Method Article

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولًا لشل الجزيئات الكبيرة المفردة في الأجهزة الميكروفلويدية وتحديد التغيرات في التشكيلات تحت تدفق القص. هذا البروتوكول مفيد لتوصيف الخصائص الميكانيكية الحيوية والوظيفية للجزيئات الحيوية مثل البروتينات والحمض النووي في بيئة التدفق.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تميزت سلوك جزيء واحد تحت اضطراب الميكانيكية على نطاق واسع لفهم العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك ، فإن أساليب مثل المجهر للقوة الذرية لها دقة زمنية محدودة ، في حين أن نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) يسمح فقط بالاستدلال على التشوهات. من ناحية أخرى ، يسمح المجهر المجهري الفلوري في الوقت الحقيقي في التصور الموقعي لجزيئات واحدة في ظروف التدفق المختلفة. يصف بروتوكولنا خطوات التقاط التغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية المفردة تحت بيئات تدفق القص المختلفة باستخدام المجهر الفلوري. يتم إنشاء تدفق القص داخل قنوات microfluidic ويسيطر عليها مضخة حقنة. كعروض للطريقة ، يتم تسمية عامل فون ويلبراند (VWF) والحمض النووي لامدا مع البيوتين والفلوروفور ثم يتم شل حركتها على سطح القناة. يتم رصد التشكيلات باستمرار تحت تدفق القص المتغير باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) والمجهر المجهري الفلوري المعتري. ديناميات تفكك عكسها من VWF مفيدة لفهم كيفية تنظيم وظيفتها في الدم البشري، في حين أن تشكيل الحمض النووي لامدا يقدم رؤى في الفيزياء الحيوية للجزيئات الكبيرة. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدراسة سلوك البوليمرات، وخاصة البوليمرات الحيوية، في ظروف التدفق المختلفة والتحقيق في ريولوجيا السوائل المعقدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد درست على نطاق واسع آليات كيفية استجابة الجزيئات الحيوية للمحفزات البيئية. في بيئة التدفق على وجه الخصوص ، تنظم قوى القص والطول المدى التغيرات التشكيلية وربما وظيفة الجزيئات الحيوية. ومن الأمثلة النموذجية على ذلك كشف الحمض النووي لامدا وفون ويلبراند (VWF) الناجم عن القص. وقد استخدمت الحمض النووي لامبدا كأداة لفهم ديناميات تشكيلية من سلاسل البوليمر الفردية ومرنة وrheology من حلول البوليمر1،2،3،4. VWF هو مستشعر التدفق الطبيعي الذي يجمع الصفائح الدموية في مواقع الجروح في الأوعية الدموية مع معدلات القص غير الطبيعية وأنماط التدفق. كشف VWF أمر ضروري في تفعيل ربط الصفائح الدموية إلى المجال A1 والكولاجين ملزمة للمجال A3. وبالإضافة إلى ذلك، عالية القص الناجمة عن المجال A2 تتكشف يسمح انشقاق VWF، الذي ينظم توزيع الوزن الجزيئي في الدورة الدموية5،6. وبالتالي ، فإن التصور المباشر لكيفية عمل هذه الجزيئات تحت التدفق يمكن أن يعزز إلى حد كبير فهمنا الأساسي للميكانيكا الحيوية ووظيفتها ، والتي بدورها يمكن أن تمكن التطبيقات التشخيصية والعلاجية الجديدة.

وتشمل المنهجيات النموذجية لتوصيف التشكيلات أحادية الجزيء ملاقط بصرية/مغناطيسية، والمجهر المجهري للقوة الذرية (AFM) ونقل الطاقة بالرنين الرنين أحادي الجزيء Förster (FRET)7. التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد هو أداة قوية للتحقيق في القوة والحركة المرتبطة بالتغيرات التشكيلية للجزيئات الحيوية. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى القدرة على رسم خريطة التشكيلات الجزيئية الشاملة8. AFM قادرة على التصوير بدقة مكانية عالية ولكنها محدودة في القرار الزمني9،10. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الاتصال بين الطرف والعينة إلى إرباك الاستجابة الناجمة عن التدفق. طرق أخرى مثل FRET وتحليلات nanopore تحديد البروتين جزيء واحد للطي وتتكشف الدول على أساس الكشف عن المسافة داخل الجزيئية والأحجام المستثناة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لا تزال في مهدها ومحدودة في ملاحظتها المباشرة لتكوينات جزيء واحد11،12،13،14.

من ناحية أخرى ، فإن المراقبة المباشرة للجزيئات ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية تحت المجهر الفلوري قد حسنت فهمنا لديناميكيات الجزيء الواحد في العديد من العمليات البيولوجية15،16. على سبيل المثال، حققت فو وآخرون مؤخرا تصور المدة المتزامنة لـ VWF والربط مستقبلات الصفائح الدموية للمرة الأولى. في عملهم ، تم شل جزيئات VWF على سطح قناة ميكروفلويديك من خلال تفاعلات البيوتين - ستريبتفيفيفيالدين وتصويرها تحت الانعكاس الداخلي الكلي للفلورسينس (TIRF) المجهري في بيئات تدفق القص المختلفة17. تطبيق طريقة مماثلة كما فو، ونحن هنا تثبت أن التشكيلات من VWF والحمض النووي لامدا يمكن ملاحظتها مباشرة تحت كل من TIRF والمجهر الفلوري المعتري. كما هو موضح في الشكل 1، يتم استخدام الأجهزة الدقيقة لإنشاء والتحكم في تدفق القص ، ويتم شل الجزيئات الحيوية على سطح القناة. عند تطبيق معدلات القص المختلفة ، يتم تسجيل التشكيلات من نفس الجزيء لقياس الطول الإرشادي ، كما هو موضح في الشكل 1. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لاستكشاف سلوكيات البوليمر الأخرى في ظل بيئات التدفق المعقدة لكل من الدراسات الريولوجية والبيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد VWF

  1. إعادة تشكيل البلازما البشرية VWF لإعداده لردود الفعل وضع العلامات. أضف 100 ميكرولتر من الماء المغليون (DI) إلى 100 ميكروغرام من VWF المنفّه لإنشاء محلول مخزون VWF 1 ملغم/مل.
  2. Dialyze VWF حل الأسهم من أجل إزالة الجليسين الزائد، وبالتالي زيادة كفاءة وضع العلامات البيوتين والفلوروفور.
    1. نقل 50 ميكرولتر من محلول مخزون VWF إلى وحدة غسيل كلوي 0.1 مل مع 10000 قطع الوزن الجزيئي وختم مع غطاء. تخزين حل الأسهم المتبقية في -20 درجة مئوية. سوف تكون مستقرة مخزون VWF لمدة تصل إلى 1 سنة في -20 درجة مئوية.
    2. تشغيل غسيل الكلى في 500 مل من 1x الفوسفات المعقم المالحة (PBS) (0.01 M فوسفات ديسيوم، 0.0018 فوسفات أحادي البوتاسيوم، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم، 0.137 M كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.4 في 25 درجة مئوية) ل1 ساعة في 4 درجة مئوية مع اثارة بطيئة. كرر غسيل الكلى لمدة ساعة إضافية باستخدام 500 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
  3. بدء البيوتين وضع العلامات رد فعل. إعداد 2 mM حل NHS-PEG4-البيوتينعن طريق إذابة الصلبة في ماء DI مباشرة قبل رد الفعل. السماح NHS-PEG4-البيوتين بالبقاء في الماء لفترة طويلة سوف يسبب مجموعة NHS-ester إلى التحلل المائي، وبالتالي تقليل كفاءة وضع العلامات.
    1. أضف 2.5 ميكرولتر من 2مل NHS-PEG 4-البيوتين إلى وحدة غسيل الكلى التي تحتوي على محلول مخزون VWF. وهذا سيؤدي إلى 20 أضعاف الضرس الزائد من البيوتين بالمقارنة مع مونومرات VWF. الأمينات الأولية من VWF سوف تتفاعل مع مجموعات NHS-ester، وبالتالي ملزمة التكافؤ إلى PEG4-مجموعاتالبيوتين عبر الروابط أميد.
    2. ضع وحدة غسيل الكلى داخل أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل. ختم وحدة غسيل الكلى مع الغطاء المقابلة لها. قم بتأمين تجميع غسيل الكلى الأنبوبي مع Parafilm. حافظ على تستقيم وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
  4. بدء تفاعل وضع العلامات الفلورية. إعداد حل 2.8 m M من اليكسا 488 tetrafluorophenyl-ester (TFP-ester) صبغة الفلورسنت (الإثارةماكس = 498 نانومتر،والحد الأقصى للانبعاثات = 519 نانومتر) عن طريق إذابة الصلبة الفلوروفورفية في مياه DI. القيام بذلك مباشرة قبل رد الفعل لمنع مجموعة TFP-ester من التحلل المائي.
    1. أضف 2.9 ميكرولتر من الفلوروفور 2.8 م M 488 إلى وحدة غسيل الكلى. وهذا سيؤدي إلى زيادة ضرس 34 أضعاف من الفلوروفور مقارنة مونومرات VWF. أما الأمينات الرئيسية المتبقية من VWF فتتفاعل مع مجموعات TFP-ester ، وبالتالي ملزمة بشكل التكافؤ للفلوروفوريات عبر الروابط المتوسطة.
    2. أضف 2.0 ميكرولتر من 1 م بيكربونات الصوديوم (مذابة في ماء DI) إلى وحدة غسيل الكلى. هذا يضبط درجة الحموضة من رد الفعل أقرب إلى 8.0, مما يزيد من كفاءة TFP-استر والأولية أمين رد فعل.
    3. تأمين وحدة غسيل الكلى في أنبوب الطرد المركزي المجهري تماما كما هو الحال في الخطوة 1.3.2. تخزينها في الظلام لمنع التبييض الضوئي وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة.
  5. ضع وحدة غسيل الكلى في 900 مل من 1x PBS المعقم وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. وسيؤدي ذلك إلى إنتاج ما يقرب من 70 ميكرولتر من VWF المسمى بتركيز 0.71 ملغم/مل أو 2.84 ميكرومتر (تركيز مونومر).
  6. نقل VWF المسمى في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم وحماية من الضوء. تخزين في 4 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، أضف غاز الصوديوم المضاد للميكروبات إلى تركيز نهائي بنسبة 0.02٪ (w/v).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

2. إعداد الحمض النووي لامبدا

  1. Biotinylate الخطي ة لامدا الحمض النووي عن طريق ملء مواقعنهاية متماسكة (كوس المواقع) مع النيوكليوتيدات البيوتين-14-dCTP وفقا للبروتوكولات القياسية، وكرر هنا في الخطوة 2.118. ملء ما تبقى من المواقع كوس مع dATP، dTTP وdGTP النيوكليوتيدات.
    1. إعداد 1 mM حلول dATP، dTTP، dGTP والبيوتين-14-dCTP في عازلة رد فعل 10x (500 mM كلوريد الصوديوم، 100 mM تريس هيدروكلوريد، 100 mM كلوريد المغنيسيوم، 10 mM dithiothreitol، درجة الحموضة 7.9 في 25 درجة مئوية).
    2. ضع 48 ميكرولتر من 500 نانوغرام/ميكرولتر لامدا دي إن دي في أنبوب PCR والحرارة لمدة 5 دقيقة عند 65 درجة مئوية. مواقع كوس من الحمض النووي لامدا دائرية سوف تنفصل تحت الحرارة، وخطي الجزيء وجعل يتدلى واحد تقطعت بهم السبل جاهزة لbiotinylation. مباشرة بعد، وضع على الجليد لمنع مواقع كوس من إعادة الصلب.
    3. أضف 5 ميكرولتر من 1 مل من dATP وdTTP وdGTP و4 ميكرولتر من 1 مل البيوتين-14-dCTP إلى الحمض النووي لامدا. إضافة أيضا 2.5 ميكرولتر من 5 U/μL Klenow جزء (3'à5'exo-) لتحفيز تخليق الحمض النووي.
    4. احتضان خليط التفاعل لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    5. أضف 1.2 ميكرولتر من 0.5 مليون بتوقيت العاصمة. ثم سخني خليط التفاعل لمدة 5 دقيقة عند درجة حرارة 70 درجة مئوية. هذا سوف تعطيل جزء Klenow ورد فعل biotinylation.
  2. إزالة النيوكليوتيدات الزائدة من الحمض النووي لامدا باستخدام عمود تدور التي يمكن أن تعقد 10-70 ميكرولتر ولها 6000 قطع الوزن الجزيئي.
    1. ضع العمود داخل أنبوب طرد مركزي صغير 2 مل. الطرد المركزي العمود والأنبوب في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة. التخلص من التدفق من خلال أن يجمع في الأنبوب.
    2. استبدال المخزن المؤقت العمود مع حل 1x من المخزن المؤقت رد الفعل نفسه من الخطوة 2.1.1. القيام بذلك عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x إلى العمود. الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 1000 × ز. التخلص من تدفق من خلال. كرر هذه 2 مرات أكثر بحيث تم إضافة ما مجموعه 1500 ميكرولتر إلى العمود.
    3. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل. قم بإضافة الحل بعناية من الخطوة 2.1.5 إلى الطبقة العليا من العمود. الطرد المركزي لمدة 4 دقيقة في 1000 × ز.
    4. جمع تدفق من خلال (40-70 ميكرولتر) من أنبوب الطرد المركزي الدقيقة ووضعها في أنبوب PCR. هذا يحتوي على الحمض النووي النقي، لامدا المنقى.
  3. تسمية الحمض النووي لامدا مع الفلورسنت YOYO-1 صبغة (الإثارةكحد أقصى = 490 نانومتر،والحد الأقصى للانبعاثات = 509 نانومتر) وفقا للبروتوكولات القياسية، وكرر هنا في الخطوة 2.3.120.
    1. إعداد حل من صبغة YOYO-1 والحمض النووي لامدا مع صبغة إلى قاعدة زوج نسبة الأضراس من 1:10. افترض أنه لم يتم فقدان الحمض النووي في خطوة التنقية لحساب تركيز الزوج الأساسي لحمض لامدا النووي. كامل طول الحمض النووي لامدا لديه 48502 أزواج قاعدة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم استرداد 50 ميكرولتر من المحلول من الخطوة 2.2.4، أضف 7.4 ميكرولتر من صبغة YOYO-1 500 ميكرومتر.
    2. تسخين الحل لمدة 2 ساعة في 50 درجة مئوية في الظلام لإكمال رد الفعل.
    3. تغطية أنبوب مع رقائق الألومنيوم وحماية من الضوء. تخزين في 4 درجة مئوية. الحل جاهز الآن لحقنه في أجهزة ميكروفلويديك.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

3. إنشاء قوالب قناة microfluidic في رقاقة السيليكون

  1. استخدام الطباعة الحجرية الضوئية لإنشاء قنوات microfluidic مع الأبعاد المناسبة(الشكل 2)على رقاقة السيليكون الرئيسي وفقا للبروتوكولات القياسية19.

4. إعداد جهاز البوليديميثيلسيلوكسان (PDMS) ميكروسيوليك

  1. إضافة 5 أجزاء قاعدة اللاتومر السيليكون إلى 1 جزء عامل علاج (عن طريق الكتلة) في قارب وزن. حرك المحتويات بدقة لمدة دقيقة واحدة لإنشاء حل PDMS قبل الشفاء.
  2. ضع رقاقة السيليكون الرئيسية في طبق بيتري بلاستيكي. صب حل PDMS على رقاقة لإنشاء طبقة 5 ملم. تغطية الطبق وترك في المجففتحت فراغ لمدة 1 ساعة لإزالة فقاعات الهواء.
  3. احتضان طبق بيتري غطت في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS في مادة صلبة مرنة. سوف يؤدي المعالجة في قنوات microfluidic مصبوب في PDMS في واجهة PDMS-رقاقة.
  4. قطع 20 × 10 ملم المستطيلات في PDMS، حول كل قناة microfluidic، وذلك باستخدام شفرة الحلاقة. إزالة كتل PDMS مستطيلة مع ملاقط.
  5. استخدام إبرة نهاية حادة 25 G مع حواف شحذ لكمة ثقب 0.5 ملم في القطر في نهاية واحدة من القناة، والتأكد من ثقب يذهب تماما من خلال كتلة PDMS(الشكل 2). استخدام إبرة رقيقة لكمة من PDMS من حفرة. كرر هذا في الطرف الآخر من القناة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء منفذ ومنفذ للتدفق عبر القناة.
  6. تنظيف سطح كتلة PDMS مع شريط غرفة نظيفة الفينيل. ضربة غاز النيتروجين المضغوط على رقم 1 1/2، 22 × 50 ملم قسيمة تغطية لإزالة الحطام.
  7. ضع كتلة PDMS مع جانب القناة لأعلى وقسيمة الغطاء في غرفة آلة الترابط البلازما. بدء العلاج.
  8. عند اكتمال العلاج، ضع كتلة PDMS بسرعة على قسيمة تغطية بحيث تكون القناة على اتصال مع الانزلاق. تطبيق الضغط على طول حواف الكتلة. ضع تجميع coverslip-PDMS على لوحة ساخنة عند درجة حرارة 115 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعزيز السندات الدائمة.
  9. أدخل أنابيب قطرها الداخلي بطول 10 سم و0.25 مم في فتحة المأخذ في الجزء العلوي من كتلة PDMS. وهذا يسمح للسوائل بالتدفق بسهولة خارج القناة. اكتمل الجهاز الآن.

5. علاج سطح الجهاز microfluidic

  1. حقن < 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل بوروسياتينتيد الزلال مصل البقر (BSA-البيوتين) المذاب في 1x PBS المعقم في مدخل جهاز microfluidic لتجارب VWF. حقن < 10 ميكرولتر من 1 ملغ/مل BSA-البيوتين لتجارب الحمض النووي لامدا. حجب عدد قليل من ميكرولتر من BSA-البيوتين في تلميح ماصة بعد الحقن والسماح للتلميح أن تبقى جزءا لا يتجزأ في المأصل.
    1. احتفظ دائمًا بقطرة من ماء DI حول الطرف. وهذا سوف يمنع فقاعات الهواء من دخول القناة. تطبيق هذه التقنية في كل مرة يتم حقن حل جديد في القناة.
    2. السماح BSA-البيوتين لاحتضان في الجهاز لمدة 2 ساعة. سوف يرتبط BSA بشكل غير محدد بسطح غطاء(الشكل 3A).
  2. إزالة طرف ماصة. حقن < 10 ميكرولتر من محلول حظر الكيسين في القناة والسماح لها باحتضان لمدة 30 دقيقة. فإن اللافيين منع أي مواقع مجانية، والحد من ملزمة غير محددة من الجزيئات الحيوية إلى السطح(الشكل 3B).
  3. إزالة طرف وحقن < 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ستريبتافيدرين حلها في 1x PBS المعقم في القناة للتجارب VWF. استخدم 100 ميكروغرام/مل ستريبتفيفيدين لتجارب الحمض النووي لامدا. الاحتضان لمدة 10 دقيقة. والعقدية ربط مجموعات البيوتين من BSA-البيوتين(الشكل 3C).
  4. إزالة طرف وحقن < 10 ميكرولتر من محلول المنظفات 1x (0.05% Tween 20 في برنامج تلفزيوني) في القناة لغسل العقدية الزائدة.
  5. إزالة طرف وحقن < 10 ميكرولتر إما 28.4 nM VWF المخفف في محلول الكيسين أو الحمض النووي لامدا من الخطوة 2.3.3. احتضان VWF لمدة 3 دقيقة. احتضان لامدا الحمض النووي لمدة 45 دقيقة(الشكل 3D).
  6. إزالة طرف وحقن < 10 ميكرولتر من 5 mm البيوتين الحرة المخففة في محلول الكيسين. سوف البيوتين الحرة منع المواقع الزائدة ربط ستريبتفيدرين على سطح القناة(الشكل 3E).

6. تصور VWF ولامدا الحمض النووي تحت المجهر الفلوري

  1. إعداد 1 مل من محلول حظر الكيسين مع 2.2 m m حمض بروتوكاتيتشويك و 37 nM بروتوكاتيتشوات-3,4-dioxygenase (للحد من التبييض الضوئي). تحميل في حقنة وآمنة في مضخة حقنة. تأخذ 30 سم طويلة، 0.25 مم أنابيب القطر الداخلي ونعلق نهاية واحدة لإبرة الحقنة. تدفق في الحل لإزالة فقاعات الهواء. إرفاق الطرف الآخر من الأنبوب إلى مدخل الجهاز microfluidic. من المستحسن القيام بذلك بعد 3 دقائق من الخطوة 5.6.
  2. اختر أعلى هدف تكبير (أي 60-100X) من الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) أو مجهر الفلورسينال المُلطي. إضافة قطرة من زيت الغمر على هدفها إذا لزم الأمر. ضع الجهاز الميكروسائلي على مرحلة المجهر بحيث يتم تدفق الغطاء مع الهدف.
  3. بدء المجهر برايتفيلد. ضبط التركيز بحيث أي ميزات، مثل الحطام والفقاعات، مرئية. ثم قم بضبط المرحلة في اتجاه X و Y حتى تكون حافة القناة الموائعة الدقيقة مرئية وتقسم الإطار إلى قسمين.
  4. التبديل إلى قناة 488 (FITC). ضبط Z المستوى وTIRF زاوية حسب الحاجة حتى يمكن تمييز الجزيئات الخضراء الفردية، كروية. هذه هي إما VWF أو جزيئات الحمض النووي لامدا.
  5. ضبط وقت التعرض وكثافة الليزر لتصور جزيئات الفلورسنت دون فوتوتفينتالمنها بسرعة كبيرة جدا. ضبط التباين لتصور أيضا جزيئات بشكل أكثر وضوحا.
  6. بدء تدفق من مضخة حقنة بحيث الكيسين حظر الحل يتدفق إلى القناة والخروج من منفذ. القيام بذلك بالضبط 5 دقائق بعد الخطوة 5.6. وقف وبدء تدفق لمراقبة التغيرات في تشكيل الجزيئات. عند تطبيق التدفق، استخدم معدلات تتراوح بين 5000 و 30000 ميكرولتر /ساعة. كرر ذلك في جميع أنحاء مناطق مختلفة من الجهاز microfluidic. مواصلة هذه العملية لتحديد موقع الجزيئات التي يمكن أن تمتد والاسترخاء على دورات متعددة من وقف وبدء تدفق.
  7. لاحظ كم من الوقت يستغرق للجزيئات للوصول إلى أقصى تمديد والاسترخاء تماما في الكريات. تسجيل أشرطة الفيديو من السلوك المستمر للجزيئات تحت تدفق القص، واختيار أفضل وقت التعرض، وتواتر التعرض ومدة الفيديو التي من شأنها التقاط مجموعة كاملة من السلوك الإرشادوتقليل تبيض.
  8. حفظ مقاطع الفيديو كـ . ملفات AVI مع شريط مقياس.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

7. تحليل صورة التغيرات في التشكيل

  1. حساب معدل القص الجدارfigure-protocol-1() تطبيقها على الجزيئات الكبيرة باستخدام معدل التدفق(Q)وارتفاع(ح)وعرض(ث)من قناة microfluidic مستطيلة. استخدم المعادلة التالية للقيام بذلك:
    figure-protocol-2
  2. تحديد طول أي جزيء حيوي تحت معدلات القص المختلفة باستخدام رمز MATLAB مخصصة (انظر الملفات التكميلية). إنشاء مجلد بعنوان تحليل مقاطع الفيديو الذي يتضمن رموز MATLAB التالية: main.m، save_each_frame.m، get_length.m و get_length.fig. إنشاء مجلد فرعي ضمن تحليل مقاطع الفيديو بعنوان مقاطع الفيديو وإضافة . ملفات AVI ليتم تحليلها في ذلك.
  3. افتح main.m باستخدام MATLAB 2019a وتشغيل الرمز. اكتب اسم ملف الفيديو الذي سيتم تحليله في إطار الأمر تحت الرجاء إدخال ملف البيانات لتحليل:.
  4. في واجهة المستخدم الرسومية المفتوحة (GUI)، قم بتعيين العتبة (النص في المربع الموجود أعلى يمين النافذة) إلى 20 وانقر على زر تعيين العتبة للتأكيد.
  5. استخدم مؤشر البيانات في شريط الأدوات العلوي للإطار لاختيار بكسل واحد في أي مكان على شريط المقياس. انقر فوق نقطة البدء في قسم شريط المقياس على يمين النافذة. سيظهر موضع (x,y) للبكسل المختار على يمين الزر. انقر على زر حجم البكسل (μm). يجب قياس حجم البكسل مرة واحدة فقط في كل فيديو.
  6. اختيار أي بكسل على جزيء الفائدة. انقر على نقطة البدء في قسم VWF. بعد ظهور موضع البكسل المختار على مربع النص على اليمين، انقر على الطرف الأيسر والطرف الأيمن وطول السلسلة للحصول على الطول الجزيئي في الصورة.
    ملاحظة: يمكن استخدام هذه الخطوة لتحليل التغييرات التشكيلية لأي جزيء حيوي، على الرغم من وجود رمز وجود قسم معين اسمه VWF.
  7. تحقق مرة أخرى من الطرف الأيسر والأيمن من الجزيء. قم بتكبير مؤشر البيانات واستخدامه للتحقق من موضع البكسل موضع الاهتمام. اختر البيكسل يدويًا كنهاية وإعادة حساب الطول (بالبكسل) عند الضرورة.
  8. سجل حجم البكسل في μm وطول السلسلة في رقم البكسل في ورقة Excel وحساب طول السلسلة في μm.
  9. كرر الخطوات أعلاه لكل صورة. استخدم الزر الأخير، التالي في الزاوية اليمنى السفلية من واجهة المستخدم الرسومية للتبديل بين الصور في نفس ملف الفيديو. انقر على إغلاق لإغلاق نافذة واجهة المستخدم الرسومية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة السلوك الديناميكي للجزيئات الحيوية مثل VWF والحمض النووي لامدا يعتمد بشكل كبير على تحسين ربطها بسطح الجهاز. احتضان العلاجات السطحية للأوقات الموصى بها في الجهاز microfluidic أمر بالغ الأهمية للحصول على ملزمة مع عدد قليل من نقاط الرسو، بحيث يمكن للجزيئات توسيع بحرية والاسترخاء عند تغيير التدفق. إذا كانت البروتينات أو الحمض النووي مرتبطة بقوة كبيرة مع روابط متعددة ، فإنها إما أن تمتد إلى أطوال محدودة أو لا تمتد على الإطلاق. يحدث هذا بشكل خاص مع VWF عندما يبقى دون تدفق على سطح الجهاز لأكثر من 3 دقيقة قبل حظر البيوتين...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على بيانات عالية الجودة من التغيرات التشكيلية جزيء واحد باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح في هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان لاحتضان جزيء لمقدار الوقت المناسب، والحد من تفاعلاتها غير محددة مع السطح وإنشاء إعدادات المجهر التي تقلل من التبييض الضوئي. ترتبط قدرة الجزيء على تغيير التشكل بحرية بعدد تفاعلات البيوتين-ستريبتافيفيسين التي تشكلت بين الجزيء والسطح. كما ذكر سابقا، يجب السيطرة على هذا من خلال احتضان الجزيء دون تدفق لفترة مناسبة من الوقت. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط البروتين أو الحمض النووي بشكل غير محدد بقسيمة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال منحة المؤسسة الوطنية للعلوم DMS-1463234، والمنح الوطنية للصحة HL082808 وAI133634، والتمويل الداخلي لجامعة ليهاي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أليكسا فلور 488 مجموعة وضع العلاماتInvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Gel ColumnsBio-Rad7326221
BiotinSigma-AldrichB4501استخدم كبيوتين مجاني في الخطوة 5.6
Biotin-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotinSigma-AldrichA8549
CoverslipsVWR48393-195رقم 1 ½, 22 × 50 مم
dNTP مجموعةInvitrogen10297018
عوامات عائمة لجهاز غسيل الكلى الصغيرThermo Scientific69588
Klenow Fragment (3'→ 5 'exo-)New England BioLabsM0212Sاستخدم لمخزن مؤقت للتفاعل 10X في الخطوة 2.1.1 و 1X المخزن المؤقت للتفاعل في الخطوة 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
جهاز غسيل الكلى الصغيرThermo Scientific6957010K MWCO ، حجم 0.1 مل
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protocatechuate 3،4-DioxygenaseSigma-AldrichP8279
Protocatechuic acidSanta Cruz Biotechnologysc-205818
مجموعة المطاط الصناعي السيليكون لتصنيع PDMSشركة داو للكيماويات4019862
StreptavidinSigma-Aldrich85878
حل الحجبCANDOR Bioscience110 050استخدم كحل حجب الكازين في جميع أنحاء البروتوكول
شريط غرف الأبحاث الفينيلفيشر العلمي19-120-3217
فون ويلبراند فاكتور ، البلازما البشريةميليبور سيجما681300
YOYO-1 صبغAAT Bioquest17580
0.25 مم أنابيب القطرالداخلي Cole-ParmerEW-06419-00
25 إبرة قياستوماس JG2505X
العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles