Method Article

توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف الفلور المناعي وطريقة PCR الكمية لتوطين والقياس الكمي لفيروسات البجومو في أنسجة الحشرات. يمكن استخدام بروتوكول الفلورسينس المناعي لتوطين البروتينات الفيروسية والنواقل. ويمكن توسيع نطاق بروتوكول PCR الكمي لتحديد الفيروسات في أجسام الذبابة البيضاء الكاملة والنباتات المصابة بالفيروس.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتقل فيروسات البيجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) عن طريق الذباب الأبيض من مجمع بيميسيا tabaci بطريقة مستمرة وتعميمية. وبالنظر إلى الضرر الواسع النطاق الذي تسببه فيروسات البجومو لإنتاج المحاصيل في جميع أنحاء العالم، لا بد من فهم التفاعل بين فيروسات البجومو وناقل الذبابة البيضاء. وللقيام بذلك، فإن توطين الفيروس والقياس الكمي له في أنسجة النواقل أمر بالغ الأهمية. هنا، باستخدام الطماطم الصفراء ورقة حليقة فيروس (TYLCV) كمثال، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتوطين فيروسات البجومو في وسط الذبابة البيضاء، والغدد اللعابية الأولية، والمبايض عن طريق الفلور المناعي. وتستند هذه الطريقة على استخدام أجسام مضادة محددة ضد بروتين معطف الفيروس، والأجسام المضادة الثانوية المسماة بالصبغة، والمجهر البؤري. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتوكول لcolocalize بروتينات البيجوموفيروسات والذبابة البيضاء. كما وصفنا بروتوكولًا للقياس الكمي لـ TYLCV في وسط الذبابة البيضاء والغدد اللعابية الأولية والهيموليمف والمبيضين بواسطة PCR الكمي (qPCR). باستخدام المبادئ التمهيدية المصممة خصيصًا لـ TYLCV ، تسمح بروتوكولات القياس الكمي بمقارنة كمية TYLCV في أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة. ومن المحتمل أن يكون البروتوكول الموصوف مفيداً للقياس الكمي لفيروسات البجومو في جسم الذبابة البيضاء والنبات المصاب بالفيروس. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل مسار الدورة الدموية لفيروسات البجومو في الذبابة البيضاء أو كمكمل لطرق أخرى لدراسة التفاعلات بين الذبابة البيضاء والفيروسات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الأخيرة ، تسببت فيروسات البجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) في أضرار جسيمة لإنتاج العديد من محاصيل الخضروات والألياف والزينة في جميع أنحاء العالم1. تنتقل فيروسات البجومو بطريقة مستمرة عن طريق ذبابة البياض البيضاء (Hemiptera: Aleyrodidae) ، وهي نوع معقد يحتوي على أكثر من 35 نوعًا خفيًا2،3. قد تؤثر فيروسات Begomo بشكل مباشر أو غير مباشر على فسيولوجيا الذبابة البيضاء وسلوكها ، مثل البراز4، وطول العمر4، وتفضيل المضيف5،6. وعلاوة على ذلك، ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الذبابة البيضاء ، والفيروسات ، والنباتات ، واكتساب الفيروس

  1. الذباب الأبيض الخلفي (MEAM1) على القطن(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) في أقفاص مقاومة للحشرات في دفيئة عند 26 ± 1 درجة مئوية مع 14:10 ضوء: دورة داكنة و60 ± 10٪ رطوبة نسبية.
  2. إجراء PCR التقليدية على أساس الخلايا الميتوكوندريا البيضاء أوكسيديز الأول الجين لتحديد نقاء السكان الذبابة البيضاء.
    1. جمع 20 الذباب الأبيض الكبار ونقلها بشكل فردي إلى أنبوب PCR تحتوي على 30 ميكرولتر من العازلة الليسيه (10 mM تريس, درجة الحموضة = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol] Tween-20, 0.2% [wt/vol] الجيلاتين, 0.45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/m L Proteinase).
    2. أضف 5-7 حبات خزفية (قطرها....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الذباب الأبيض MEAM1 لمجمع B. tabaci وTYLCV كمثال هنا لوصف الإجراءات. تظهر النظرة العامة لإجراءات الفلور المناعي والقياس الكمي الفيروسي الموصوفة في هذه المخطوطة في الشكل 1. يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية للكشف عن الفلور المناعي لتلطيخ TYLCV وDAPI في PSGs وmidguts والمبيضين ، مما يشير إلى أن TYLCV تراكمت أكثر في PSGs وmidguts ، وأقل في المبيضين. ويبين الشكل 3 الكمية النسبية للفيروس في الـ PSGs الذبابة البيضاء، ومنت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف بروتوكول لتوطين والقياس الكمي لفيروس بيغومو في أنسجة ناقل الذبابة البيضاء من قبل الفلور المناعي وqPCR. تشريح يمثل الخطوة الأولى لتوطين والقياس الكمي للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء. يبلغ طول جسم الذبابة البيضاء حوالي 1 مم ، مما يعني أن الأنسجة صغيرة للغاية ، ومن الصعب تشريحها. إلى جانب ذلك، هناك صلات قوية بين الأنسجة. على سبيل المثال ، ترتبط المبايض بإحكام مع البكتيريا ، مما يجعل من الصعب عزلها. هنا ، وبالنظر إلى خصائص ومواقع الأنسجة المختلفة ، ونحن نصف نهج مختلفة للتشريح. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى الكثير من المما.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنحة: 2017YFD0200600)، والصندوق المخصص لنظام البحوث الزراعية الصيني (رقم المنحة: CARS-23-D07) ومؤسسة بيل وميليندا غيتس (INVESTMENT ID OPP1149777 ). نشكر البروفيسور جيان شيانغ وو لتوفير الأجسام المضادة TYLCV CP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4٪ بارافورمالدهايدمتعدد العلومF0001
4 '، 6-diamidino-2-ph & eacute ؛ نيليندول (DAPI)Abcamab104139
ألبومين مصل الأبقار (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقتالحقيقي Bio-RAD185-5201
الفحص المجهري متحد البؤرZeissLSM800
Dylight 549-goat المضاد للفأرEarthoxE032310-02الجسم المضاد الثانوي
أحادي النسيلة الأجسام المضادة (MAb 1C4)الأجسام المضادة الأولية
للفوسفات المخزن الملحي (PBS)سانجون للتكنولوجيا الحيويةB548119-0500
مجهر ستيريوزايسستيمي 2000-C
TB بريمكس أخضر Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR ماستر ميكس
ThermocyclerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI علوم الحياة9002-93-1
Tween 20BBI علوم الحياة9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles