Method Article

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تميزت سلوك جزيء واحد تحت اضطراب الميكانيكية على نطاق واسع لفهم العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن أساليب مثل المجهر للقوة الذرية لها دقة زمنية محدودة ، في حين أن نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) يسمح فقط بالاستدلال على التشوهات. من ناحية أخرى ، يسمح المجهر المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي في التصور الموقعي لجزيئات واحدة في ظروف التدفق المختلفة. يصف بروتوكولنا خطوات التقاط التغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية المفردة تحت بيئات تدفق القص المختلفة باستخدام المجهر الفلوري. يتم إنشاء تدفق القص داخل قنوات microfluidic ويسيطر عليها مضخة حقنة. كعروض للطريقة ، يتم تسمية عامل فون ويلبراند (VWF) والحمض النووي لامدا مع البيوتين والفلوروفور ثم يتم شل حركتها على سطح القناة. يتم رصد التشكيلات باستمرار تحت تدفق القص المتغير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) والمجهر المجهري الفلوري المعتري. ديناميات تفكك عكسها من VWF مفيدة لفهم كيفية تنظيم وظيفتها في الدم البشري، في حين أن تشكيل الحمض النووي لامدا يقدم رؤى في الفيزياء الحيوية للجزيئات الكبيرة. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدراسة سلوك البوليمرات، وخاصة البوليمرات الحيوية، في ظروف التدفق المختلفة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد درست على نطاق واسع آليات كيفية استجابة الجزيئات الحيوية للمحفزات البيئية. في بيئة التدفق على وجه الخصوص ، تنظم قوى القص والطول المدى التغيرات التشكيلية وربما وظيفة الجزيئات الحيوية. ومن الأمثلة النموذجية على ذلك كشف الحمض النووي لامدا وفون ويلبراند (VWF) الناجم عن القص. وقد استخدمت الحمض النووي لامبدا كأداة لفهم ديناميات تشكيلية من سلاسل البوليمر الفردية ومرنة وrheology من حلول البوليمر1،2،3،4. VWF هو مستشعر التدفق الطبيعي الذي يجمع الصفائح الدموية في مواقع الجروح في الأوعية الدموية مع معدلات القص غير الطبيعية وأنماط التدفق. كشف VWF أمر ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد VWF

  1. إعادة تشكيل البلازما البشرية VWF لإعداده لردود الفعل وضع العلامات. أضف 100 ميكرولتر من الماء المغليون (DI) إلى 100 ميكروغرام من VWF المنفّه لإنشاء محلول مخزون VWF 1 ملغم/مل.
  2. Dialyze VWF حل الأسهم من أجل إزالة الجليسين الزائد، وبالتالي زيادة كفاءة وضع العلامات البيوتين والفلوروفور.
    1. نقل 50 ميكرولتر من محلول مخزون VWF إلى وحدة غسيل كلوي 0.1 مل مع 10000 قطع الوزن الجزيئي وختم مع غطاء. تخزين حل الأسهم المتبقية في -20 درجة مئوية. سوف تكون مستقرة مخزون VWF لمدة تصل إلى 1 سنة في -20 درجة مئوية.
    2. تشغيل غسيل الكلى في 500 مل من 1x الفوسفات المعقم المالحة (PBS) (0.01 M فوسفات ديسيوم، 0.0018 فوسفات أحادي البوتاسيوم، 0.0027 M كلوري....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية مثل VWF والحمض النووي لامدا يعتمد بشكل كبير على تحسين ربطها بسطح الجهاز. احتضان العلاجات السطحية للأوقات الموصى بها في الجهاز microfluidic أمر بالغ الأهمية للحصول على ملزمة مع عدد قليل من نقاط الرسو، بحيث يمكن للجزيئات توسيع بحرية والاسترخاء عند تغيير التدفق. إذا كانت البروتينات أو الحمض النووي مرتبطة بقوة كبيرة مع روابط متعددة ، فإنها إما أن تمتد إلى أطوال محدودة أو لا تمتد على الإطلاق. يحدث هذا بشكل خاص مع VWF عندما يبقى دون تدفق على سطح الجهاز لأكثر من 3 دقيقة قبل حظر البيوتين.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على بيانات عالية الجودة من التغيرات التشكيلية جزيء واحد باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح في هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان لاحتضان جزيء لمقدار الوقت المناسب، والحد من تفاعلاتها غير محددة مع السطح وإنشاء إعدادات المجهر التي تقلل من التبييض الضوئي. ترتبط قدرة الجزيء على تغيير التشكل بحرية بعدد تفاعلات البيوتين-ستريبتافيفيسين التي تشكلت بين الجزيء والسطح. كما ذكر سابقا، يجب السيطرة على هذا من خلال احتضان الجزيء دون تدفق لفترة مناسبة من الوقت. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط البروتين أو الحمض النووي بشكل غير محدد بقسيمة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم DMS-1463234، والمنح الوطنية للصحة HL082808 وAI133634، والتمويل الداخلي لجامعة ليهاي.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أليكسا فلور 488 مجموعة وضع العلاماتInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501استخدم كبيوتين مجاني في الخطوة 5.6
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
CoverslipsVWR48393-195رقم 1 ½, 22 × 50 مم
dNTP مجموعةInvitrogen10297018
عوامات عائمة لجهاز غسيل الكلى الصغيرThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→ 5 'exo-)New England BioLabsM0212Sاستخدم لمخزن مؤقت للتفاعل 10X في الخطوة 2.1.1 و 1X المخزن المؤقت للتفاعل في الخطوة 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
جهاز غسيل الكلى الصغيرThermo Scientific6957010K MWCO ، حجم 0.1 مل
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3،4-DioxygenaseSigma-AldrichP8279
Protocatechuic acidSanta Cruz Biotechnologysc-205818
مجموعة المطاط الصناعي السيليكون لتصنيع PDMSشركة داو للكيماويات4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
حل الحجبCANDOR Bioscience110 050استخدم كحل حجب الكازين في جميع أنحاء البروتوكول
شريط غرف الأبحاث الفينيلفيشر العلمي19-120-3217
فون ويلبراند فاكتور ، البلازما البشريةميليبور سيجما681300
YOYO-1 صبغAAT Bioquest17580
0.25 مم أنابيب القطرالداخلي Cole-ParmerEW-06419-00
25 إبرة قياستوماس JG2505X
العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles