نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تميزت سلوك جزيء واحد تحت اضطراب الميكانيكية على نطاق واسع لفهم العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن أساليب مثل المجهر للقوة الذرية لها دقة زمنية محدودة ، في حين أن نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) يسمح فقط بالاستدلال على التشوهات. من ناحية أخرى ، يسمح المجهر المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي في التصور الموقعي لجزيئات واحدة في ظروف التدفق المختلفة. يصف بروتوكولنا خطوات التقاط التغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية المفردة تحت بيئات تدفق القص المختلفة باستخدام المجهر الفلوري. يتم إنشاء تدفق القص داخل قنوات microfluidic ويسيطر عليها مضخة حقنة. كعروض للطريقة ، يتم تسمية عامل فون ويلبراند (VWF) والحمض النووي لامدا مع البيوتين والفلوروفور ثم يتم شل حركتها على سطح القناة. يتم رصد التشكيلات باستمرار تحت تدفق القص المتغير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) والمجهر المجهري الفلوري المعتري. ديناميات تفكك عكسها من VWF مفيدة لفهم كيفية تنظيم وظيفتها في الدم البشري، في حين أن تشكيل الحمض النووي لامدا يقدم رؤى في الفيزياء الحيوية للجزيئات الكبيرة. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدراسة سلوك البوليمرات، وخاصة البوليمرات الحيوية، في ظروف التدفق المختلفة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة.
المقدمة
وقد درست على نطاق واسع آليات كيفية استجابة الجزيئات الحيوية للمحفزات البيئية. في بيئة التدفق على وجه الخصوص ، تنظم قوى القص والطول المدى التغيرات التشكيلية وربما وظيفة الجزيئات الحيوية. ومن الأمثلة النموذجية على ذلك كشف الحمض النووي لامدا وفون ويلبراند (VWF) الناجم عن القص. وقد استخدمت الحمض النووي لامبدا كأداة لفهم ديناميات تشكيلية من سلاسل البوليمر الفردية ومرنة وrheology من حلول البوليمر1،2،3،4. VWF هو مستشعر التدفق الطبيعي الذي يجمع الصفائح الدموية في مواقع الجروح في الأوعية الدموية مع معدلات القص غير الطبيعية وأنماط التدفق. كشف VWF أمر ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد VWF
- إعادة تشكيل البلازما البشرية VWF لإعداده لردود الفعل وضع العلامات. أضف 100 ميكرولتر من الماء المغليون (DI) إلى 100 ميكروغرام من VWF المنفّه لإنشاء محلول مخزون VWF 1 ملغم/مل.
- Dialyze VWF حل الأسهم من أجل إزالة الجليسين الزائد، وبالتالي زيادة كفاءة وضع العلامات البيوتين والفلوروفور.
- نقل 50 ميكرولتر من محلول مخزون VWF إلى وحدة غسيل كلوي 0.1 مل مع 10000 قطع الوزن الجزيئي وختم مع غطاء. تخزين حل الأسهم المتبقية في -20 درجة مئوية. سوف تكون مستقرة مخزون VWF لمدة تصل إلى 1 سنة في -20 درجة مئوية.
- تشغيل غسيل الكلى في 500 مل من 1x الفوسفات المعقم المالحة (PBS) (0.01 M فوسفات ديسيوم، 0.0018 فوسفات أحادي البوتاسيوم، 0.0027 M كلوري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مراقبة السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية مثل VWF والحمض النووي لامدا يعتمد بشكل كبير على تحسين ربطها بسطح الجهاز. احتضان العلاجات السطحية للأوقات الموصى بها في الجهاز microfluidic أمر بالغ الأهمية للحصول على ملزمة مع عدد قليل من نقاط الرسو، بحيث يمكن للجزيئات توسيع بحرية والاسترخاء عند تغيير التدفق. إذا كانت البروتينات أو الحمض النووي مرتبطة بقوة كبيرة مع روابط متعددة ، فإنها إما أن تمتد إلى أطوال محدودة أو لا تمتد على الإطلاق. يحدث هذا بشكل خاص مع VWF عندما يبقى دون تدفق على سطح الجهاز لأكثر من 3 دقيقة قبل حظر البيوتين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
للحصول على بيانات عالية الجودة من التغيرات التشكيلية جزيء واحد باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح في هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان لاحتضان جزيء لمقدار الوقت المناسب، والحد من تفاعلاتها غير محددة مع السطح وإنشاء إعدادات المجهر التي تقلل من التبييض الضوئي. ترتبط قدرة الجزيء على تغيير التشكل بحرية بعدد تفاعلات البيوتين-ستريبتافيفيسين التي تشكلت بين الجزيء والسطح. كما ذكر سابقا، يجب السيطرة على هذا من خلال احتضان الجزيء دون تدفق لفترة مناسبة من الوقت. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط البروتين أو الحمض النووي بشكل غير محدد بقسيمة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم DMS-1463234، والمنح الوطنية للصحة HL082808 وAI133634، والتمويل الداخلي لجامعة ليهاي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أليكسا فلور 488 مجموعة وضع العلامات | Invitrogen | A30006 | |
| Bio-Spin P-6 Gel Columns | Bio-Rad | 7326221 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | استخدم كبيوتين مجاني في الخطوة 5.6 |
| Biotin-14-dCTP | AAT Bioquest | 17019 | |
| BSA-Biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Coverslips | VWR | 48393-195 | رقم 1 ½, 22 × 50 مم |
| dNTP مجموعة | Invitrogen | 10297018 | |
| عوامات عائمة لجهاز غسيل الكلى الصغير | Thermo Scientific | 69588 | |
| Klenow Fragment (3'→ 5 'exo-) | New England BioLabs | M0212S | استخدم لمخزن مؤقت للتفاعل 10X في الخطوة 2.1.1 و 1X المخزن المؤقت للتفاعل في الخطوة 2.2.2 |
| Lambda DNA | New England BioLabs | N3011S | |
| جهاز غسيل الكلى الصغير | Thermo Scientific | 69570 | 10K MWCO ، حجم 0.1 مل |
| NEBuffer 4 | New England BioLabs | B7004S | |
| NHS-PEG4-Biotin | Thermo Scientific | 21330 | |
| Protocatechuate 3،4-Dioxygenase | Sigma-Aldrich | P8279 | |
| Protocatechuic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-205818 | |
| مجموعة المطاط الصناعي السيليكون لتصنيع PDMS | شركة داو للكيماويات | 4019862 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 85878 | |
| حل الحجب | CANDOR Bioscience | 110 050 | استخدم كحل حجب الكازين في جميع أنحاء البروتوكول |
| شريط غرف الأبحاث الفينيل | فيشر العلمي | 19-120-3217 | |
| فون ويلبراند فاكتور ، البلازما البشرية | ميليبور سيجما | 681300 | |
| YOYO-1 صبغ | AAT Bioquest | 17580 | |
| 0.25 مم أنابيب القطر | الداخلي Cole-Parmer | EW-06419-00 | |
| 25 إبرة قياس | توماس JG2505X |
المراجع
- Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
- Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
- LeDuc, P., Haber, C.,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
