاء التي سيتم إضافتها مع كل خطوة ، من المهم تحديد التركيزات النهائية بعد كل خطوة مقدما.

الوضع 1: سوف يزيد حجم في البئر مع كل خطوة كما يتم إضافة السائل باستمرار.
باستخدام هذا الوضع وشكل 8-well، استخدم V_x1 = 200 ميكرولتر وV_{y1 ....} V_yi = 30 ميكرولتر.

طريقة 2: وحدة التخزين في البئر ثابت كما تتم إزالة وحدة التخزين المضافة مع كل خطوة قبل الإضافة اللاحقة.
باستخدام هذا الوضع وشكل 96-well، استخدم V_x1 = 150 ميكرولتر وV_{y1 ....} V_yi = 75 ميكرولتر.

2. طباعة ورقة البيانات مع الحجم الإجمالي لكل تركيز وتعليمات مفصلة لpipetting.
3. إعداد جميع الحلول بالمبلغ المطلوب. جعل جميع الحلول الهامدة في نفس وسط خالية من المصل كما تستخدم لتوازن الخلايا.
   تنبيه: يعتبر هيدروكلوريد الهيستامين خطيرًا بموجب معيار التواصل الخطر OSHA 2012 (29 CFR 1910.1200). الهستامين يسبب تهيج الجلد، تهيج العين خطيرة، قد يسبب حساسية الجلد، حساسية، أعراض الربو أو صعوبات في التنفس إذا استنشاقه، ويمكن أن يسبب تهيج الجهاز التنفسي. يرجى النظر في ورقة بيانات السلامة.
   ملاحظة: جعل الحلول الهاوناً طازجة قدر الإمكان. استقرار ناهضين في الحل قد تختلف اختلافا كبيرا. تخزين الحلول عند 4 درجات مئوية أو أقل حتى استخدامها في التجربة. بالنسبة لبعض الجزيئات يمكن اعتبار إضافات استقرار إضافية ، مثل BSA عند استخدام الجزيئات المستندة إلى الببتيد أو الدهون ، لمنع الامتزاز إلى جدران الآبار والأنابيب.
4. إذا كان تنفيذ التجربة في شكل 96 جيدا، ونقل الحلول إلى لوحة 96-جيدا التقليدية (لا أقطاب كهربائية) واستخدام أنبوب قناة 8-(أو 12-) لنقل السائل السريع إلى صفيف القطب.

5. إعداد حلول نافنيست للتجربة في وضع الخصم

ملاحظة: إعداد حل (ق) خصم مع التركيز ليتم تطبيقها في جميع أنحاء. حجم وتركيز حل الخصم تعتمد على وضع إضافة الناضر (1 أو 2). أمثلة للتجارب في شكل 8-well أو 96-well في طريقة الإضافة 2: (A) تنسيق 8-well (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V x1 = 200 ميكرولتر، V Antagonist = 200 ميكرولتر)؛ (أ) تنسيق 8 آبار (V_x1 = 200 ميكرولتر، V_Antagonist = (ب) تنسيق 96 بئر (V_x1 = 150 ميكرولتر، V_Antagonist = 75 ميكرولتر).

1. حساب تركيز كل حل ناضر اللازمة لكل خطوة من الدوس التسلسلي كما هو موضح في الخطوة 4.1.
2. جعل جميع الحلول الهامدة في نفس وسط خالية من المصل كما تستخدم لتوازن الخلايا وإضافة الخصم في نفس التركيز النهائي كما هو مخطط للآبار المعنية في التجربة.
   ملاحظة: في هذه الحالة يتم إعداد حل مخزون الهيستامين (10 مM) في L-15 المتوسطة. عندما يتم حل ناهضات في المذيبات الأخرى (على سبيل المثال، ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO)، والإيثانول) ينبغي إدراج عنصر تحكم المذيبات لحساب الحمل المتزايد المذيبات مع كل خطوة من الإضافة.

6. تنفيذ بروتوكول الإضافة التسلسلية في وضع الآفنيست

1. ابدأ الحصول على البيانات كما هو موضح في الخطوات 3.1 - 3.5.
2. ما قبل تسخين حلول الناضر قبل استخدامها عن طريق وضعها في الحاضنة حوالي 10 - 15 دقيقة قبل الإضافة.
   ملاحظة: عند استخدام المواد الحرارية لابيل، لا ينبغي أن تبقى الحلول في 37 درجة مئوية لفترة طويلة جدا. إذا كان ما قبل الاحترار لمدة 10 - 15 دقيقة تعتبر حاسمة، وجلب الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل وقت قصير من إضافة في حمام مائي.
3. تشغيل التصيد التسلسلي الأعنف تعتمد على وضع الإضافة المحددة. اتباع الوضع 1 يزيد الحجم الإجمالي في البئر مع كل إضافة للجرعة التالية. في الوضع 2 تتم إزالة نفس الحجم الذي يضاف مع كل خطوة أيضا مرة أخرى فقط قبل إضافة الجرعة العليا القادمة.
   ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لتوازن طبقة الخلية بين جرعتين من الجرعات اللاحقة للاعَد على وقت استجابة الخلايا. وتكشف تجربة أولية في وضع مواز (بئر واحد - تركيز واحد) عن (1) أوقات استجابة الخلايا لتركيزات مختلفة من النهاد و(2) معلمة المنحنى الأكثر حساسية (على سبيل المثال، الحد الأقصى للمعاوقة، والمعاوقة بعد الوقت العاشر).

ج: تنسيق الوضع 1 / 8-well

1. أضف 30 ميكرولتر من المحلول الأول بأقل تركيز للناضون إلى الخلايا التي تم معادلة 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل.
2. دع الخلايا تستجيب وتوازنها للفترة الزمنية المحددة مسبقًا (على سبيل المثال، 15 دقيقة).
3. أضف 30 ميكرولتر من المحلول الثاني مع التركيز العالي التالي.
4. كرر الخطوات 6.3.1-6.3.3 مع الحل الثالث والرابع وهكذا، الناقد.
   ملاحظة: سيؤدي العمل بخطوات تركيز 10 إلى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر في نهاية التجربة، وهو أقل بقليل من الحد الأقصى للحجم المطبق لهذه الآبار البالغ ~ 550 ميكرولتر.

B: وضع 2 / 96-جيد تنسيق

ملاحظة: إيقاف الحصول على البيانات مؤقتًا أثناء كل خطوة مناولة سائلة (إضافة/إزالة) عبر برنامج أداة المعاوقة عند تشغيل التجارب بتنسيق 96-well. قد تتداخل معالجة السوائل الأكثر تفصيلاً مع الحصول على البيانات. استخدام ماصة متعددة القنوات.

1. إيقاف الحصول على البيانات مؤقتًا.
2. أضف 75 ميكرولتر من المحلول الأول بأقل تركيز للناضون إلى الخلايا التي تم توازنها في 150 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل.
3. استئناف الحصول على البيانات.
4. دع الخلايا تستجيب وتوازنها للفترة الزمنية المحددة مسبقًا (على سبيل المثال، 15 دقيقة).
5. حوالي 1 - 2 دقيقة قبل انتهاء وقت المعادلة العادية ، إيقاف القياس وإزالة 75 ميكرولتر من كل بئر.
   ملاحظة: تعتمد النقطة الزمنية التي يجب إزالة الحل عندها على عدد الآبار التي يتم مراقبتها بالتوازي وسرعة الأنابيب. وينبغي ألا يتجاوز الوقت اللازم لإزالة الحلول الوقت الفاصل بين الخطوات اللاحقة.
6. أضف 75 ميكرولتر من المحلول الثاني مع التركيز الأعلى التالي واستأنف القياس.
7. كرر الخطوات 6.3.8-6.3.10 مع الحل الثالث والرابع وهكذا، الناقد.

7. تنفيذ بروتوكول الإضافة التسلسلية في وضع الخصم

1. بدء القياس كما هو موضح في الخطوات 3.1 - 3.5.
2. أثناء توازن طبقات الخلية، قم بإعداد محلول خصم (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر من هيدروكلوريد ديفينهيدرامين 1.5 ميكرومتر في المتوسط L15).
   تنبيه: هيدروكلوريد ديفينهيدرامين له آثار صحية حادة محتملة. ومن الضار إذا ابتلع أو استنشاقه، قد يسبب تهيج العين والجلد. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي. يرجى النظر في ورقة بيانات السلامة.
3. قبل تسخين الخصم والحلول الناضر عن طريق وضعها في الحاضنة حوالي 10 - 15 دقيقة قبل إضافة إلى ثقافات الخلية (راجع 6.2). إذا تم تضمين الآبار الخالية من الخصوم في النسخة المجانية أيضًا ، أيضًا وسيطًا خاليًا من المصل مسبقًا.
4. إضافة حل الخصم إلى الآبار المعينة. اسمحوا الخلايا equilibrate مع خصم لمدة 15 - 20 دقيقة. إذا تم تضمين الآبار الخالية من الخصوم، فأضف نفس الحجم من الوسائط الخالية من المصل إلى هذه الآبار.
5. وفقا لخصم إضافة في وضع 2، إزالة الحل من الآبار
   (أ) تنسيق 8 آبار (200 ميكرولتر)
   (ب) شكل 96 بئراً (75 ميكرولتر)
6. تشغيل تسلسل الإضافة الآضوية كما هو موضح في الخطوة 6.3.

8 - تصدير البيانات وتحليلها

1. تصدير البيانات باستخدام برنامج أداة المعاوقة من أجل تحويل جميع البيانات المسجلة من الملكية إلى أشكال بيانات مشتركة (على سبيل المثال، CSV). تسمح هذه الخطوة بإعادة تنظيم البيانات وعرضها التقديمي مع حزم البرامج الأخرى.
2. تحميل البيانات بتنسيق CSV إلى برنامج تحليل البيانات العلمية.
3. تطبيع قيم المعاوقة عن طريق طرح مقاومة نقطة البيانات الأخيرة قبل الإضافة الأولى للحل الناضر وعن طريق تعيين وقت الإضافة إلى t = 0. رسم مسار الوقت من المقاومة تطبيع.
4. رسم دورات الوقت الفردية وتحديد ماكسيما في المعاوقة بعد كل خطوة إضافة. إنشاء ورقة بيانات بهذه القيم.
5. رسم قيم الحد الأقصى (أو الحد الأدنى، إن وجد) التغييرات المعاوقة كدالة تركيز المؤن. ويمكن القيام بذلك للآبار الفردية أو للمتوسطات (متوسط ± SD).
6. استخدم روتين تركيب البيانات لتحديد التركيزات الفعالة نصف القصوى (EC₅₀₎والاستجابة القصوى (E_Max)باستخدام النموذج اللوجستي للمعلمة الأربعة (المعادلة 2):

ملاحظة: ج يشير إلى تركيز الأعنف، A₁ هو الحد الأدنى وA₂ هو الحد الأقصى لمنحنى الجرعة والاستجابة السينية(A₂ = E_Max). EC₅₀ هو التركيز عند نقطة انقلاب المنحنى، وn يتوافق مع ميل التل.

Results

يظهر مخطط نموذجي لإعداد مختلف الحلول الناضعة لتجربة باستخدام صفائف أقطاب كهربائية 8-well مع الهستامين كما في الجداول 1-4. الجدول 1 والجدول 2 يقدمان أحجاماً وتركيزات لتجربة باستخدام طريقة الإضافة 1 (انظر الشكل 1)،في حين يقدم الجدول 3 والجدول 4 الأحجام والتركيزات الحالية للتجربة التي تتبع طريقة الإضافة 2 (راجع الشكل 1). تم حساب البيانات باستخدام ا...

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياسات المعاوقة الخالية من الملصقات لتحديد علاقة الجرعة والاستجابة لتنشيط GPCR الناجم عن الالوطنية في غياب أو وجود مضادات محددة لنفس المستقبلات. وقد تم تقديم إثبات مفهوم هذه الطريقة في منشور صدر مؤخرا¹². على حد علمنا هو أول دراسة تصف إنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة من تنشيط GPCR بوساطة العناق باستخدام طبقة خلية واحدة في المختبر. يتطلب هذا النهج حتما استخدام نهج مراقبة الخلية الخالية من التسمية ولن ينطبق على مقالات نقطة النهاية.

وقد ثبت البروتو...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ب ü غرفة عد ركير	Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen ، ألمانيا)	640210
قوارير زراعة الخلايا 25 سم 2< / sup>	Greiner bio-one (Frickenhausen ، ألمانيا)	690175
حاضنة الخلية (Heraeus Function Line BB15) Thermo	Scientific (دارمشتات ، ألمانيا)	\
أجهزة الطرد المركزي (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (دارمشتات ، ألمانيا)	\
ديفينهيدرامين هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش (تاوفكيرشن ، ألمانيا)	D3630
الحد الأدنى من الوسط الأساسي مع 4.5 جم / لتر D-Glucose و 2.2 جم / لتر NaHCO3< / sub>	Sigma Aldrich (Taufkirchen ، ألمانيا)	D5671
أداة مقاومة (ECIS Z & theta ؛)	Applied BioPhysics Inc. (تروي ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)	\
مصفوفات أقطاب كهربائية 8 آبار (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (تروي ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)	\	قاعدة PET مع 0.049 مم < sup > 2 < / sup> قطب كهربائي يعمل و ~ 50 مم < sup > 2 < / sup>
مصفوفات أقطاب كهربائية 96 بئر (96W1E + PET) شركة	BioPhysics التطبيقية Inc. (تروي ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)	\	قاعدة PET مع قطبين كهربائيين (ذهبي) مع 0.256 مم < sup> 2< / sup> إجمالي مساحة القطب
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)	Biochrom (برلين ، ألمانيا)	S0615
هيستامين ثنائي هيدروكلوريد	كارل روث (كارلسروه ، ألمانيا)	4017.1
غطاء التدفق الصفحي (Herasafe ، KS 12)	Thermo Scientific (دارمشتات ، ألمانيا)	51022515	خزانة أمان من الفئة الثانية
Leibovitz 'L-15 medium	Thermo Scientific (دارمشتات ، ألمانيا)	21083-027
L-glutamine	Sigma Aldrich (Taufkirchen ، ألمانيا)	G7513
ماصة دقيقة كبيرة (100 - 1000 & ميكرو ؛ L)	براندت (فيرتهايم ، ألمانيا)	704780
ماصة دقيقة كبيرة (20 - 200 وميكرو ؛ L)	براندت (فيرتهايم ، ألمانيا)	704778
مجهر (تباين الطور ، نيكون ديافوت) نيكون	(Dü سلدورف ، ألمانيا)
البنسلين / الستربتومايسين	سيجما ألدريتش (تاوفكيرشن ، ألمانيا)	P0781
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	سيجما ألدريتش (تاوفكيرشن ، ألمانيا)	D8537
ماصة ، مصلية	Greiner bio-one (Frickenhausen ، ألمانيا)	607 180
ماصة (أكو جيت برو)	براندت (فيرتهايم ، ألمانيا)	26300
Trypsin	Sigma Aldrich (Taufkirchen ، ألمانيا)	T4174	في PBS مع أنبوب EDTA 1 ملي مولار
، 15 مل	Greiner bio-one (Frickenhausen ، ألمانيا)	188 271
أنبوب ، 50 مل	Greiner bio-one (Frickenhausen ، ألمانيا)	210 261
U-373 MG خلايا	ATCC (روكفيل ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)	ATCC HTB-17
(TW21)	Julabo (Seelbach، ألمانيا)	\