مقالة منهجية

تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة

DOI:

10.3791/60727

⸱

مايو 16, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول لدراسة في توطين الجسم الحي للأجسام المضادة في الفئران نماذج xenograft الورم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي الأدوية متعددة الوظائف ذات الصلة العالية التي تعمل من خلال آليات مستقلة متغيرة للقضاء على الخلايا السرطانية. على مدى العقود القليلة الماضية، برز مجال conjugates المضادة للأدوية، والأجسام المضادة للبيض، مستقبلات مستضدات الشيميك (CAR) والعلاج المناعي للسرطان كمنطقة واعدة للغاية من التحقيقات الأساسية والعلاجية. مع العديد من التجارب البشرية الناجحة التي تستهدف مستقبلات نقاط التفتيش المناعية وخلايا CAR-T في سرطان الدم وسرطان الجلد بوتيرة اختراقية ، فهي أوقات مثيرة للغاية للعلاجات الأورام المستمدة من الاختلافات في هندسة الأجسام المضادة. للأسف, وقد ثبت أيضا أن أعدادا كبيرة من الأجسام المضادة والعلاجات CAR على أساس مخيبة للآمال في التجارب البشرية من السرطانات الصلبة بسبب محدودية توافر الخلايا المناعية في السرير الورم. الأهم من ذلك، التوزيع غير محدد للأجسام المضادة العلاجية في الأنسجة غير الأورام تسهم أيضا في عدم وجود فعالية سريرية، والسمية المرتبطة بها والفشل السريري. كما تعتمد الترجمة المؤمنة للدراسات قبل السريرية في مسارات السريرية البشرية للغاية على الفئران الورم xenograft فعالية ودراسات السلامة، وهنا نسلط الضوء على طريقة لاختبار الورم وتوزيع الأنسجة العامة للأجسام المضادة العلاجية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة المنقاة البروتين A مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بالقرب تليها التصوير الحي للفئران الحاملة للورم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت ادارة الاغذية والعقاقير أول الأجسام المضادة أحادية النسيلة تستهدف CD3 (OKT3، Muromonab) في عام 19861،2. منذ ذلك الحين على مدى السنوات العشرين القادمة ، كان هناك انفجار سريع في مجال هندسة الأجسام المضادة بسبب النجاح الساحق للأجسام المضادة ضد مثبطات نقاط التفتيشالمناعية 3. بجانب التنشيط غير المباشر للجهاز المناعي ، يتم تهدف الأجسام المضادة إلى الإبلاغ مباشرة عن الخلايا السرطانية لإشراك الخلايا المناعية على وجه التحديد ، وإثارة السمية الخلوية عن طريق ناهض مستقبلات الموت ، وعرقلة إشارات بقاء الخلايا السرطانية ، وعرقلة تولد الأوعية (نمو الأوعية الدموية) ، وتقييد منظمي نقاط التفتيش المن....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استعراض جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات ودراسات xenografts الورم والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية (IACUC) هنا في جامعة فرجينيا ومطابقة للمعايير التنظيمية ذات الصلة

1. التعبير وتنقية الأجسام المضادة

  1. صيانة خلايا CHO
    1. تنمو خلايا CHO في FreeStyle CHO وسائل الإعلام تكملها متاحة تجاريا 1x الجلوتامين الملحق في 37 درجة مئوية تهتز في 130 دورة في الدقيقة مع 5٪ CO2 باستخدام قارورة delong Erlenmeyer إما الزجاج أو المتاح.
      ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام قارورة حائرة مع غطاء تنفيسي لزيادة الانفعالات وتحسين نقل الغاز أثناء حالة الاهتزاز. وقد تم الحصول على انخفاض كبير في العائد من الأجسام ال....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المنهجية الموصوفة، أولاً قمنا باستنساخ الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) المسماة فارلتوزوماب، وأضداد من نوعها يسمى BaCa تتكون من فارلتوزوماب و lexatumumab جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة للسيطرة مثل abagovomab (تسلسل المقدمة في ملف التكميلية 1). وترد تفاصيل المتغير التمثيلي الثقيلة (VH) والضوء المتغير (VL) المجالات في استنساخ الحمض النووي (pVH، pVL) في الشكل 1A. لتأكيد استنساخ إيجابية، ونفذنا مستعمرة PCR باستخدام الببتيد إشارة إلى الأمام (SP for).......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتقائية وأورام تسليم محددة من العلاجية المضادة للسرطان وكيل هو المفتاح لقياس فعالية وسلامة العلاج المستهدف معين13. هنا وصفنا نهجاً سريع وفعالاً للتحقيق في توزيع الأنسجة والورم التفصيلية للجسم المضاد لـ BaCa غير السريرية. النهج الموصوف ينطبق على أي جسم مضاد تم إنشاؤه حديثًا ويمكن استخدامه جنبًا إلى جنب مع جسم مضاد فعال سريريًا (مع الصفات المطلوبة) لخصائص توزيع الورم /الجهاز. النظر في معظم مستقبلات الهدف للأجسام المضادة (مثل HER2 في سرطان الثدي) هي جداً مفرط في الخلايا السرطانية (الأنسجة), في معظم .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لمركز فرجينيا للسرطان مرفق التصوير الأساسي، مرفق التحليل الجزيئي الحيوي، مرفق المجهر المتقدم ومرفق فيفاريوم الأساسي للمساعدة. ج. تي-س هو محقق مهني مبكر في أكاديمية سرطان المبيض (OCA-DoD). وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NCI / المعاهد القومية للصحة (R01CA233752) إلى J. T-S، الولايات المتحدة DoD برنامج أبحاث سرطان الثدي (BCRP) جائزة اختراق المستوى 1 إلى J. T-S (BC17097) والولايات المتحدة DOD برنامج أبحاث سرطان المبيض (OCRP) جائزة التمويل (OC180412) إلى J. T-S

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فري ستايل CHO وسائل الإعلامجيبكو لايف تكنولوجيزCat # 12651-014
مضاد مضاد (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
عامل مضاد للتكتلGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD حقنة الأنسولينBD BioSciencesCat # 329420
الفرجار IVIS SpectrumPerkinElmerCat # 124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 مل DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 مل RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 المترافق IgG المضاد للإنسان (H + L)جاكسون ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kitInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusionTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurane ، USPCovetrusCat # 11695-6777-2
مرهم تشحيم العينRefresh Lacri-LubeCat # 4089
MatrigelCorningCat # 354234
كاشف التعدين PEIThermo FisherCat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer كاسيت غسيل الكلىThermo ScientificCat # 66333
Steritop Vacuum مرشحاتMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
النماذج التجريبية: خطوط الخلايا< / قوي>
الإنسان: OVCAR-3مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيATCC HTB-161
الإنسان: خلايا CHO-Kمستقرة تم تحويله في مختبرناATCC CCL-61
الماوس: 4T1هدية لطيفة من الدكتور تشيب لاندن ، ماوس UVA
: MC38هدية لطيفة من الدكتورة سوزان أوستراند روزنبرغ ، UMBCمصدق عليها بواسطة ماوس التنميط
STR: MC38 hFOLR1تم إنشاؤه في مختبرنا (هذه الورقة)
<قوي > نماذج تجريبية: < / قوي >
الفئران: رياضي عارية Foxn1 < سوپ > نو < / سوپ > / Foxn1 < sup> + < / sup>Envigoالفئران متعددة الطلبات
: NOD.Cg Prkdc < sup > scid < / sup> Il2rg < sup >tm1Wjl < / sup> / SzJJackson مختبرأوامر متعددة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 1....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Therapeutic AntibodyAntibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionTissue DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

مقالات ذات صلة