Method Article

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء أنظمه البروتين المستحث كيميائيا مع التقارب والخصوصية المطلوبة لأي من الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تحتوي علي العديد من تطبيقات الاستشعار البيولوجي والتفعيل. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله وقابله للتعميم للهندسة الهندسية للانظمه المستحثة كيميائيا عن طريق الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية المعروضة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاحداث البروتينية البروتين التي تحدث فقط في وجود الاربطه جزيء صغير وتمكين تطوير الجزيئات الصغيرة الحيوية لتشريح والتلاعب في المسارات البيولوجية. حاليا ، لا يوجد سوي عدد محدود من النظم المستحثة كيميائيا (CID) والهندسة الجديدة مع الحساسية المطلوبة والانتقائية ل يغاندس الجزيئات الصغيرة المحددة لا تزال تشكل تحديا في مجال هندسه البروتين. نقدم هنا وصفا لطريقه الفحص العالية الانتاجيه ، وهي انتخابات المباحث الجنائية التي تجريها شركه دي نوفو للهندسة من أجل الانظمه الجنائية المطبقة علي مجموعه كبيره ومتنوعة من الليغانز. يستخدم هذا الأسلوب الاختيار من خطوتين من مكتبه nanobody التوافقية المعروضة phage للحصول علي 1) "الموثقات مرساه" التي ربط أولا إلى يجند الفائدة ثم 2) "الموثقات ديميريشن" التي تربط فقط لمرساه الموثق-يجند المجمعات. لتحديد الموثقات مرساه ، يتم فحص مكتبه التوافقية من أكثر من 109 التكامل تحديد المنطقة (CDR)-العشوائية nanobodies مع liginylated ويتم التحقق من الإصابات مع الاربطه غير المسمية بواسطة قياس التداخل الطبقة الحيوية (BLI). للحصول علي المجلدات التعريفية ، يتم فحص مكتبه nanobody مع الموثق مرساه-ligand المجمعات كاهداف للفحص الإيجابي والموثقات مرساه غير منضم للفحص السلبي. الجمع بين-CID ينطبق علي نطاق واسع لتحديد المجلدات CID مع الغلوبولين المناعي الأخرى ، غير الغلوبولين المناعي ، أو السقالات مصممه حسابيا لخلق الاستشعار البيولوجي لفي المختبر والجسم الحيوي الكشف عن المخدرات ، والأيض ، والجزيئات الإشارات ، الخ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم CID ، التي اثنين من البروتينات dimerize فقط في وجود الحرف جزيء صغير (الشكل 1) ، وتقدم أدوات متعددة لتشريح والتلاعب الأيض ، والإشارات ، وغيرها من المسارات البيولوجية1. وقد أظهرت القدرات في التشغيل البيولوجي, مثل المخدرات التي تسيطر عليها التنشيط الخلية t2 والمبرمج3,4, لتحسين سلامه وفعالية العلاج الخلوي t التبني. الاضافه إلى ذلك ، فانها توفر منهجيه جديده للكشف عن أهداف الجزيئات الصغيرة في الجسم المجري أو في المختبر. علي سبيل المثال ، يمكن ان تكون البروتينات CID تنصهر وراثيا مع نظم مراسل مضان (علي سبيل المثال ، نقل الطاقة بالرنين ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-بناء المكتبات

  1. استخدام مكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية الاصطناعية مع تنوع من ~ 1.23 – 7-14 x 109، كما هو موضح سابقا19. علي الرغم من ان هذا البروتوكول لا يتضمن إنشاء المكتبة ، الا انه يمكن تطبيقه علي مكتبات موثقه أخرى للدمج.

2-التعكر الحيوي للهدف أو اليجند

  1. الحيوية المحددة ، علي سبيل المثال ، CBD و تتراهيدروكانابينول (THC)19، عن طريق استراتيجيات التوليف الكيميائية المختلفة ، اعتمادا علي مواقع الحيوية المناسبة للهدف.

3. مرساه الموثق الفرز

  1. بداية الاختيار
    1. تبدا كل جولة من الاختيار عن طريق تلقيح مس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نوضح الاختيار من خطوتين في المختبر والتحقق من الموثقات مرساه والتهجين من خلال فحص مكتبه nanobody التوافقية مع تنوع اعلي من 109 باستخدام اتفاقيه التنوع البيولوجي كهدف. ومن المهم تقييم إثراء القرصنة البيولوجية خلال الجولات المتعاقبة من الاختيار لكل من المرساة والمجلدات الثنائية. نتائج الإثراء النموذجية بعد 4-6 جولات من الاختيار كما هو مبين في الشكل 5 هي مؤشر جيد علي ان هناك نسبه عاليه من الزيارات المحتملة في المكتبات الفرعية ، لذلك قد لا يكون من الضروري اجراء جولات اضافيه من ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن المهم لاختيار التركيزات الصحيحة من المكتبات بالعاثيه الإدخال لجولات مختلفه من القرصنة البيولوجية. بدانا عاده من مكتبه المدخلات من ~ 1012-1013 الجسيمات بالعاثيه مع التنوع > 109، والسماح ~ 100-1000 نسخه من كل استنساخ بالعاثيه ليتم تقديمها في السحب إلى أسفل المقايسة. إذا كان التركيز بالعاثيه في مقايسة ملزمه مرتفعه جدا أو منخفضه ، فان احتمال الربط غير المحدد أو فقدان الاستنساخ الايجابيه سوف تزيد. المرساة أو الاختيار الموثق يتكون عاده من ثلاث إلى ست جولات من القرصنة البيولوجية ، والتهم الن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد قدمت جامعه واشنطن براءة اختراع مؤقته تتعلق بهذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزه جامعه واشنطن للابتكار (إلى L.G.) ، وهي منحه من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (1R35GM128918 إلى L.G.) ، وصندوق لبدء التشغيل من جامعه واشنطن (إلى L.G.). وقد تم دعم اتش جي) من قبل الزمالة الجامعية لمؤسسه واشنطن للأبحاث. وقد تم دعم K.W. من قبل زمالة جامعيه من معهد جامعه واشنطن لتصميم البروتين.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra TMB ELISA محلول الركيزةThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي (قطع 3 كيلو دالتون)ميليبورUFC900324
أمبيسلينثيرمو فيشر ScientificBP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad5000002
BirA مجموعة التفاعل القياسية للبروتين البيوتين ليجازAvidityBirA500
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما-ألدريتشA2153-50G
الكازينسيجما-ألدريتشC7078-1KG
CM13مختبرات تصميم الأجسام المضادةPH020L
D- (+) - الجلوكوز أحادي الهيدراتألفا إيسارA11090
Dynabeads M-280 StreptavidinThermo Fisher Scientific11205D
DynaMag-2 مغناطيسثيرمو فيشر العلمي12321D
EDTAثيرمو فيشر العلميBP120-1
سلم الحمض النووي السريعنيو إنجلاند بيولابسN3238S
FastDigest BglIثيرمو فيشر العلميFD0074
الجلسرينثيرمو فيشر العلميBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 Desalting ColumnHealthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazoleAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 الجسم المضاد لبروتين المعطفالرئيسي سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000 / 2000c مقاييس الطيفالحرارية فيشر العلميةND-2000
NUNC 96-Well البولي بروبيلين DeepWell لوحات التخزينThermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN / A
pADL-23cمختبرات تصميم الأجسام المضادةPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymeraseطقم تنقية Invitrogen12351010
PureLink PCRThermo Fisher ScientificK310001
QIAprep Spin M13 KitQiagen27704
Recovery MediumLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384جهاز جزيئيغير متوفر في
السكروزسيجما-ألدريتشS0389-1KG
سوبر ستربتافيدين (SSA) المستشعرات الحيويةForteBio18-5057
Superdex 75 زيادة 10/300 GL العمودGE Healthcare28-9909-44
T4 DNA LigaseThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 الخلايا ذات الكفاءة الكهربائيةLucigen60502-1
TriethylamineSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptoneThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
مستخلص الخميرةThermo Fisher ScientificBP1422-2
Zeba Spin Desalting ColumnThermo Fisher Scientific89882
العاثية المساعدة GE الضوئي للناقلات Phagemid

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemically Induced DimerizationPhage Display SelectionCombinatorial Nanobody LibraryAnchor BindersDimerization BindersBio Layer InterferometryStreptavidin Coated BeadsCompetitive ElutionSingle Clone ELISASize Exclusion Chromatography

Related Articles