مقالة منهجية

تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة

DOI:

10.3791/60727

⸱

مايو 16, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول لدراسة في توطين الجسم الحي للأجسام المضادة في الفئران نماذج xenograft الورم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي الأدوية متعددة الوظائف ذات الصلة العالية التي تعمل من خلال آليات مستقلة متغيرة للقضاء على الخلايا السرطانية. على مدى العقود القليلة الماضية، برز مجال conjugates المضادة للأدوية، والأجسام المضادة للبيض، مستقبلات مستضدات الشيميك (CAR) والعلاج المناعي للسرطان كمنطقة واعدة للغاية من التحقيقات الأساسية والعلاجية. مع العديد من التجارب البشرية الناجحة التي تستهدف مستقبلات نقاط التفتيش المناعية وخلايا CAR-T في سرطان الدم وسرطان الجلد بوتيرة اختراقية ، فهي أوقات مثيرة للغاية للعلاجات الأورام المستمدة من الاختلافات في هندسة الأجسام المضادة. للأسف, وقد ثبت أيضا أن أعدادا كبيرة من الأجسام المضادة والعلاجات CAR على أساس مخيبة للآمال في التجارب البشرية من السرطانات الصلبة بسبب محدودية توافر الخلايا المناعية في السرير الورم. الأهم من ذلك، التوزيع غير محدد للأجسام المضادة العلاجية في الأنسجة غير الأورام تسهم أيضا في عدم وجود فعالية سريرية، والسمية المرتبطة بها والفشل السريري. كما تعتمد الترجمة المؤمنة للدراسات قبل السريرية في مسارات السريرية البشرية للغاية على الفئران الورم xenograft فعالية ودراسات السلامة، وهنا نسلط الضوء على طريقة لاختبار الورم وتوزيع الأنسجة العامة للأجسام المضادة العلاجية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة المنقاة البروتين A مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بالقرب تليها التصوير الحي للفئران الحاملة للورم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت ادارة الاغذية والعقاقير أول الأجسام المضادة أحادية النسيلة تستهدف CD3 (OKT3، Muromonab) في عام 19861،2. منذ ذلك الحين على مدى السنوات العشرين القادمة ، كان هناك انفجار سريع في مجال هندسة الأجسام المضادة بسبب النجاح الساحق للأجسام المضادة ضد مثبطات نقاط التفتيشالمناعية 3. بجانب التنشيط غير المباشر للجهاز المناعي ، يتم تهدف الأجسام المضادة إلى الإبلاغ مباشرة عن الخلايا السرطانية لإشراك الخلايا المناعية على وجه التحديد ، وإثارة السمية الخلوية عن طريق ناهض مستقبلات الموت ، وعرقلة إشارات بقاء الخلايا السرطانية ، وعرقلة تولد الأوعية (نمو الأوعية الدموية) ، وتقييد منظمي نقاط التفتيش المناعية ، وتقديم النظائر المشعة ، والعقاقير العلاجية الكيميائية وsrna كعوامل مترافقة2. بالإضافة إلى ذلك ، دراسة شظايا متغير سلسلة واحدة (scFv) من الأجسام المضادة المختلفة على سطح الخلايا التائية المستمدة من المريض وخلايا NK (CAR-T و CAR-NK) هي منطقة سريعة النمو من التحقيقات السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا4.

التقارب فائقة عالية من الأدوية القائمة على الأجسام المضادة التي توفر الانتقائية لضداد التعبير عن الخلايا السرطانية يجعلها وكيلا جذابا. وبالمثل، فإن الولادة المستهدفة واستبقاء الورم في الجسم المضاد العلاجي (أو الدواء الكيميائي) هو المفتاح لتحقيق التوازن بين الفعالية على السمية. لذلك ، يتم استغلال عدد كبير من استراتيجيات الهندسة البروتينية التي تشمل ولكن لا تقتصر على5 والأجسام المضادة ثلاثيةالمحددة 6 لتعزيز كبير في الاحتباس الأمثل للورم من خلال الوريد (IV) حقن العلاجات5،7. هنا، نحن وصف طريقة بسيطة القائمة على الفلوريس لمعالجة الورم والأنسجة توزيع الأجسام المضادة المضادة للسرطان المحتملة الفعالية.

لأن الأنسجة الحيوانية تمتلك لصناعة السيارات الفلورية عندما متحمس في الطيف المرئي، وصفت في البداية الأجسام المضادة مع صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (على سبيل المثال، IRDye 800CW). للحصول على براهين من التحقيقات مفهوم, لقد حققنا استخدام مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) التي تستهدف الأجسام المضادة تسمى farletuzumab ومشتقة لها دعا مرساة Bispecific المنشط Cytotoxicity (BaCa)7 الأجسام المضادة التي تستهدف CO-FOLR1 ومستقبلات الموت-5 (DR5)8 في جسم مضاد واحد المؤتلف. FOLR1 هو مستقبلات مستهدفة واضحة ومحددة في المبيض والخلايا السرطانية TNBC، xenografts الورم وأورام المريض9. وتجدر الإشارة إلى أن هناك جهود متعددة لاستغلال سريريا FOLR1 باستخدام النهج القائمة على الأجسام المضادة لإشراك الخلايا المناعية والمقويات المخدرات المضادة (ADC) لسرطانات المبيض والثدي10،11.

في هذه الورقة الأساليب، ونحن استنساخ، وأعرب عن وتنقية السريرية المضادة لل FOLR1 (فارلتوزوماب) جنبا إلى جنب مع غيرها من الأجسام المضادة للسيطرة باستخدام نظام التعبير CHO. تم استخدام IgG1 isotype والأجسام المضادة للحماقة السريرية mucin-16 تسمى abagovomab12 كضوابط سلبية. بعد تنقية البروتين A، وصفت الأجسام المضادة المشار إليها مع IRDye 800CW وكانت تدار في الوريد الذيل للفئران عارية إما تحمل xenografts أو Xenografts الورم المبيض أو متحولة بشكل ثابت الإنسان FOLR1 التعبير عن سرطان القولون مورين xenografts. تم تتبع توطين الأجسام المضادة عن طريق التصوير الحي باستخدام طيف التصوير الحي في نقاط زمنية مختلفة متعددة7. ولا تتطلب هذه الطريقة أي تعديل وراثي أو حقن للركيزة لتمكين انبعاث الضوء وهي أسرع بكثير، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويمكن تطبيق بروتوكول الاستنساخ والتعبير والتنقية ووضع العلامات العامة الوارد وصفها أدناه على أي جسم مضاد سريري وغير سريري إذا توفرت تسلسلات سلسلة ثقيلة وخفيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استعراض جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات ودراسات xenografts الورم والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية (IACUC) هنا في جامعة فرجينيا ومطابقة للمعايير التنظيمية ذات الصلة

1. التعبير وتنقية الأجسام المضادة

  1. صيانة خلايا CHO
    1. تنمو خلايا CHO في FreeStyle CHO وسائل الإعلام تكملها متاحة تجاريا 1x الجلوتامين الملحق في 37 درجة مئوية تهتز في 130 دورة في الدقيقة مع 5٪ CO2 باستخدام قارورة delong Erlenmeyer إما الزجاج أو المتاح.
      ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام قارورة حائرة مع غطاء تنفيسي لزيادة الانفعالات وتحسين نقل الغاز أثناء حالة الاهتزاز. وقد تم الحصول على انخفاض كبير في العائد من الأجسام المضادة مع القارورة العادية (غير حيرة) بسبب الانفعالات محدودة من ثقافة التعليق.
    2. الحفاظ على عدد الخلايا بين 1-5 × 106 خلايا / مل مع > 95٪ خلية قابلة للحياة. إذا زاد عدد الخلايا أكثر من 5 × 106 خلايا / مل، تقسيم الخلايا. لا تسمح أبدا لخلايا CHO بالوصول إلى أقل من 0.2 × 106 خلايا/مل.
  2. نقل خلايا CHO
    1. تنمو خلايا CHO في 200 مل من وسائل الإعلام (2 × 106 الخلايا / مل) في erlenmeyer delong حيرة القارورة.
      ملاحظة: أنتجت ثقافات التعليق التي تزرع في قارورة حائرة دائمًا غلة بروتين أعلى مقابل زراعتها في قارورة غير حائرة.
    2. في أنبوب 15 مل, اتخاذ 5 مل من وسائل الإعلام 5 فري ستايل CHO وإضافة 50 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ VH و 75 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ VL. دوامة لخلط جيدا.
    3. احتضان خليط الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: فترة حضانة أطول يقلل من غلة البروتين.
    4. أضف 750 ميكرولتر من مخزون البولي إثيلينمين 1 ملغ/مل (PEI) إلى محلول الحمض النووي ودوامة الخليط بقوة لمدة 30 s. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية.
      ملاحظة: يجب أن تكون جزيرة الأمير إدوارد طازجة. دورة ذوبان الجليد المتعددة من جزيرة الأمير إدوارد يقلل من العائد الإجمالي بشكل كبير.
    5. أضف الخليط الكامل من الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد على الخلايا أثناء هز القارورة يدويًا. على الفور احتضان erlenmeyer delong حيرة قارورة مع الخلايا في 37 درجة مئوية تهتز في 130 دورة في الدقيقة.
  3. التعبير
    ملاحظة: يحتوي الجسم المضاد على ببتيد إشارة إفرازي تم تصميمه إلى نهايته N-Terminal ، مما يساعد على إفراز الأجسام المضادة في وسائل الإعلام.
    1. تنمو الخلايا المُعدّة بالعدوى عند 37 درجة مئوية، مع اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة في اليوم 1.
    2. في اليوم 2، إضافة 2 مل من 100x عامل مكافحة التكتل و 2 مل من 100x المضادة للبكتيريا- المضادة للبكتيريا- حل mycotic. احول القارورة إلى درجة حرارة أقل (32-34 درجة مئوية)، مع اهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة.
    3. في كل يوم خامس، إضافة 10 مل من الأعلاف Tryptone N1، و 2 مل من 100x الجلوتامين الملحق.
    4. الحفاظ على عد الخلايا كل يوم ثالث باستخدام قياس الهيموسيت بعد تلطيخ aliquot من الخلايا مع وصمة عار زرقاء trypan. تأكد من بقاء الخلية فوق 80٪
    5. في اليوم 10 أو 11، حصاد المتوسطة لتنقية الأجسام المضادة. تدور الثقافة في 3000 س ز،4 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة ومن ثم تصفية وسائل الاعلام واضحة باستخدام 0.22 μM مرشحات زجاجة.
  4. تنقيه
    ملاحظة: يتم إجراء تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود البروتين-A المتاح تجاريًا (انظر جدول المواد)باستخدام مضخة متعالة.
    1. اكويريبت العمود مع اثنين من حجم العمود من العازلة ملزمة (20 mM فوسفات الصوديوم في 7.4 pH).
    2. تمرير الوسائط المصفاة التي تحتوي على الأجسام المضادة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.5) خلال العمود بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
    3. اغسل العمود بمخزن عمودين من المخزن المؤقت للربط.
    4. إلوت الجسم المضاد إلى 500 ميكرولتر باستخدام 5 مل عازلة elution (30 mM خلات الصوديوم في الأسي 3.4).
    5. تحييد الأسي للجسم المضاد المائل بإضافة 10 ميكرولتر من عازلة تحييد (3 M خلات الصوديوم في الأسي 9) لكل كسر.
      ملاحظة: يحتوي رقم الكسر 3-6 على معظم الأجسام المضادة. من المستحسن الحفاظ على جميع الكسور في حالة الجسم المضاد هو مُلَح في جزء لاحق مما كان متوقعا.
    6. قياس تركيز الأجسام المضادة النقية باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تحديد البروتوكول الافتراضي لIgG. يتم الحصول على التركيز النهائي للجسم المضاد في ملغم / مل عن طريق النظر في الوزن الجزيئي ومعامل الامتصاص.

2. الفلورسنت وضع العلامات

ملاحظة: الأجسام المضادة هي المسمى مع صبغة الأشعة تحت الحمراء التي تحتوي على مجموعة رد الفعل استر NHS، الذي الأزواج إلى البروتينات وتشكيل اقتران مستقرة. هذا التفاعل هو درجة الحساسية درجة اله PH ويعمل بشكل أفضل في 8.5 درجة. الفلورسنت المرافقة المسمى مع عرض صبغة أقصى امتصاص 774 نانومتر، والحد الأقصى للانبعاثات من 789 نانومتر. 8.5 هو مفتاح الاقتران الفعال.

  1. Dialyze 0.5 مل من الجسم المضاد باستخدام كاسيت غسيل الكلى (0.1-0.5 مل) في 1 لتر من العازلة الاقتران (50 mM الفوسفات العازلة في الرقم الH 8.5). بعد 4 ح نقل كاسيت غسيل الكلى إلى عازلة جديدة و dialyze بين عشية وضحاها.
  2. إعداد تفاعل اقتران بإضافة 0.03 ملغ من IRDye 800CW لكل 1 ملغ من الأجسام المضادة في حجم رد فعل 500 ميكرولتر.
    ملاحظة: يتم حل IRDye 800CW في DMSO بتركيز 10 ملغ /مل.
  3. تنفيذ ردود الفعل وضع العلامات لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: زيادة الوقت بعد 2 h لا يحسن وضع العلامات.
  4. تنقية الترافقات المسمى من قبل غسيل الكلى واسعة النطاق ضد 1X PBS.
  5. تقدير درجة وضع العلامات عن طريق قياس امتصاص الصبغة عند 780 نانومتر وامتصاص البروتين عند 280 نانومتر. مساهمة الصبغة إلى إشارة 280 نانومتر هو 3٪.
  6. حساب نسبة الصبغة/البروتين باستخدام هذه الصيغة:
    figure-protocol-1
    حيث 0.03 هو عامل تصحيح لامتصاص الصبغة المستخدمة في 280 نانومتر (أي ما يعادل 3.0 ٪ من امتصاصها في 780 نانومتر) ، εالصبغة والبروتين ε هي معاملات انقراض الضروس للصبغة والبروتين (الأجسام المضادة) على التوالي.
    ملاحظة: εالصبغة هو 270،000 M-1 سم-1 والبروتين ε هو 203،000 M-1 سم-1 (لIgG نموذجي) في 1:1 خليط من برنامج تلفزيوني: الميثانول. قد يكون البروتينات الأخرى غير IgG معاملات الانقراض الضروس مختلفة جدا. استخدام معامل الانقراض الصحيح للبروتين من الفائدة أمر ضروري لتحديد دقيق من نسبة D / P.
  7. حساب تركيز البروتين النهائي باستخدام هذه الصيغة:
    figure-protocol-2
    ملاحظة: تأكد دائمًا من فعالية ربط المستضد للأجسام المضادة المسماة وغير المسماة باستخدام ELISA (قياس الانزيم المناعي المرتبط) أو تدفق قياس الألياف قبل الانتقال إلى دراسات vivo.

3. ماوس xenograft الدراسات

  1. إعداد الخلايا السرطانية للحقن
    1. تنمو الخلايا OVCAR-3 في 1640-1640 متوسطة، مع تكملة 10٪ من FBS و 1x البنسلين-الستربتوميسين.
    2. في اليوم السابق للحقن، وخلايا الثقافة الفرعية في أطباق ثقافة جديدة 100 ملم مع 10 مل من كامل متوسط / طبق. استخدام عدد الخلايا من 0.5-1 × 106 الخلايا / طبق.
    3. احتضان الثقافات في درجة حرارة 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2 ل 20-24 h.
    4. في يوم الحقن، وإزالة متوسطة النمو من أطباق الثقافة. شطف طبقة الخلية بدقة مع Ca2+/ Mg2 + الحرة دولبيككو المالحة الفوسفات المخزنة (DPBS) لإزالة الخلايا الميتة، والحطام الخلوي وجميع آثار المصل، والتي قد تتداخل في عمل التربسين.
    5. Trypsinize الخلايا عن طريق إضافة 1.0-1.5 مل من تريبسين-EDTA حل لكل طبق ومحاولة لنشر الحل عن طريق إمالة الطبق في جميع أنحاء تليها الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
      ملاحظة: لاحظ الخلايا تحت مجهر مقلوب للتحقق من حالة التربسينية الفعلية. تحت نتائج trypsinization في عدد أقل من انفصال الخلية من سطح طبق الثقافة، أكثر من trypsinization يؤدي إلى الإجهاد الخلوي. لذا ، فإن التبسينينية المناسبة مهمة.
    6. إضافة 1.0-1.5 مل من متوسطة النمو الكامل لكل طبق لوقف عمل التربسين، بعد أن إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف.
      ملاحظة: الخفقان اللطيف مهم للحفاظ على صحة الخلية.
    7. جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل وتدور في 250 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. جمع بيليه الخلية بعد إزالة عظمى وغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق بيليه في 1X DPBS.
    9. تدور مع تعليق الخلية بسرعة منخفضة 250 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. أضف 500 ميكرولتر من DPBS وإعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف للحصول على تعليق خلية واحدة.
    11. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
      ملاحظة: للحصول على دقة أفضل، كرر العد ثلاث مرات وأخذ متوسط.
    12. ضبط مستوى الصوت في مثل هذه الطريقة بحيث كثافة الخلية النهائية ستكون 1 × 108 خلايا / مل.
  2. حقن تحت الجلد من الخلايا لتطوير الماوس xenografts
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء كافة الإجراءات في خزانة سلامة BSL2. Athymic عارية Foxn1nu/ Foxn1+ الفئران وقد استخدمت في الدراسة الحالية.
    1. تأخذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 مل ومزيج مع 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة.
      ملاحظة: مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة يميل إلى تشكيل هلام مثل حالة في درجة حرارة الغرفة، لذلك الحفاظ على الخلايا بعناية والخليط المتوسط مصفوفة على الجليد. من المستحسن الحفاظ على الأنابيب والنصائح والمحاقن في الثلاجة ثم نقلها على الجليد قبل حقن الحيوان.
    2. تهيج الخليط لتجنب أي تكتل الخلية. ثم، تأخذ هذا 100 μL من خلية تعليق الخليط المتوسط الذي يحتوي على 5 × 106 الخلايا، في حقنة 1 سم مكعب.
    3. ارفع جلد الحيوان بلطف لفصل الجلد عن طبقة العضلات الكامنة وحقن تعليق الخلية (100 ميكرولتر) تحت الجلد (5 × 106 خلايا) ، مع إبرة 26 G. الانتظار لبضع ثوان قبل اتخاذ الإبرة، بحيث الطابق السفلي مصفوفة المتوسطة يمكن أن تشكل هلام شبه صلبة مثل هيكل جنبا إلى جنب مع الخلايا تحت الجلد، ومنع الخليط الخروج من موقع الحقن.
      ملاحظة: تحتاج الخلايا إلى اختبار قبل الحقن لأي تلوث قد يضر بالفئران المناعية. في حين حقن لا تضع الإبرة عميقا جدا في الجلد لأن هذا قد يشكل الورم أعمق مما كان متوقعا.
    4. إبقاء الحيوان في قفص معقمة ومراقبة لحوالي 20 دقيقة.
    5. مراقبة الفئران لمدة 2-3 أسابيع والسماح للورم أن ينمو ما يصل إلى 500 ملم3 حجم.

4. توطين الأجسام المضادة باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي

ملاحظة: في معدات التصوير الحي (انظر جدول المواد)المستخدمة في هذه التجربة يستخدم مجموعة من المرشحات ذات الكفاءة العالية وخوارزميات غير خلط الطيفية للتصور غير الباضع وتتبع النشاط الخلوي والوراثي داخل كائن حي في الوقت الحقيقي. النظام يوفر كلا من الفلوريسنس والأضواء الحيوية القدرة على الرصد.

  1. حقن 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة المسمى صبغ عن طريق الوريد الذيل.
    1. تخدير الفئران التي تحمل الورم باستخدام 2٪ isoflurane. تحقق من عدم وجود استجابة لردود الفعل دواسة.
    2. بمجرد أن تتوقف الفئران عن الحركة ، توسع الوريد الجانبي من خلال تطبيق مياه الديدان.
    3. حقن 25 ميكروغرام (في 100 ميكرولتر) من الأجسام المضادة المسمى باستخدام حقنة الأنسولين 1 سم مكعب مع إبرة 26 G.
    4. وبالمثل، كتحكم سلبي، تسمية وحقن الأجسام المضادة IgG1 Isotype غير محددة التي لا تستهدف الخلايا السرطانية.
  2. أداء في التصوير الحي في الجسم الحي بعد 8, 24, 48 ح, إلخ من حقن الأجسام المضادة.
    1. في البرنامج المقترن، انقر فوق تهيئة موجودة في لوحة التحكم وتأكد من أن درجة حرارة المرحلة هي 37 درجة مئوية.
    2. بدوره على امدادات الاوكسجين، وجميع المضخات على نظام التخدير، وإمدادات غاز isoflurane إلى غرفة مخدر وتعيين صمام متبخر isoflurane إلى 2٪.
    3. نقل الفئران إلى غرفة مخدر والانتظار حتى الفئران مخدر تماما. تطبيق مرهم تزييت العين لتجنب تجفيف عيونهم.
    4. انتقل إلى لوحة التحكم، قم بإعداد التصوير المفلور من خلال خيار معالج التصوير وحدد الإثارة في 773 نانومتر والانبعاثات في 792 نانومتر.
      ملاحظة: توفر إعدادات التعريض التلقائي الافتراضية صورة فلورية جيدة. ومع ذلك، يمكن تعديل تفضيلات التعرض التلقائي وفقا للاحتياجات.
    5. نقل الفئران تخدير إلى غرفة التصوير وتجميعها على مجال التصوير باستخدام مخروط الأنف. توفر مرحلة التصوير خيارًا لاستيعاب 5 فئران في كل مرة.
      ملاحظة: يكون ماوس التحكم مع أجهزة الماوس اختبار أن يكون لها كمية مماثلة من التعرض والإعدادات الأخرى أثناء التحليل.
    6. بمجرد أن يصبح كل شيء جاهزًا، حدد خيار الحصول على لوحة التحكم للحصول على الصورة.
    7. مع إعدادات Autoexposure يقوم النظام بإنشاء الصورة في غضون دقيقة. الصورة التي تم إنشاؤها هي تراكب الفلوريسنس على الصورة الفوتوغرافية مع كثافة الفلورس البصرية المعروضة في وحدات من العد أو الفوتونات، أو من حيث الكفاءة.
    8. بعد الحصول على الصورة، نقل الفئران من غرفة التصوير مرة أخرى إلى قفصها ومراقبة لاسترداد لمدة 1 إلى 2 دقيقة.
  3. ضبط الصورة بشكل جيد مع الأدوات والوظائف المتوفرة داخل البرنامج لتحليل الصور. أدوات تحليل الصور في شريط القوائم ولوحة الأدوات.
    1. ضمن ضبط الصورة، اضبط السطوع أو التباين أو العتامة وحدد مقياس اللون.
    2. استخدم أدوات عائد الاستثمار لتحديد منطقة ذات أهمية (ROI) في صورة بصرية وقياس كثافة الإشارة داخل عائد الاستثمار. إذا لزم الأمر، قم بتصدير بيانات الإشارة الكمية إلى برنامج جدول بيانات و قم برسم البيانات.
    3. لإجراء دراسات المتابعة، تحليل الفئران necropsies من الأنسجة المختلفة (على سبيل المثال، الكبد، الرئة، القلب، الكلى، الطحال، الدماغ الخ) جنبا إلى جنب لتوزيع غير محدد مفصل من الأجسام المضادة الفلورية المسمى.
      ملاحظة: يمكن دعم البيانات كذلك مع ELISA الأنسجة محددة من خلال الاستفادة من المستضد (FOLR1 في هذه الحالة) في 96 كذلك المقايسات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المنهجية الموصوفة، أولاً قمنا باستنساخ الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) المسماة فارلتوزوماب، وأضداد من نوعها يسمى BaCa تتكون من فارلتوزوماب و lexatumumab جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة للسيطرة مثل abagovomab (تسلسل المقدمة في ملف التكميلية 1). وترد تفاصيل المتغير التمثيلي الثقيلة (VH) والضوء المتغير (VL) المجالات في استنساخ الحمض النووي (pVH، pVL) في الشكل 1A. لتأكيد استنساخ إيجابية، ونفذنا مستعمرة PCR باستخدام الببتيد إشارة إلى الأمام (SP for)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتقائية وأورام تسليم محددة من العلاجية المضادة للسرطان وكيل هو المفتاح لقياس فعالية وسلامة العلاج المستهدف معين13. هنا وصفنا نهجاً سريع وفعالاً للتحقيق في توزيع الأنسجة والورم التفصيلية للجسم المضاد لـ BaCa غير السريرية. النهج الموصوف ينطبق على أي جسم مضاد تم إنشاؤه حديثًا ويمكن استخدامه جنبًا إلى جنب مع جسم مضاد فعال سريريًا (مع الصفات المطلوبة) لخصائص توزيع الورم /الجهاز. النظر في معظم مستقبلات الهدف للأجسام المضادة (مثل HER2 في سرطان الثدي) هي جداً مفرط في الخلايا السرطانية (الأنسجة), في معظم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون لمركز فرجينيا للسرطان مرفق التصوير الأساسي، مرفق التحليل الجزيئي الحيوي، مرفق المجهر المتقدم ومرفق فيفاريوم الأساسي للمساعدة. ج. تي-س هو محقق مهني مبكر في أكاديمية سرطان المبيض (OCA-DoD). وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NCI / المعاهد القومية للصحة (R01CA233752) إلى J. T-S، الولايات المتحدة DoD برنامج أبحاث سرطان الثدي (BCRP) جائزة اختراق المستوى 1 إلى J. T-S (BC17097) والولايات المتحدة DOD برنامج أبحاث سرطان المبيض (OCRP) جائزة التمويل (OC180412) إلى J. T-S

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فري ستايل CHO وسائل الإعلامجيبكو لايف تكنولوجيزCat # 12651-014
مضاد مضاد (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 15240-062
عامل مضاد للتكتلGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD حقنة الأنسولينBD BioSciencesCat # 329420
الفرجار IVIS SpectrumPerkinElmerCat # 124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 مل DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 مل RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 المترافق IgG المضاد للإنسان (H + L)جاكسون ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kitInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe ColumnGE HealthcareCat # 11-0034-93
InfusionTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurane ، USPCovetrusCat # 11695-6777-2
مرهم تشحيم العينRefresh Lacri-LubeCat # 4089
MatrigelCorningCat # 354234
كاشف التعدين PEIThermo FisherCat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer كاسيت غسيل الكلىThermo ScientificCat # 66333
Steritop Vacuum مرشحاتMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
النماذج التجريبية: خطوط الخلايا< / قوي>
الإنسان: OVCAR-3مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيATCC HTB-161
الإنسان: خلايا CHO-Kمستقرة تم تحويله في مختبرناATCC CCL-61
الماوس: 4T1هدية لطيفة من الدكتور تشيب لاندن ، ماوس UVA
: MC38هدية لطيفة من الدكتورة سوزان أوستراند روزنبرغ ، UMBCمصدق عليها بواسطة ماوس التنميط
STR: MC38 hFOLR1تم إنشاؤه في مختبرنا (هذه الورقة)
<قوي > نماذج تجريبية: < / قوي >
الفئران: رياضي عارية Foxn1 < سوپ > نو < / سوپ > / Foxn1 < sup> + < / sup>Envigoالفئران متعددة الطلبات
: NOD.Cg Prkdc < sup > scid < / sup> Il2rg < sup >tm1Wjl < / sup> / SzJJackson مختبرأوامر متعددة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1(2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595(2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50(2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209(2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Antibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

مقالات ذات صلة