يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زرع الجراثيم البرازية والكشف عن انتشار البكتيريا المغلفة ب IgA في الأمعاء

3.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60772

⸱

يوليو 23, 2020

 ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Sciences, Nanjing University

في هذه المقالة

ملخص

أنشأنا طريقة فعالة لاستنفاد البكتيريا المعوية في ثلاثة أيام ، وبعد ذلك زرع الجراثيم البرازية عن طريق تزقيم السائل البرازي المحضر من محتويات الأمعاء الطازجة أو المجمدة في الفئران. نقدم أيضا طريقة محسنة للكشف عن تواتر البكتيريا المغلفة ب IgA في الأمعاء.

الملخص

تمارس ميكروبات الأمعاء أدوارا متعددة الاتجاهات في صحة الإنسان وأمراضه. زرع الجراثيم البرازية (FMT) هي طريقة فعالة للتحقيق في الوظيفة البيولوجية للبكتيريا المعوية ككل أو على مستوى الأنواع. تم نشر عدة طرق مختلفة لاختبار FMT. هنا ، نقدم بروتوكول FMT الذي يستنفد بنجاح ميكروبات الأمعاء في غضون أيام ، يليه زرع الجراثيم البرازية من محتويات الأمعاء الطازجة أو المجمدة للمتبرعين إلى الفئران التقليدية. يتم تطبيق Real Time-PCR لاختبار فعالية استنفاد البكتيريا. ثم يتم تطبيق تسلسل الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S (rRNA) لاختبار الوفرة النسبية وهوية ميكروبات الأمعاء في الفئران المتلقية. نقدم أيضا طريقة الكشف القائمة على قياس التدفق الخلوي للبكتيريا المغلفة بالغلوبولين المناعي A (IgA) في الأمعاء.

المقدمة

تلعب ميكروبات الأمعاء المتنوعة دورا رئيسيا في الحفاظ على توازن المضيف. يساعد هذا الميكروبيوم في العمليات الفسيولوجية المختلفة التي تتراوح من الهضم وامتصاص العناصر الغذائية من الطعام ، والدفاع ضد عدوى مسببات الأمراض ، وتنظيم نمو الجهاز المناعي ، والتوازن المناعي1. تم ربط الاضطراب في التركيب الميكروبي للأمعاء بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان2 ، وأمراض المناعة الذاتية3 ، ومرض التهاب الأمعاء4 ، والأمراض العصبية5 ، وأمراض التمثيل الغذائي6،7. الفئران الخالية من الجراثيم (GF) هي أدوات قوية في نماذج زرع الجراثيم البرازية لدراسة التأثيرات البيولوجية للميكروبات8. ومع ذلك ، فإن بيئة سكن GF صارمة للغاية ، وإجراء زرع الجراثيم البرازية (FMT) في هذه الفئران مكلف. علاوة على ذلك ، تتمتع الفئران GF بخصائص حاجز ومخاطية مختلفة ، والتي تنظم اختراق البكتيريا ، مقارنة بالفئران التقليدية9. هذه العوامل تحد من التطبيق الواسع لفئران GF في الدراسات. بديل لاستخدام الفئران GF هو استنفاد الجراثيم في الفئران التقليدية باستخدام كوكتيل مضاد حيوي متبوعا ب FMT. وأساليب FMT المبلغ عنها سابقا ليست موصوفة جيدا وغير متسقة؛ لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول مجدي وفعال وقابل للتكرار لأداء FMT باستخدام الفئران التقليدية.

هناك عدة خطوات حاسمة لنجاح معاهدة وقف إنتاج المواد الانشطارية. كفاءة استنفاد الجراثيم هي الخطوة الأولى المهمة. بالنسبة لاستنفاد البكتيريا ، تم الإبلاغ عن استخدام مضاد حيوي واحد واسع الطيف (على سبيل المثال ، ستربتومايسين10) أو كوكتيل مضاد حيوي (علاج ثلاثي أو رباعي بالمضادات الحيوية)11،12. تم العثور على العلاج بالمضادات الحيوية الرباعية بما في ذلك الأمبيسلين والميترونيدازول والنيومايسين والفانكومايسين ، ليكون النظام الأكثر فعالية وقد تم استخدامه في العديد من الدراسات13 ، 14 ، 15. بالإضافة إلى نوع المضاد الحيوي المستخدم ، يؤثر طريق إعطاء المضادات الحيوية وجرعته ومدته على فعالية استنفاد البكتيريا. بعض الباحثين يطبقون المضادات الحيوية في مياه الشرب للقضاء على البكتيريا في الجهاز الهضمي15. ومع ذلك ، من الصعب التحكم في جرعة المضادات الحيوية التي يتلقاها كل فأر بهذه الطريقة. لذلك ، في الدراسات اللاحقة ، عالج الباحثون الفئران بالمضادات الحيوية عن طريق التزقيم الفموي لمدة 1-2 أسبوع12 لتحقيق استنفاد مرض. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الاستخدام طويل الأمد للمضادات الحيوية مشكلة ، حيث أن المضادات الحيوية نفسها قد تؤثر على بعض الأمراض في نماذج القوارض16. لذلك ، هناك ما يبرر طرق أسرع وأكثر كفاءة لاستنفاد الجراثيم.

يعد تحضير السائل البرازي خطوة رئيسية أخرى لضمان نجاح FMT. في الجهاز الهضمي ، يتراوح الرقم الهيدروجيني من 1 في المعدة إلى 7 في الأمعاء القريبة والبعيدة9. الكائنات الحية الدقيقة في المعدة محدودة بسبب الحموضة العالية وتشمل هيليكوباكتر بيلوري17. تنتج الأمعاء القريبة حمض صفراوي للدورة الدموية في الكبد والأمعاء ، وتحتوي على الجراثيم المرتبطة بهضم الدهون والبروتين والجلوكوز. يحتوي الجهاز المعوي البعيد على بكتيريا لاهوائية وفيرة ويظهر تنوعا ميكروبيا عاليا18. نظرا لعدم التجانس المكاني لميكروبات الأمعاء ، من الضروري عزل محتويات الأمعاء من مناطق مختلفة من الأمعاء لتحضير السائل البرازي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العوامل الأخرى ، بما في ذلك طبيعة عينة المتبرع (على سبيل المثال ، العينة الطازجة أو المجمدة) ، وتكرار الزرع ، والمدة ضرورية عند إجراء FMT. يستخدم البراز المجمد بشكل شائع لاستعمار الفئران التقليدية بميكروبات الأمعاءالبشرية 19. في المقابل ، فإن FMT باستخدام البراز الطازج من المتبرعين بالحيوانات هو أكثر ملاءمة ويستخدم بشكل شائع في النماذج الحيوانية20،21. يختلف تردد FMT ومدته اعتمادا على التصميم التجريبي والنماذج. في الدراسات السابقة ، تم إجراء FMT إما يوميا أو كل يومين. تراوحت مدة الزرع من 3 أيامو 22 إلى 5 أسابيعو 23. بالإضافة إلى العوامل المذكورة أعلاه ، يعد الحفاظ على بيئة جراحية معقمة واستخدام الأدوات الجراحية المعقمة أمرا بالغ الأهمية لتجنب التلوث البكتيري البيئي غير المتوقع.

ميكروبات الأمعاء لديها القدرة على تنظيم تراكم الخلايا التي تعبر عن الغلوبولين المناعي A (IgA). IgA ، وهو نمط متماثل سائد للأجسام المضادة ، أمر بالغ الأهمية في حماية المضيف من العدوى من خلال التحييد والاستبعاد. يتم نقل IgA عالي التقارب إلى تجويف الأمعاء ويمكنه ربط مسببات الأمراض المخالفة وتغطيتها. في المقابل ، قد يوفر الطلاء باستخدام IgA ميزة استعمار للبكتيريا24. على عكس IgA الناجم عن مسببات الأمراض ، فإن IgA الأصلي الذي يسببه التوافق لديه تقارب وخصوصية أقل25. تم الإبلاغ عن زيادة نسبة البكتيريا المعوية المغلفة ب IgA بشكل كبير في بعض الأمراض25،26. يمكن للبكتيريا المطلية ب IgA أن تبدأ حلقة ردود فعل إيجابية لإنتاج IgA27. لذلك ، يمكن للمستوى النسبي للبكتيريا المغلفة ب IgA أن يتنبأ بحجم الاستجابة الالتهابية في الأمعاء. في الواقع ، يمكن اكتشاف هذا المزيج عن طريق قياس التدفقالخلوي 28. باستخدام الفرز المستند إلى IgA ، اكتسب Floris et al.27 و Palm et al.25 و Andrew et al.29 بكتيريا IgA + و IgA- البراز من الفئران وتميزوا بالجراثيم المعوية المطلية بالأصناف عبر تسلسل 16S rRNA.

في هذه الدراسة ، نصف طريقة محسنة لاستنفاد البكتيريا المعوية السائدة بكفاءة واستعمار الفئران التقليدية باستخدام الجراثيم البرازية الطازجة أو المجمدة المعزولة من محتويات الدقاق والقولون. نعرض أيضا طريقة تعتمد على قياس التدفق الخلوي للكشف عن البكتيريا المرتبطة ب IgA في الأمعاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت التجارب على وفقا للوائح الأخلاقية الحالية لرعاية واستخدامها في الصين.

ملاحظة: تم إيواء في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، وخاضعة للرقابة تحت دورات ضوئية ومظلمة لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية. تم تشعيع الطعام قبل إطعامه للفئران. تم تعقيم مياه الشرب والأقفاص قبل الاستخدام. تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع في الدراسة بعد أسبوع واحد من التأقلم. تم تقسيمهم إلى عدة مجموعات بناء على تصميم التجربة. تتكون كل مجموعة من ثلاثة فئران على الأقل.

1. استنفاد ميكروبات الأمعاء

  1. تحضير كوكتيل المضادات الحيوية
    1. تحضير محلول مضاد حيوي في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم (PBS) مع 0.5 مجم / مل فانكومايسين هيدروكلوريد ، 1 مجم / مل ميترونيدازول ، 1 مجم / مل ملح أمبيسلين الصوديوم ، و 1 مجم / مل كبريتات نيومايسين.
      ملاحظة: قم بتخزين المضادات الحيوية في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية وتجنب الضوء المباشر. تحضير محلول كوكتيل المضادات الحيوية طازجا واستخدمه على الفور.
  2. نظام العلاج
    1. لمدة 3 أيام ، قم بإعطاء 200 ميكرولتر من كوكتيل المضادات الحيوية المحضرة عن طريق الفم بإبرة # 10 في الفأر. أمسك الماوس عموديا بيد واحدة أثناء استخدام اليد الأخرى لضبط زاوية الإبرة لتجنب الوصول إلى المعدة.
      ملاحظة: يجب التعامل مع الماوس برفق لتجنب المعاناة ، لأن تلف سطح المريء والمعدة قد يؤدي إلى التهاب أو الوفاة.
    2. أضف المضادات الحيوية إلى مياه الشرب بنفس التركيزات الموضحة في الخطوة 1.1.1.
    3. بعد ثلاثة أيام ، ضحي بالفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 .
    4. تشريح البطن بشكل معقم باستخدام أدوات معقمة. على مسافة 2 سم من الرأس ، قم بقطع مسار 2 سم من الدقاق. باستخدام ملاقط معقمة لإغلاق أحد طرفي المسالك ، قم بضغط المحتويات الطازجة من المسالك في أنابيب موزونة مسبقا.
    5. لجمع محتويات الأعور ، قم بقصه إلى نصفين بمقص جراحي. اضغط على محتويات كل نصف من الأعور في أنابيب موزونة مسبقا.
  3. تقييم فعالية استنفاد ميكروبات الأمعاء.
    1. قم بوزن محتويات الأمعاء المعزولة من الدقاق أو الأعور من الفئران الساذجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، واستخرج الحمض النووي لميكروبات البراز باستخدام مجموعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حدد تركيز الحمض النووي وفقا للصيغة:

      عينة التركيز (ميكروغرام / مل) = OD260 × 50
       
    2. بناء منحنى قياسي.
      1. تضخيم جينات الإشريكية القولونية بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات محددة V3-V4. الطبيعة المسبقة عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، تضخيم لمدة 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      2. قم ببناء بلازميد عن طريق ربط المنتج المضخم بناقل TA. استنساخ الثقافة باستخدام مجموعة ناقلات TA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. قياس تركيز البلازميد (نانوغرام/ميكرولتر) استنادا إلى قيمة OD260 كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
        ملاحظة: تختلف وحدة تركيز البلازميد عن وحدة تركيز الحمض النووي.
      4. احسب أرقام النسخ باستخدام الصيغة التالية ، حيث يرمز MW إلى الوزن الجزيئي:

        نسخ في 1 ميكرولتر = تركيز (نانوغرام / ميكرولتر) × 10-9 × 6.02 × 1023 / (ميغاواطبلازميد × 660)
         
      5. أعد تكوين البلازميد بالماء المقطر المزدوج إلى تركيز نهائي قدره 40 ميكروغرام / ميكرولتر. قم بإعداد سلسلة تخفيف متدرج 10x مع ثماني مراحل. قم ببناء منحنى قياسي عن طريق رسم قيمة CT (المحور Y) مقابل السجل (نسخالبلازميد) (المحور X) بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث يرمز CT إلى دورة العتبة لتضخيم الهدف. استخرج المعادلة من المؤامرة (في هذه الحالة ، كانت y = -3.07x + 45.07 ، R2 = 0.994).
    3. تضخيم 1 ميكرولتر من عينات الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.1 المستخرجة من الدقاق أو الأعور من مجموعة تحكم ساذجة ومجموعة علاج كوكتيل المضادات الحيوية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي كما هو موضح في الخطوة 1.3.2.1. احسب رقم النسخة في 1 ميكرولتر من عينات الحمض النووي بناء على المنحنى القياسي في الخطوة 1.3.2.5 ثم احسب إجمالي رقم النسخة باستخدام الصيغة التالية:
      إجمالي عدد النسخ (لكل ملغ) في العينات المرجحة = أرقام النسخ × إجمالي حجم الحمض النووي / الوزن الأولي للعينة
  4. قم بتحليل الحمض النووي للميكروبات عن طريق تسلسل مناطق 16S rRNA V3 و V4.

2. زرع الجراثيم البرازية

  1. تحضير السائل البرازي لكل من عينات البراز الطازج والمجمد
    ملاحظة: يتم نقع جميع الأدوات في 75٪ كحول قبل الاستخدام لتجنب التلوث البكتيري الموجود مسبقا. من الأهمية بمكان تجنب التلوث عند جمع محتويات الدقاق والقولون.
    1. التضحية ب 3-5 فئران متبرعة بالاختناق بثاني أكسيد الكربون2 .
    2. اجمع محتويات الدقاق كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
    3. لجمع المحتويات في القولون ، قم بعمل الشق الأول بالقرب من فتحة الشرج وقطع المسالك العلوية 2 سم. استخرج المحتويات كما هو موضح في الخطوة 1.2.4. اجمع العينات في 1 دقيقة لتقليل التعرض للهواء.
    4. بالنسبة للسائل البرازي المجمد ، اجمع محتويات الدقاق أو القولون كما هو موضح في الخطوتين 2.1.2 و 2.1.3 ، وقم بتجميد المحتويات في النيتروجين السائل بسرعة.
    5. قم بتخزين العينات في فريزر -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  2. تجمع ووزن المحتويات ، أضف أنابيب معقمة جديدة مع الخرز. بالنسبة للعينات المجمدة ، قم بإذابة الكريات البرازية على الجليد قبل وزنها.
  3. أضف PBS معقما في الأنبوب وأعد تعليق الكريات البرازية في PBS (1 مل من PBS / 0.2 جم من الحبيبات البرازية) باستخدام إبرة حقنة سعة 5 مل. قم بتجانس الحبيبات البرازية تماما بالخرز والدوامة 3x لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
  4. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق ، ثم قم بتصفية المواد الطافية عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر. اجمع السائل البرازي المصفى في أنبوب معقم واستخدمه لعلاج FMT على الفور.

3. إجراء زرع الجراثيم البرازية

  1. قم بإعطاء 200 ميكرولتر من السائل البرازي المحضر للفئران المستنفدة للميكروبات عن طريق التزقيم الفموي كل يومين لمدة 7 أيام. فئران التحكم في التزقيم مع 200 ميكرولتر من PBS المعقم.
  2. ضحية الفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون2 وحصاد المحتويات من الدقاق والقولون وفقا للخطوتين 2.1.2 و 2.1.3. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  3. استخرج الحمض النووي للميكروبات من محتويات الدقاق والقولون كما هو موضح في الخطوة 1.3.1. تحقق من تكوين الجراثيم في أمعاء الفئران المزروعة عن طريق تسلسل 16S rRNA.

4. قياس البكتيريا المطلية ب IgA

  1. تحضير العينة
    1. اجمع 50 مجم من الكريات البرازية من الفئران المانحة كما هو موضح في الخطوتين 2.1.2 و 2.1.3 ، واحتضان في 1 مل من PBS المعقم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. تجانس الكريات باستخدام مضرب حبة لمدة 5 ثوان.
    2. جهاز الطرد المركزي المحلول عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية بعد الترشيح من خلال مصفاة 70 ميكرومتر.
      ملاحظة: تجنب الطرد المركزي عالي السرعة.
    3. أضف 5 ميكرولتر من المادة الطافية إلى 1 مل من ألبومين مصل الأبقار 1٪ (BSA) في PBS (المخزن المؤقت FACS). بيليه عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
    4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
      ملاحظة: قد تحتاج وحدة التخزين المستخدمة هنا إلى التحسين. قد يخفي الكثير من المادة الطافية في هذه الخطوة الإشارة الإيجابية للبكتيريا المغلفة ب IgA.
    5. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10٪ مصل الماعز واحتضانها على الثلج أو عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS في الأنبوب وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى الحبيبات.
  2. قياس التدفق الخلوي
    1. أعد تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1.5 مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على جسم مضاد IgA مضاد للبيوتين مضاد للفأر (1: 100) وجسم مضاد مضاد للبيوتين مترافق مع APC (1: 100) واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS في الأنبوب وجهاز الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
    3. قم بتلطيخ الحبيبات من الخطوة 4.2.2 بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على صبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر (1: 200) واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS والطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى الحبيبات.
    5. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS قبل القياس.
    6. احصل على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي وقم بتحليلها باستخدام برنامج FlowJo.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تحديد جدول FMT المستخدم في هذه الدراسة في الشكل 1. بعد العلاج بكوكتيل المضادات الحيوية ، تم تحليل كفاءة استنفاد الجراثيم المعوية عن طريق تسلسل منطقة 16S rRNA. اكتشفنا 196 نوعا في دقاق الفئران الساذجة ، في حين أن العلاج بالمضادات الحيوية لمدة 3 أيام قلل بسرعة من الأنواع البكتيرية إلى 35 (الشكل 2 أ). تم اكتشاف ثمانية أنواع فقط في الفئران التي خضعت للعلاج بالكوكتيل بالمضادات الحيوية (الشكل 2 أ). أشار تحليل تنوع بيتا على مستوى الجنس ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المضادات الحيوية المستخدمة في إجراء النضوب لها خصائص مختلفة مضادة للبكتيريا. فانكومايسين خاص بالبكتيريا موجبةالجرام 30. يمكن أن يؤدي الدوكسيسيكلين عن طريق الفم إلى تغييرات كبيرة في تكوين الجراثيم المعوية في إناث الفئران C57BL / 6NCrl31. Neomycin هو مضاد حيوي واسع الطيف يستهدف معظم البكتيريا المقيمة فيالأمعاء 32. ومع ذلك ، فإنه لا يمنع التهاب الأمعاء. تعتبر كوكتيلات المضادات الحيوية واسعة الطيف أكثر فعالية من مضاد حيو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية المشروع المتميز متعدد التخصصات لمستشفى غرب الصين وجامعة سيتشوان (Grant Nr: ZYJC18024) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة: 81770101 و 81973540).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5 مل حقنة إبرةشنغ قوانغ التكنولوجيا الحيوية5 مل
70 & مصفاة الخلايا mBD Biosciences352350
ملح الصوديومأمبيسيلين AMERESCO0339
APC StreptavidinBD Biosciences554067
البيوتين المضاد للفأر IgA الجسم المضادBiolegend407003
الأبقار ألبيومين (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL / 6J الفئرانتشنغدو داشو
CO2< / sub>Xiyuan التكنولوجيا
E.Coil الجينوم DNATsingKe
Eppendorf أنابيبAxygenMCT150-C
براز الحمض النووي السريع كتيب صغيرQIAGEN51604
MetronidazoleShyuanyeS17079-5g
كبريتات نيومايسينSIGMAN-1876
إبرة التزقيم عن طريق الفمYuke biotech10 #
pClone007 مجموعة ناقلات TA بسيطة متعددة الاستخداماتTsingKe007VS
محلول ملحي للفوسفات (PBS)طقمLycloneSH30256
PrecellysPrecellys PrecellysKT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC أخضر صبغة الحمض النووي الفلوريةالحرارية فيشر العلميةS34855
V338 F التمهيديTsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R التمهيديTsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochlorideSigmaV2002
Equipments< / strong>
BD FACSتدفق كاليبور مقياس الخلويBD العلوم الحيوية
الخرز الخافق vortxScilogex
BIORAD CFX Connectآلة
الطرد المركزيEppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop آلة قياسات الحمض النوويThermo fisher العلمية
الأدوات الجراحيةYuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015إصدار 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA
مصل الحيوية

المراجع

  1. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  2. Weng, M. T., et al. Microbiota and gastrointestinal cancer. Journal of the Formosan Medical Association. 118 (1), 32-41 (2019).
  3. Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
  4. Lankelma, J. M., Nieuwdorp, M., de Vos, W. M., Wiersinga, W. J. The gut microbiota in internal medicine: implications for health and disease. Netherlands Journal of Medicine. 73 (2), 61-68 (2015).
  5. Soto, M., et al. Gut microbiota modulate neurobehavior through changes in brain insulin sensitivity and metabolism. Molecular Psychiatry. 23, 2287-2301 (2018).
  6. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  7. Le Roy, T., et al. Intestinal microbiota determines development of non-alcoholic fatty liver disease in mice. Gut. 62 (12), 1787-1794 (2013).
  8. Anhe, F. F., et al. Treatment with camu camu (Myrciaria dubia) prevents obesity by altering the gut microbiota and increasing energy expenditure in diet-induced obese mice. Gut. 68 (3), 453-464 (2019).
  9. Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS ONE. 6 (3), 17996(2011).
  10. Bao, H. D., et al. Alterations in the diversity and composition of mice gut microbiota by lytic or temperate gut phage treatment. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (23), 10219-10230 (2018).
  11. Ishikawa, D., et al. The Microbial Composition of Bacteroidetes Species in Ulcerative Colitis Is Effectively Improved by Combination Therapy With Fecal Microbiota Transplantation and Antibiotics. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2590-2598 (2018).
  12. Samuelson, D. R., et al. Alcohol-associated intestinal dysbiosis impairs pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006426(2017).
  13. Cho, Y., et al. The Microbiome Regulates Pulmonary Responses to Ozone in Mice. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (3), 346-354 (2018).
  14. Kang, C., et al. Gut Microbiota Mediates the Protective Effects of Dietary Capsaicin against Chronic Low-Grade Inflammation and Associated Obesity Induced by High-Fat Diet. MBio. 8 (3), (2017).
  15. Kaliannan, K., Wang, B., Li, X. Y., Kim, K. J., Kang, J. X. A host-microbiome interaction mediates the opposing effects of omega-6 and omega-3 fatty acids on metabolic endotoxemia. Scientific Reports. 5, 11276(2015).
  16. Dapito, D. H., et al. Promotion of hepatocellular carcinoma by the intestinal microbiota and TLR4. Cancer Cell. 21 (4), 504-516 (2012).
  17. Hold, G. L., Hansen, R. Impact of the Gastrointestinal Microbiome in Health and Disease: Co-evolution with the Host Immune System. Current Topics in Microbiology and Immunology. 421, 303-318 (2019).
  18. Suzuki, T. A., Nachman, M. W. Spatial Heterogeneity of Gut Microbial Composition along the Gastrointestinal Tract in Natural Populations of House Mice. PLoS ONE. 11 (9), 0163720 (2016).
  19. McDonald, J. A. K., et al. Inhibiting Growth of Clostridioides difficile by Restoring Valerate, Produced by the Intestinal Microbiota. Gastroenterology. 155 (5), 1495-1507 (2018).
  20. Ramai, D., Zakhia, K., Ofosu, A., Ofori, E., Reddy, M. Fecal microbiota transplantation: donor relation, fresh or frozen, delivery methods, cost-effectiveness. Annals of Gastroenterology. 32 (1), 30-38 (2019).
  21. Hu, J., et al. Standardized Preparation for Fecal Microbiota Transplantation in Pigs. Frontiers in Microbiology. 9, 1328(2018).
  22. Tian, H. L., et al. Treatment of Slow Transit Constipation With Fecal Microbiota Transplantation: A Pilot Study. Journal of Clinical Gastroenterology. 50 (10), 865-870 (2016).
  23. Wong, S. H., et al. Gavage of Fecal Samples From Patients with Colorectal Cancer Promotes Intestinal Carcinogenesis in Germ-free and Conventional Mice. Gastroenterology. 153 (6), 1621-1633 (2017).
  24. Macpherson, A. J., Yilmaz, B., Limenitakis, J. P., Ganal-Vonarburg, S. C. IgA Function in Relation to the Intestinal Microbiota. Annual Review of Immunology. 26 (36), 359-381 (2018).
  25. Palm, N. W., et al. Immunoglobulin a coating identifies colitogenic bacteria in inflammatory bowel disease. Cell. 158 (5), 1000-1010 (2014).
  26. Asquith, M., et al. Perturbed mucosal immunity and dysbiosis accompany clinical disease in a rat model of spondyloarthritis. Arthritis Rheumatology. 68 (9), 2151-2162 (2016).
  27. Fransen, F., et al. BALB/c and C57BL/6 Mice Differ in Polyreactive IgA Abundance, which Impacts the Generation of Antigen-Specific IgA and Microbiota Diversity. Immunity. 43 (3), 527-540 (2015).
  28. Bunker, J. J., et al. Innate and Adaptive Humoral Responses Coat Distinct Commensal Bacteria with Immunoglobulin A. Immunity. 43 (3), 541-553 (2015).
  29. Kau, A. L., et al. Functional characterization of IgA-targeted bacterial taxa from undernourished Malawian children that produce diet-dependent enteropathy. Science Translational Medicine. 7 (276), 224(2015).
  30. Serri, A., Mahboubi, A., Zarghi, A., Moghimi, H. R. PAMAM-dendrimer Enhanced Antibacterial Effect of Vancomycin Hydrochloride Against Gram-Negative Bacteria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 22 (1), 10-21 (2018).
  31. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644(2017).
  32. Le Bastard, Q., et al. Fecal microbiota transplantation reverses antibiotic and chemotherapy-induced gut dysbiosis in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6219(2018).
  33. Harris, V. C., et al. Effect of Antibiotic-Mediated Microbiome Modulation on Rotavirus Vaccine Immunogenicity: A Human, Randomized-Control Proof-of-Concept Trial. Cell Host Microbe. 24 (2), 197-207 (2018).
  34. Nakamura, S., et al. Antimicrobial susceptibility of Clostridium difficile from different sources. Microbiology and Immunology. 26 (1), 25-30 (1982).
  35. Robertson, S. J., et al. Comparison of Co-housing and Littermate Methods for Microbiota Standardization in Mouse Models. Cell Reports. 27 (6), 1910-1919 (2019).
  36. Chagwedera, D. N., et al. Nutrient Sensing in CD11c Cells Alters the Gut Microbiota to Regulate Food Intake and Body Mass. Cell Metabolism. 30 (2), 364-373 (2019).
  37. Truax, A. D., et al. The Inhibitory Innate Immune Sensor NLRP12 Maintains a Threshold against Obesity by Regulating Gut Microbiota Homeostasis. Cell Host Microbe. 24 (3), 364-378 (2018).
  38. Li, Y., et al. Gut microbiota dependent anti-tumor immunity restricts melanoma growth in Rnf5(-/-) mice. Nature Communications. 10, 16(2019).
  39. Tian, Z., et al. Beneficial Effects of Fecal Microbiota Transplantation on Ulcerative Colitis in Mice. Digestive Diseases and Sciences. 61 (8), 2262-2271 (2016).
  40. Tang, G., Yin, W., Liu, W. Is frozen fecal microbiota transplantation as effective as fresh fecal microbiota transplantation in patients with recurrent or refractory Clostridium difficile infection: A meta-analysis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 88 (4), 322-329 (2017).
  41. Satokari, R., Mattila, E., Kainulainen, V., Arkkila, P. E. Simple faecal preparation and efficacy of frozen inoculum in faecal microbiota transplantation for recurrent Clostridium difficile infection--an observational cohort study. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 41 (1), 46-53 (2015).
  42. Takahashi, M., et al. Faecal freezing preservation period influences colonization ability for faecal microbiota transplantation. Journal of Applied Microbiology. 126 (3), 973-984 (2019).
  43. Wos-Oxley, M. L., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
  44. Le Roy, T., et al. Comparative Evaluation of Microbiota Engraftment Following Fecal Microbiota Transfer in Mice Models: Age, Kinetic and Microbial Status Matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289(2018).
  45. Wrzosek, L., et al. Transplantation of human microbiota into conventional mice durably reshapes the gut microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 6854(2018).
  46. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5 (1), 87(2017).
  47. Cao, H., et al. Dysbiosis contributes to chronic constipation development via regulation of serotonin transporter in the intestine. Scientific Reports. 7 (1), 10322(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

16S rRNA
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.