Method Article

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[برتيلايشن] تعديل مهمة علي طرفيه غشاء يربط بروتينات. يمكن التلاعب بخلايا الحشرات لإنتاج KRAS4b بكميات من البروتينات والبروتينات والدهون البروتينية والتي تمكن من القياسات البيوفيزيائية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين قبل الزواج هو تعديل المفتاح الذي هو المسؤول عن استهداف البروتينات لاغشيه داخل الخلايا. KRAS4b, الذي تحور في 22% من السرطانات البشرية, يتم معالجتها من قبل farnesylation و كربوكسيميثييون بسبب وجود ' CAAX ' عزر مربع في C-المحطة. تم استخدام نظام الفيروسات التي تمت هندستها للتعبير عن KRAS4b في خلايا الحشرات وتم وصفه سابقا. هنا ، ونحن وصف مفصله وعمليه تنقيه وتوصيف البيوكيميائية للبروتين. وعلي وجه التحديد ، استخدمت التقارب واللوني تبادل الأيونات لتنقيه البروتين إلى التجانس. واستخدم قياس الطيف الكتلي السليم والأصلي للتحقق من صحة التعديل الصحيح لKRAS4b وللتحقق من ربط النيوكليوتيد. وأخيرا ، تم قياس جمعيه غشاء من farnesylated و KRAS4b الكربوكسيميثيد إلى الجسيمات الشحمية باستخدام البلازما الطيفية الرنين السطحي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديلات بعد الانتقالية تلعب دورا رئيسيا في تحديد النشاط الوظيفي للبروتينات. التعديلات مثل فوسفولات و glycosylation راسخة جيدا. ومع ذلك ، فان التعديلات الدهنية اقل تميزا. ويقدر ان ما يصل إلى 0.5 ٪ من جميع البروتينات الخلوية قد يكون قبل الزواج1. [برتيلايشن] النقل من [15-كربون] [فرنيسيل] أو [20-كربون] جيرانيلجيرانيل دهن سلسله إلى [اكتور] بروتين يحتوي ال [كاكس] عزر2. وقد تورط البروتينات قبل الزواج في تطور العديد من الامراض البشرية بما في ذلك الشيخوخة المبكرة3, الزهايمر4, العجز القلبي5, تنكس المشيميه6, والسرطان7. الصغيرة GTPases ، HRAS ، NRAS ، و KRAS1، الصفيحات النووية ، والاعمال الروتينية cenp-E و F هي البروتينات farnesylated تحت الشرط القاعدي. GTPases الصغيرة الأخرى ، وهي الروا ، RhoC ، Rac1 ، cdc-42 ، و RRAS geranylgeranylated8، في حين يمكن ان يكون الموقد farnesylated أو geranylgeranylated9.

الصغيرة GTPase KRAS4b يعمل كمفتاح الجزيئية ، ونقل أساسا عامل النمو خارج الخلية يشير إلى مسارات محول الاشاره داخل الخلايا التي تحفز نمو الخلايا والانتشار ، عن طريق التفاعلات بروتين البروتين متعددة. هناك نوعان من الجوانب الرئيسية لKRAS4b الكيمياء الحيوية التي هي ضرورية لنشاطها. أولا ، دورات البروتين بين الناتج المحلي الإجمالي غير النشط والدولة النشطة GTP ملزمه حيث يتفاعل بنشاط مع المستجيبين. الثانية ، وهو C-المحطة الطرفية بولي يسين المنطقة وسيستين فارنيسلاتيد وكربوكسيميثياتيد مباشره البروتين إلى غشاء البلازما ، وتمكين التوظيف وتفعيل المستجيبين المصب. متحولة KRAS4b هو سائق اونكوغينيك في البنكرياس, القولون والمستقيم, وسرطان الرئة10, وعلي هذا النحو, التدخل العلاجي سيكون لها فائده سريريه ضخمه. إنتاج البروتين المؤتلف المعدل بشكل أصلي والذي هو farnesylated و كربوكسيميثليتيد من شانه تمكين الفحص البيوكيميائية باستخدام KRAS4b في تركيبه مع البدائل غشاء مثل الدهنية أو الدهون نانوديسك11،12.

فرينسريل ترانسفيتاز (FNT) يحفز أضافه بيروفوسفات فارنيسيل إلى C-الطرفية السيستين في عزر CAAX في KRAS4b. بعد الزواج ، يتم الاتجار بالبروتين إلى الشبكية الاندوبلازميه (ER) حيث يلتصق انزيم راس التحويل (RCE1) بالبقايا الثلاثة للمحطة C. الخطوة الاخيره في معالجه هو ميثيل من الجديدة ج-الطرفية farnesylcysteine بقايا من البروتين الغشاء ER ، ايزوريزيلسيستين ميثيل ترانسفيرتاز (ICMT). التعبير عن KRAS4b المؤتلف في e. القولونية النتائج في إنتاج بروتين غير معدله. وكانت المحاولات السابقة لإنتاج الKRAS4b المجهزة محدوده بسبب عدم كفاية الغلة لتجارب الفحص الهيكلي أو الدوائي أو فشلت في تلخيص البروتين الناضج الأصلي الكامل الطول13,14. البروتوكول المعروض هنا يستخدم نظام التعبير خليه الحشرات المستندة إلى الفيروسات التي تعتمد علي البكتيريا وطريقه تنقيه التي تولد تنقيه عاليه ، ومعالجتها بالبالكامل KRAS4b في غله من 5 ملغ/لتر من ثقافة الخلية.

وصف البروتين الدقيق ضروري للتحقق من جوده البروتينات المؤتلف قبل الشروع في البيولوجيا الانشائيه أو دراسات فحص المخدرات. اثنين من المعلمات الرئيسية للمعالجة بالبالكامل KRAS4b هي التحقق من التعديل الصحيح قبل الزواج وتوافر فارنيسلاتيد و الكربوكسيميثيلتيد C-المحطة (FMe) للتفاعل مع بدائل الغشاء أو الدهون. وقد استخدم مقياس الطيف الكتلي للتاين بالكهرباء (ESI-MS) لKRAS4b لقياس الوزن الجزيئي والتاكد من وجود التعديلات التي أدخلت علي فارنيسيل وكربوكسيل الميثيل. واستخدم قياس الطيف الكتلي الأصلي ، حيث يتم رش العينات بالمذيبات غير المستخدمة ، لإثبات ان KRAS4b كانت ملزمه أيضا بالعامل المساعد للناتج المحلي الإجمالي. وأخيرا ، تم استخدام الطيفية صدي البلازما السطحية لقياس الربط المباشر لل KRAS4b مع الدهنيات المعبئة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقيه البروتين

  1. اعداد المخازن المؤقتة A-H ، كما هو الراي في الجدول 1.
حل المخزن المؤقتعامل التخزين المؤقت (كل 20 مم) pH كلوريد الصوديوم (مم)ايميدازول (مم)MgCl2 تعبيراتع
عليحبيس7.3300-51
بحبيس7.33003551
جحبيس7.330050051
دمس6.0200-51
همس6.0--51
ومس6.0100-51
زمس6.01000-51
ححبيس7.3300-11
  1. اعداد مواد التنقية (انظر جدول المواد): الانزيم البروتيني المثبط كوكتيل دون أدتا أو غيرها من مزيلات المعدن. عمود اللوني التقارب المعادن (IMAC) التي تم تعبئتها; عمود اللوني تبادل الموجبة (CEX); 0.45 ميكرون فلتر حقنه; 2 م ايميدازول (pH = 7.5) ؛ اولتراسينتريفوجي قادره علي 100,000 x g; عاليه السرعة الطرد المركزي بنتوب قادره علي 4,000 x g؛ وحدات تصفيه الطرد المركزي (10 كده NMWL) ؛ مقياس الطيف قادره علي القراءة في 280 نانومتر ؛ His6-التبغ حفر الفيروس (TEV) البروتيني. واللوني الاجهزه قادره علي خلط اثنين من الحلول العازلة ، وتطبيق حلول للاعمده ، وخلق الانحدارات التدرج من العمود ، وجمع الكسور من الاعمده.
  2. ذوبان الخلايا من ~ 2 L من ثقافة خليه الحشرات المخزنة سابقا في-80 درجه مئوية أو استخدام الخلايا الطازجة التي تم حصادها. انظر جيليت et al. 201915 للحصول علي تفاصيل حول خط خليه الحشرات الاندونيسيه وبروتوكولات التعبير. بعناية أعاده تعليق الخلايا مع 200 mL من المخزن المؤقت A مع أضافه 1:200 v/v الانزيم البروتيني المثبط دون إدخال الهواء أو خلق رغوة.
    ملاحظه: الخطوة 1.3 والخطوات اللاحقة (باستثناء كما لوحظ) يجب ان يتم تنفيذها في درجه حرارة الغرفة (~ 22 درجه مئوية). من المهم ان تكون العينة متجانسة للسماح بالتحلل الكامل في الخطوة التالية.
  3. Lyse بيليه الخلية في ميكروفلوديتزر في 7,000 psi لتمريرين أو في نظام تحلل مكافئ. ولم تستكشف الأساليب البديلة لتحلل.
  4. توضيح لست] خليه الحشرات هو إشكاليه بسبب وجود المركبات التي تسد الفلاتر. وهكذا, نبذ حلول (100,000 x g ل 30 دقيقه في 4 °c) مهم جدا. وينبغي تجنب بقايا الدهون البيضاء علي سطح سوبرناتانت ويمكن ازالتها أو تخفيضها باستخدام مسحات القطن. تصفيه ماده طافي المستاجره من خلال فلتر PES 0.45 μm. استخدام العينة الموضحة فورا أو تخزينها في-80 درجه مئوية.
    ملاحظه: كتل بقايا مرشحات بسرعة والعديد من الفلاتر قد تكون ضرورية. سيؤدي الفشل في تقليل كميه هذه المواد إلى ارتفاع ضغط العمود الخلفي في الخطوات اللاحقة.
  5. تحديد حجم محلله الموضحة وضبط العينة إلى 35 مم ايميدازول باضافه 2 M ايميدازول الأسهم. تحميل العينة في 3 مل/دقيقه علي 20 مل ايماك العمود (HisPrep FF 16/10 عمود) معايرتها في المخزن المؤقت B لثلاثه مجلدات العمود (CVs).
  6. علي الرغم من ان البروتين المستهدف عاده ما يمتص الكمية إلى العمود ، فمن الأفضل لجمع تدفق العمود للتحليل اللاحق. غسل العمود حتى Abs280 يصل إلى خط أساس ثابت (< 100 وحدات الامتصاص مللي [ماو]) مع العازلة B في 3 مل/دقيقه ل 20 مل (1 cv) ثم ل ~ 3 cv في 4 مل/دقيقه لما تبقي من خطوه الغسيل. عاده ، 60-80 مل من المخزن المؤقت B مطلوب لتحقيق امتصاص خط الأساس.
  7. Elute البروتين مع 400 mL (20 CV) التدرج من المخزن المؤقت B إلى C العازلة في حين جمع الكسور مل 8. وعاده ما يكون البروتين المستهدف في النصف الأول من التدرج (الشكل 1ا ؛ ولاتظهر جميع الكسور اللاحقة).
  8. تحليل كسور البروتين باستخدام صفحه SDS/كوماسي تلطيخ. تجمع الكسور الذروة والحوار تجمع بين عشيه وضحيها ضد 2 لتر من المخزن المؤقت D في 4 ° c.
    ملاحظه: انخفاض درجه الحموضة أمر بالغ الاهميه لضمان ربط البروتين في الخطوة التالية. ومع ذلك ، يحدث تغيير الرقم الهيدروجيني اثناء هذا الغسيل الكلوي ببطء ، وهذه خطوه مريحه للحضانة بين عشيه وضحيها. لم يتم التحقيق في استراتيجيات تبادل العازلة البديلة (علي سبيل المثال ، تركيز العازلة اعلي لتسريع تغيير درجه الحموضة). وسوف يبدا البروتين ليعجل ببطء مع مرور الوقت في انخفاض درجه الحموضة وانخفاض تركيزات الملح وكميه صغيره من هطول الامطار أمر طبيعي خلال هذه الخطوة. وبسبب هذا ، فاننا نتجنب تبادل العازلة إلى 100 mM NaCl اللازمة للربط إلى العمود التالي اثناء غسيل الكلي. بدلا من ذلك ، يتم استخدام تركيز NaCl من 200 mM لغسيل الكلي ويتم تخفيف البروتين إلى 100 مم (انظر أدناه) مباشره قبل التطبيق إلى العمود. لم يتم التحقيق إذا كان هذا هطول الامطار محدده ل KRAS4b ، ولكن تم تاكيد البروتين الذي لا يعجل كما KRAS4b-FMe. لهذا السبب ، نقترح استخدام تركيز كلوريد الصوديوم اعلي في العازلة غسيل الكلي لأي بروتين من الفائدة كاجراء وقائي حتى استقرار البروتين المستهدف في العازلة ملزمه يمكن تحديدها.
  9. أزاله العينة من غسيل الكلي والطرد المركزي في 4,000 x g ل 10 دقيقه لأزاله اي راسب. العينة النهائية التي تم توضيحها في هذه المرحلة لا تزال غالبا ضبابية ولكن يمكن تطبيقها دون المزيد من المعالجة علي عمود CEX اللاحق.
  10. اعداد 20 mL الموجبة العمود تبادل (انظر جدول المواد) عن طريق غسل مع ثلاثه السيرة الذاتية من G العازلة ، ثم مع ثلاثه السيرة الذاتية من F العازلة.
    ملاحظه: في حين اننا لم تقييم بدقه الراتنجات الأخرى ، وقد وجدت العديد من الزملاء القرار الفقراء مع راتنجات أخرى غير SP سفبرز الراتنج عاليه الأداء.
  11. تمييع 20 مل من عينه ديزيد إلى تركيز كلوريد الصوديوم النهائي من 100 مم باضافه 20 مل من العازلة E وتطبيق العينة المخففة إلى العمود تبادل الموجبة.
  12. الاستمرار في تحميل العمود عن طريق أضافه عينات المخفف الطازجة أعدت كما هو موضح أعلاه إلى أنبوب التحميل كما التخفيف السابق يقترب من نهاية الحمل.
    ملاحظه: تمييع العينة بأكملها في ان واحد إلى 100 mM كلوريد الصوديوم وقد ادي إلى فقدان كبير للبروتين المستهدف بسبب هطول الامطار.
  13. اغسل العمود إلى الأساس Abs280 مع العازلة F. وهذا يتطلب عاده 3 CV. يتم التملص من البروتين من العمود خلال 400 mL (20 CV) التدرج من F العازلة إلى 65 ٪ العازلة G ، التي جمعت في الكسور 6 مل (الشكل 1ب).
  14. استمر في غسل العمود للحصول علي 1.5 اضافيه CV (65% المخزن المؤقت G) بمجرد اكتمال التدرج. اختيار الكسور الايجابيه استنادا إلى كل من SDS-صفحه/كوماسي الأزرق وصمه عار التحليل والتفتيش علي اثر الاشعه فوق البنفسجية من الكروماتوجرام.
    ملاحظه: تتبع الاشعه فوق البنفسجية عاده يحتوي علي خمس قمم. بدءا من تركيزات الملح المنخفضة ، عاده ما تكون الذروة الاوليه غير المجهزة و/أو البروتين البروتيني. القمم الثانية والثالثة هي مزيج من شكلين من البروتين المعالج: الذروة الثانية هي في المقام الأول المتوسطة farnesylated (FARN) ، في حين ان الثالث هو في المقام الأول البروتين FMe معالجتها بالبالكامل من الفائدة. قمم أربعه وخمسه تمثل His6-MBP-KRAS4b البروتينات الانصهار (كل من البروتين في هذا الشكل في هذه المرحلة ، كما لم يحدث الهضم TEV). هذا ليس [ن-اسيتيل] في ال [ن-تيرمينوس] و[فرنيستد] (قمة أربعه) و [فرنيستد] و [كربوكسيمثتد] (قمة خمسه) في ال [ك-تيرمينوس]. كما ذروه اثنين والذروة أربعه سوف تنتج البروتينات متطابقة بعد أزاله العلامة (اي ، KRAS4b) ويمكن تجميع هذه في هذه المرحلة إذا رغبت في ذلك. المثل ، يمكن الجمع بين الذروة ثلاثه والذروة خمسه لإنتاج الكثير واحد من KRAS4b (الشكل 1ب، الشكل 2). ومع ذلك ، فمن المستحسن ان يتم هذا تجميع فقط عندما تم تاكيد طبيعة البروتين في القمم منفصلة.
  15. هضم البروتين المجمعة في الخطوة 1.15 مع His6 البروتيني (~ 200 ميكروغرام من البروتياز/مل من عينه.
    ملاحظه: نحن جعل His6 البروتيني باستخدام البلازميد والبروتوكولات المتاحة من addgene (https://www.addgene.org/92414). ديليف الهضم TEV ضد العازلة A (10 كده MWCO أنابيب غسيل الكلي مع الحد الأدنى من 40 mL من العازلة لكل مل من عينه) ل 2 ح في درجه حرارة الغرفة ومن ثم بين عشيه وضحيها في 4 ° c.
  16. بعد الهضم وغسيل الكلي ، وتحميل البروتين مباشره إلى 20 مل ايماك العمود معايرتها مع العازلة A في 3 مل/دقيقه.
    ملاحظه: جمع الكسور 7 مل خلال هذا الفصل اللوني بأكمله ، لان البروتين المستهدف له تقارب منخفض للعمود ولكن قد لا يكون منضما تماما إلى الراتنج. اغسل العمود في 3 مل/دقيقه مع المخزن المؤقت A لما مجموعه 3 سير ذاتية أو حتى يتم الوصول إلى الامتصاص الأساسي.
  17. يتم التملص من البروتين المستهدف مع التدرج السيرة الذاتية 5 من C العازلة من 0 ٪-10 ٪ ، وجمع الكسور مل 7. كاجراء احترازي ، يمكن التملص من البروتينات الاضافيه المنضمة مع 100% المخزن المؤقت c. ويتم تحديد الكسور الايجابيه بعد تحليلها من قبل صحيفة SDS (الشكل 1ج). عاده ، البروتين الهدف التملص من تركيز ايميدازول منخفضه (اي ، في 0 ٪-10 ٪ العازلة التدرج C) ولكن في بعض الأحيان التملص في التدفق من خلال أو غسل العمود.
  18. الحوار النهائي تجمع ضد العازلة h. تحديد تركيز البروتين عن طريق القياس الطيفي في 280 نانومتر.
    ملاحظه: تاكد من حساب وجود النيوكليوتيد عند تحديد معامل الانقراض لاستخدامها لهذا الحساب.
  19. البروتين يمكن ان تتركز إلى ~ 2 – 5 مغ/مل باستخدام وحده تصفيه الطرد المركزي (10 ك NMWL) دون فقدان البروتين كبيره. تصفيه مع فلتر حقنه 0.22 μM. قياس الامتصاص الحل في280 لحساب تركيز البروتين النهائي (الشكل 1د). المفاجئة تجميد قسامات في النيتروجين السائل وتخزين عينات المجمدة في-80 درجه مئوية.
    ملاحظه: البروتين المنقي مرتبط بالناتج المحلي الإجمالي. KRAS4b يمكن تبادلها في GppNHp باستخدام البروتوكولات المنشورة سابقا16.

2. اعداد العينات للتحليل الشامل السليم وتحليل الكتلة الاصليه

  1. اعداد العينات للتحليل الشامل السليم
    1. ذوبان عينه البروتين علي الجليد قبل التحليل. للتحليل الشامل سليمه ، تمييع البروتين إلى 0.1 ملغ/مل في بيكربونات الأمونيوم 20 ملم (pH = ~ 8.4). لتحليل الكتلة الاصليه ، تمييع البروتين إلى تركيز 0.1 ملغ/مل في 50 mM خلات الأمونيوم (pH = ~ 7.5). دوامه كل عينه ل 5 – 10 ثانيه ، ثم أجهزه الطرد المركزي في 12,500 x g ل 1 دقيقه لبيليه اي ماده صلبه في الحل. أزاله 10-20 μl من كل ماده طافي ونقل إلى قارورة الزجاج التلقائي. كاب كل قارورة باحكام لمنع التلوث أو التبخر.
      ملاحظه: اما بالنسبة للتحليل الشامل السليم أو التحليل الجماعي الأصلي ، فقد يتم تحليه العينة قبل التحليل باستخدام فلتر غشاء السليلوز من 10 ده.
  2. اعداد الطيف الكتلي الموسع (EMR) الطيفي الشامل للتحليل الشامل
    ملاحظه: قبل تشغيل اي تحليل علي مطياف الكتلة ، تاكد من انه قد تم معايره مؤخرا. أيضا ، دائما ارتداء القفازات وغيرها من معدات الحماية الشخصية حسب الضرورة لتجنب اي مواد كيميائية ضاره وتجنب تلويث العينات والمذيبات. يتم المعايرة باستخدام محلول المعايرة التي تم الحصول عليها تجاريا و 2 ملغ/مل محلول يوديد السيزيوم التي أعدت في المنزل.
    1. فتح برنامج التحليل وتحميل ملف أسلوب الصك المناسب. للتحليل الشامل سليمه من البروتينات KRAS4b ، المعلمات بداية مناسبه هي علي النحو التالي: الوضع الإيجابي للكشف ؛ ثلاثه ميكروب# الاشعه ، والقرار = 70,000 ؛ الهدف = 3e6؛ الحد الأقصى لوقت التكامل = 200 مللي ثانيه. ونطاق المسح الضوئي = 70 – 1800 نسبه الكتلة إلى الشحن (m/z). بالنسبة للتحليل الجماعي الأصلي للبروتينات KRAS4b ، فان معلمات البداية المناسبة هي كما يلي: الوضع الإيجابي للكشف ؛ 10 ميكروب# الاشعه ، والقرار = 17,500 ؛ التفكك الناجم عن الاصطدام المصدر (CID) = 20 eV ؛ الهدف = 3e6؛ الطاقة الاصطدام (CE) = 20 ؛ الحد الأقصى لوقت التكامل = 200 مللي ثانيه. ونطاق المسح الضوئي = 500 – 10000 م/ض.
  3. اعداد المذيبات الكروماتوغرافي والعمود
    1. اعداد المذيبات اللازمة للتحليل الشامل سليمه. المذيب A هو الماء مع 0.1 ٪ حمض الفورميك. المذيب B هو 80 ٪ اسيتلونيتريل و 0.1 ٪ حمض الفورميك في الماء.
    2. اعداد المذيبات اللازمة للتحليل الشامل الأصلي. المذيب A هو 0.1 M خلات الأمونيوم في الماء والمذيبات B هو الماء.
    3. بعد ان يتم اعداد المذيبات المناسبة ، تطهير النظام بحيث يتم تعبئة الأنابيب مع المذيبات المناسبة ويتم أزاله جميع فقاعات الهواء من الخطوط.
    4. قم بتثبيت العمود المناسب (عمود المرحلة العكسية للتحليل الشامل السليم وعمود استبعاد الحجم للتحليل الجماعي الأصلي). للتحليل الشامل سليمه ، ومعدل التدفق هو 0.5 mL/min ، ودرجه حرارة العمود (باستخدام سخان العمود) هو 50 درجه مئوية. تتوازن العمود لمده 15 – 20 دقيقه. لتحليل الكتلة الاصليه ، ومعدل التدفق هو 0.25 mL/min.
      ملاحظه: دائما مراقبه العمود الضغط الخلفي للتاكد من انه لا يرتفع فوق الحد الأعلى ، والتي يمكن ان تشير إلى خط مسدود أو ان مصفوفة العمود هو اختراق. يستعاض عن العمود إذا لزم الأمر.
  4. تحليل العينات
    1. ضع عينه البروتين المحضرة في قارورة الزجاج التلقائي في رف القارورة المناسب في أنظمه LC الاوتوماتيكيه. إنشاء قائمه (نماذج) في برنامج البرنامج مع طريقه الصك المناسبة للتحليل المطلوب. بمجرد اكتمال قائمه العينات ، انقر فوق الزر تشغيل لبدء التحليل.
    2. حقن 1-2 μL من عينه لكل تحليل ، مع المياه فارغه قبل وبعد كل عينه ، لضمان عدم وجود ترحيل.
      ملاحظه: التحليل الشامل سليمه مختلفه جدا من التحليل الشامل الأصلي ويتطلب إعدادات أسلوب أداه مختلفه جدا. وهذا لأنه مع التحليل الشامل سليمه ، والبروتين هو "استرخاء" في وجود المذيبات العضوية ، التالي قادر علي قبول المزيد من التهم. فمن الأسهل لتفكيك وحل توزيع النظائر من الدول تهمه. التحليل الجماعي الأصلي يوفر توزيع الشحنة الضيقة من أيونات البروتين ، واستنادا إلى البروتين ، ويتطلب مختلف الجهد وإعدادات الطاقة الاصطدام.
  5. تحليل البيانات وتفكيك البروتين
    1. تصدير طيف العينة إلى البرامج حيث يمكن ان تتحول إلى الطيف دي الملتوية التي ستعرض كتله سليمه (أو كتله الأصلي) من البروتين. سيكون للكتلة السليمة توزيع ذروه النظائر بسبب وفره القمم الطيفية المشحونة. وعاده ما يكون للكتلة الاصليه عدد قليل جدا من القمم نظرا لقله وفره القمم الطيفية المشحونة (الشكل 3د).
    2. قم بتوسيع نطاق نسبه الكتلة إلى الشحن (m/z) من الذروة d للتاكد من ان الكتلة المقاسه متوافقة مع الكتلة المتوقعة. في بعض الأحيان ، بسبب أضافه الرسوم إلى البروتين ، قد يكون هناك اختلاف طفيف بين الوزن الجزيئي المتوقع (MW) و MW الملحوظة. أيضا ، كما هو الكثير من تحليلات الطيف الكتلي ، يمكن ان تسهم القناات مثل الصوديوم في ظهور قمم اضافيه في البيانات ، حتى مع العينات التي تم تحليه بعناية. ويلاحظ أحيانا انخفاض القمم الوفيرة مع m/z التي هي اقل مما كان متوقعا. ويرجع ذلك علي الأرجح إلى فقدان محايد ، وهو فقدان مجموعه وظيفية بسبب عمليه التاين.
      ملاحظه: كما هو متوقع ، ستكون هناك اختلافات بين الكتلة السليمة وقمم الكتلة الاصليه. ستظهر الشاشة الشاملة السليمة ميغاواط البروتين المتوقع. ولن يكون لديها ميغاواط إضافي من النوكليوتيد المرفقة أو غيرها من التعديلات. ومع ذلك ، فان ذروه الكتلة الاصليه تظهر البروتين مع اي النيوكليوتيد المضافة.

3. التحقق من الصحة من KRAS4b-FMe ملزمه لليبومات

  1. غشاء الشحمية اعداد
    1. اعداد العازلة التي تتكون من 20 مم HEPES (pH = 7.3) ، 150 mM NaCl ، و 1 مم TCEP.
    2. وتشمل مواد التحضير الشحمية 25 مم 1-بالميتويل-اوليريل-غليسيرو-3-فوسفولكولين (POPC) و 10 مم 1-بالميتويل-اوليريل-غليرو-3-فوسفس-ل-سيرين (POPS) الأسهم في كلوروفورم ؛ مجموعه الطارد الدهون مع حامل وكتله التدفئة. غاز الارجون والنيتروجين السائل. حمام الموجات فوق الصوتية. زجاج الموضوع المسمار قوارير مع بطانات رغوة PTFE ؛ وقارئ لوحه قادره علي الكشف عن تشتت الضوء الديناميكي.
    3. ذوبان الدهون الأسهم في كلوروفورم في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه. اعداد 1 مل من 5 مم 70:30 POPC: الدهنية الملوثات العضوية الثابتة عن طريق نقل 106 μL من 25 مم POPC (المخزون) و 118 μL من 10 مم الملوثات العضوية الثابتة (المخزون) في قارورة زجاجيه.
      ملاحظه: لا الدهون قسامه مع غيض من البلاستيك ، لان كلوروفورم يمكن ان تذوب بعض النصائح البلاستيكية.
    4. الدهون الجافة تحت تيار مستمر من غاز الارجون. ببطء تدوير قارورة الزجاج عند تطبيق غاز الارجون لتشكيل طبقه رقيقه من الفيلم الجاف.
    5. وضع عينات تحت المجفف بالتجميد بين عشيه وضحيها لأزاله كلوروفورم الزائدة.
    6. أعاده تشكيل الدهون عن طريق أضافه 1 مل من العازلة إلى الفيلم المجفف ودوامه الخلائط لمده 5 دقائق. هيدرات مخاليط الدهون عن طريق هزاز ل 1 ح في 25 درجه مئوية.
      ملاحظه: سوف تكون العينة عكر جدا بناء علي أضافه العازلة إلى طبقه الفيلم المجفف من الدهون.
    7. أداء خمس دورات تجميد/ذوبان بالتناوب وضع قنينة عينه بين الماء المثلج (4 درجه مئوية أو اقل) وحمام الماء الدافئ (25 درجه مئوية أو اعلي).
    8. ضع قنينة العينة في حمام الموجات فوق الصوتية والعينة لحوالي 0.5 h أو حتى تصبح العينة شبه شفاف.
    9. البثق العينات باستخدام مجموعه الطارد الدهون. تجميع مجموعه البثق كما هو مبين في تعليمات الشركة المصنعة. بثق العينات باستخدام ورقه فلتر 0.1 μm. تحميل العينات في حقنه زجاجيه واحده ونعلق عليها واحده من نهاية جهاز البثق. أضافه حقنه فارغه علي الطرف الآخر من جهاز البثق. دفع ذهابا وإيابا 10-20x حتى العينات الخاصة بك تصبح شفافة تماما.
    10. تدور العينات النهائية لمده 30 دقيقه في 20,000 x g لأزاله اي مجاميع كبيره.
    11. استخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لتحديد حجم وتجانس الشحمية (اختياري). مكان 30 μL من الجسيمات الشحمية في 384 القارئ لوحه جيدا. تدور لوحه في 1,000 x g لمده 30 دقيقه وضع لوحه في قارئ لوحه وجمع 10 قياسات تشتت الضوء.
  2. توصيف KRAS4b الربط إلى الجسيمات الشحمية عن طريق صدي البلازما السطحية (موارد الاستخدام الخاصة)
    1. تجميع المواد المطلوبة: أداه الموارد الخاصة ؛ رقاقه الاستشعار L1 ؛ 7 × 14 مم أنابيب قارورة; والفصول.
    2. اعداد العازلة التي تحتوي علي 20 مم HEPES (pH = 7.3) ، 150 mM NaCl ، 1 مم TCEP. اعداد سلسله التخفيف 2:1 من KRAS4b من 60 μM-0.06 μM في حجم إجمالي 200 μL (10 المعايرة الإجمالي). نقل العينات المخففة النهائية في أنابيب قارورة (انظر جدول المواد) ، ووضع أنابيب قارورة في رف ، وادراج العينات في صك موارد الخدمة الخاصة.
    3. ادخل رقاقه المستشعر L1 في أداه الموارد الخاصة. إرفاق المخزن المؤقت ورئيس النظام مع العازلة لمده 7 دقائق.
    4. قم باعداد أسلوب مؤتمت كما يلي:
      1. تعيين درجه حرارة الجهاز إلى 25 درجه مئوية.
      2. تفعيل رقاقه الاستشعار L1 عن طريق الشطف مع اثنين 1 حقن دقيقه من 20 ملم الفصول المذابة في الماء في 30 μL/min معدل التدفق.
      3. تنفيذ دورات بدء التشغيل من عشره 1 دقيقه حقن من المخزن المؤقت لتشغيل لترطيب سطح رقاقه.
        1. إيداع الجسيمات الشحمية علي رقاقه الاستشعار L1 عن طريق حقن الجسيمات الشحمية علي الخلية تدفق (FC)-2 من رقاقه L1 مع 2 دقيقه الحقن في 5 μL/min. الهدف لمستوي التقاط ما لا يقل عن ~ 3,000 وحدات الاستجابة (RUs).
          ملاحظه: زيادة وقت الحقن حتى تحقق مستوي التقاط المناسبة.
      4. حقن ثلاث دورات من العازلة علي حد سواء FC-1 و FC-2 مع 1 دقيقه الحقن في 30 μL/min.
        1. حقن مختلف KRAS4b-FMe المعايرات من ادني إلى سلسله تركيز اعلي. حقن البروتينات باستخدام 1 دقيقه حقن للمرحلة الجمعية وحقن 2 دقيقه للمرحلة التفكك في 30 μL/min معدل التدفق علي كل من FCs.
        2. تجديد رقاقه الاستشعار L1 عن طريق الشطف مع اثنين 1 دقيقه حقن 20 ملم الفصول في 30 μL/min.
    5. ملاءمة البيانات باستخدام برنامج تقييم الموارد الخاصة باستخدام نموذج ربط موقع واحد للحصول علي صلات ربط واضحة (راجع قسم المناقشة للحصول علي شرح لتركيب البيانات).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحد من أكبر المتغيرات في البروتوكول هو كميه البروتين المستهدف المعرب عنه (His6-KRAS4b). تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام عزل من خط Trichoplusia ni الخلية ، قوات التحرير الاندونيسي17، تكييفها لنمو التعليق والمشتكي من المصل. ونظرا لطائفه واسعه من النتائج المبلغ عنها عبر مختلف خطوط الخلايا الحشرية مع نظام التعبير الفيروس المناعي ، فانه من المستحسن ان تستخدم قوات التحرير الاندونيسي ، علي الأقل في البداية ، لإنتاج KRAS4b-FMe.

وينبغي ان يكون البروتين الداكن الذي يها...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكما لوحظ في قسم النتائج التمثيلية ، فان الخطوة الأكثر اهميه اثناء التنقية هي التعامل مع العينة خلال الوقت الذي يكون فيه الملح السفلي. الحد من الوقت الذي يتعرض العينة إلى اقل من 200 mM NaCl سوف تساعد في الحد من هطول الامطار وزيادة الغلة عينه. ويمكن ان يكون تفسير نتائج اللجنة الخاصة صعبا إذا كان الملف الشخصي لا يطابق التوقعات (انظر الشكل 2). وحتى يصبح البروتوكول روتينيا ، فانه ينصح بان يتم تخزين كسور الشطف CEX التي لا يتم نقلها إلى الامام في-80 درجه مئوية حتى يتم الانتهاء من التحليل الشامل ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نعترف بدعم الاستنساخ والتعبير من كاريسا غروس ، جين ميلهالكو ، ومات درو في مختبر تعبير البروتين ، مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان. وقد تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا مع الأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة ، ببموجب العقد رقم HHSN261200800001E. لا يعكس محتوي هذا المنشور بالضرورة اراء أو سياسات أداره الصحة والخدمات الانسانيه ، كما انه لا يشير إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات التي تنطوي علي تاييد حكومة الولايات الامريكيه

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 مل أنابيب القفل الآمن ،إبيندورفطبيعي 22363204
11 مم Cl SS قوارير أخذ العينات الأوتوماتيكية المتشابكةThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)AVANTI POLAR LIPIDSكمخزون سائل في الكلوروفورم
1-بالميتويل -2-أوليويل-جلسيرو -3-فوسفو-إل-سيرين (POPS)أفانتي 840034 شراء POLAR LIPIDSكمخزون سائل في الكلوروفورم
5427R جهاز طرد مركزيEppendorf
Acetonitrile ، HPLC GradeFisher ChemicalA998-1 1L
Ammonium AcetateSigma-Aldrich09689-250g
غاز الأرجونAirgasARUP
لوحة الفحص 384CORNING3544
Biacore T200 InstrumentGE Healthcare
Blue Snap-It Seals ، T / SThermo ScientificC4011-54B
برانسون بالموجات فوق الصوتية حمامThermo Fisher15-336-1000
عمود تبادل الكاتيون الكروماتوغرافيا (CEX)GE Healthcare LifeSciences 29018183HiPrep SP Sepharose عالية الأداء
CHAPSSigmaC3023
Dyna Pro Plate ReaderWyatt Technologies
Exactive Plus EMR مطياف الكتلةالحراري العلمي
حمض الفورميكSigma-AldrichF0507-500Mlاستخدم كاشف الصف أو أفضل
قوارير جيلسون 7x14 مم أنابيبGE HealthcareBR-1002-12
قوارير الخيط اللولبي الزجاجي مع بطانات رغوةPTFEالتخصصات العلميةB69302
جهاز طرد مركزي عالي السرعة / منضدةThermo Fischer Scientific05-112-114Dقادر على ما يصل إلى 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) بروتيازAddgene92414منقى وفقا ل Raran-Kurussi et al. (2017) إزالة علامات التقارب باستخدام TEV Protease. في: Burgess-Brown N. (محرران) التعبير الجيني غير المتجانس في بكتريا قولونية. طرق في البيولوجيا الجزيئية ، المجلد 1586. مطبعة هيومانا ، نيويورك ، نيويورك
كروماتوغرافيا تقارب المعادن الثابت (IMAC)GE Healthcare LifeSciences 28-9365-51HisPrep FF 16/10
إمدادات المياه الداخلية ، مقاومة Arium AdvanceSartorius Stedimمن 18 M & Omega ؛
طقم بثق دهني 0 سم مع حاملأفانتي بولبيان ليبيدات
نيتروجين سائلAirgasNI-DEWAR
M110-EH Microfluidics
MabPac RP UHPLC عمود ، 4 أمهات ، 3.0 × 50 ممعمود 088645
MabPac SEC-1 ، 5 أمهات ، 300 & Aring ؛ 2.1 × 150 ممThermo Scientific088790
برنامج MagTranالميثانول العلمي
الحراري ، HPLC GradeVWR ChemicalsBDH20864.400
نظام كروماتوغرافياNGC BioRad78880002NGC QuestTM 100 نظام كروماتوغرافيا
كوكتيل مثبط إنزيم البروتينات بدون EDTA أو مخلبات أخرىMillipore SigmaP8849
أغطية مطاطية من النوع 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Sensor Chip L1GE Healthcare29104993
مقياس الطيفالضوئي الحراري Fischer Scientific13-400-519امتصاص عند 280 نانومتر
Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي ، 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008PES غشاء
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 مل مرشحات الطرد المركزيAmiconUFC501024
جهاز طرد مركزي فائقBeckman CoulterOptima - L80Kقادر على 100,000 xg
Vanquish UHPLC (مضخة ، قلب عمود ، ونظام LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Water ، HPLC GradeSigma-Aldrich270733-1Lقد يستخدم مصدر مياه داخلي (انظر أدناه)
حقنة Whatman GD / XP PES 0.45 مم تصفيةGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Scientificproteomics
850457 شراء عمود 610023 Thermo Scientific software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles