نحن نصف العزلة والتشتت والطلاء من الخلايا الأولية لب الأسنان (DP) مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم (TG) المستزرعة فوق مرشحات عبر ويل فوق. يمكن تحليل الاستجابات الخلوية لخلايا DP مع الفلور المناعي أو تحليل الحمض النووي الريبي / البروتين. الفلور المناعي من علامات الخلايا العصبية مع المجهر المعالبؤر يسمح تحليل استجابات نمو النيوتر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. بدون تعصيب حسي ، فإن الأنشطة الشفوية اليومية ستسبب ضررًا لا يمكن إصلاحه. على الرغم من أهميتها ، تم تجاهل أدوار التعصيب في تطوير الأسنان وصيانتها إلى حد كبير. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا DP تفرز بروتينات مصفوفة خارج الخلية وإشارات الباراكرين لجذب وتوجيه محاور TG في جميع أنحاء السن. ومع ذلك ، قدمت دراسات قليلة نظرة مفصلة في الحديث المتبادل بين mesenchyme DP والخلايا العصبية afferents. ولمعالجة هذه الفجوة في المعرفة، بدأ الباحثون في استخدام الثقافات المشتركة ومجموعة متنوعة من التقنيات للتحقيق في هذه التفاعلات. هنا، ونحن نشرح الخطوات المتعددة المشاركة في الزراعة المشتركة الخلايا DP الأولية مع الخلايا العصبية TG المنتشرة على مرشح عبر ويل فوقمع المسام قطرها كبيرة للسماح نمو محور عصبي من خلال المسام. تم استخدام خلايا DP الأولية مع جين الفائدة محاطة بمواقع loxP لتسهيل حذف الجينات باستخدام نظام الـ Adenovirus-Cre-GFP recombinase. باستخدام الخلايا العصبية TG من الماوس Thy1-YFP يسمح للتصوير afferent دقيقة، مع التعبير أعلى بكثير من مستويات الخلفية عن طريق المجهر confocal. يمكن التحقيق في استجابات DP من خلال جمع وتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي ، أو بدلاً من ذلك ، من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا DP المطلية على قسائم الأغطية الزجاجية القابلة للإزالة. يمكن تحليل وسائل الإعلام باستخدام تقنيات مثل التحليلات البروتينية ، على الرغم من أن هذا سيتطلب استنفاد الزلال بسبب وجود مصل الأبقار الجنينفي في وسائل الإعلام. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة يمكن التلاعب بها لدراسة الاستجابات المورفولوجية والوراثية والهيكلية للخلايا العصبية TG وخلايا DP استجابة للبيئة الخاضعة للرقابة من تحليل الثقافة المشتركة.
المقدمة
يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. يؤدي الفشل في الشعور بألم الأسنان المرتبط بتسوس الأسنان والصدمات النفسية إلى تطور المرض. وبالتالي ، فإن التعصيب السليم هو شرط لنمو الأسنان العادية ، وظيفة والرعاية.
في حين أن معظم الأجهزة تعمل بكامل طاقتها وتُدمج بحلول وقت الولادة ، فإن تطور الأسنان يمتد إلى حياة البالغين ، مع تعصيب الأسنان والتمعدن الذي يحدث بالتنسيق خلال مراحل ما بعد الولادة1،2. ومن المثير للاهتمام أن اللب الأسنان (DP) mesenchyme تفرز في البداية إشارات طاردة أثناء تكوين الأجنة لمنع دخول محور عصبي إلى جهاز ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في البنك العربي المتحد (IACUC).
1. إعداد لوحة
ملاحظة: يمكن استخدام قسائم التغطيات لتصوير خلايا DP في نهاية الفحص. تأكد من أن غطاء اللوحة موجود أثناء جميع خطوات الحضانة والإنضار خارج غطاء زراعة الأنسجة المعقمة لمنع التلوث أثناء معالجة العينات.
-
إعداد قسيمة الغلاف
- التغطيات الدائرية الأوتوكلاف.
- تصفية المياه فائقة النقاء تحت غطاء محرك السيارة.
- نقل القسائم إلى لوحة 24 جيدا وتغطي كل واحد مع 400 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل بولي D-ليسين.
- السماح للcoverslips نقع، مغمو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذه النتائج تبين أن TG neurite النمرة قد زاد في وجود خلايا DP الأولية في البئر الكامنة مقارنة مع السيطرة على TG النوريت أحادية الاستزراع(الشكل 2A, C). هناك بعض التقلبات من أجل التقافي في نمو النيوت. وهكذا، ينبغي إدراج الثقافة العصبية TG monoculture في جميع المقالات كتحكم للكشف عن المستويات القاعدية للنتروجين النيوريت. تم استخدام الخلايا الأولية من الماوس Tgfbr2و / و في هذا البروتوكول بعد أن تم تأكيد عدوى Ad-Cre-GFP وAd-eGFP بأعداد مكافئة من الخلايا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتطلب الأنشطة اليومية لتجويف الفم أن تستشعر الأسنان المحفزات الخارجية والالتهاب اتّهات داخليًا من أجل السماح بالاستخدام السليم والصيانة. ومع ذلك ، لا تتوفر سوى معلومات محدودة بشأن الإشارات التي تحرك عمليات تطوير تعصيب الأسنان. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل والمشاركة في زراعة خلايا DP الأولية والخلايا العصبية TG من أجل دراسة الاتصال المتبادل بين السكان. وتم تحسين العديد من المتغيرات وترك سبل البحث مفتوحة، على النحو المبين أدناه.
الضوابط مهمة في كل خطوة في هذا المنقّي. يجب تضمين مرشح ترانسويل م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل أ) المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS (أرقام المنحR01 AR062507 و R01 AR053860 إلى RS) ، ب) جامعة ألاباما في برمنغهام التدريب الأكاديمي للبحوث الأكاديمية (DART) منحة (رقم T90DE0022736 (PI MacDougall)) إلى SBP من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والعناية بالجمجمة / المعاهد الوطنية للصحة ، ج) مركز الجامعة العربية العربية العالمي لاضطرابات الوجه القحفي والفم والأسنان (GC-CODED) نموذج تجريبي ومنحة جدوى لSBP و d) المعهد الوطني لطب الأسنان والوجه القحفي البحوث / المعاهد الوطنية للصحة K99 DE024406 منحة إلى SBP.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | يستخدم كمثبط انقسامي عند 15 & mu ؛ تركيز M في وسائط الزراعة المشتركة ، اليوم 2 |
| 24 لوحة ثقافة الخلايا الجيدة | Corning | 3524 | لوحة الزراعة المشتركة |
| Alexa-546 | Invitrogen | A-11040 | الثانوية لنمو العصبية المضادة للبقع المسمى بالجسم المضاد المضاد ل GFP ، 1: 500 التخفيف |
| المضاد للأجسام | ل GFP Aves Lab، Inc | GFP-1010 | الجسم المضاد الأساسي لتسمية الخلايا العصبية Thy1-YFP ، 1: 200 التخفيف |
| المضاد للخيوط العصبية 200 جسم مضاد | Sigma-Aldrich | NO142 | جسم مضاد أولي أحادي النسيلة لتسمية الخلايا العصبية ، تخفيف 1: 1000 ، بديل إذا لم تكن الفئران YFP |
| متوفرة B6 ؛ 129- Tgfbr2tm1Karl / J | مختبر جاكسون | 12603 | Tgfbr2f / f< / sup> نموذج فأر يستخدم لخلايا لب الأسنان في بروتوكول B6 |
| الأمثل. Cg-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J | مختبر جاكسون | 3709 | النمط الجيني لنموذج الفأر Thy1-YFP المستخدم في الخلايا العصبية ثلاثية التوائم |
| الكولاجيناز النوع الثاني | ميليبور | 234155-100 | مجم يستخدم لتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم |
| مصل الأبقار الجنيني | جيبكو | 10437 | مادة مضافة لوسائط الزراعة |
| المشتركة ملقط ناعم | أدوات العلوم الدقيقة | 11413-11 | ملقط دقيق لتشريح TG |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | يغطي إدخالات transwell بتركيز نهائي يبلغ 10 مو ؛ جم / مل ، يفترض محلول المخزون عند 1.5 مجم / مل |
| محلول التحلل المؤقت (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | يستخرج الحمض النووي الريبي من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | مادة مضافة لوسائط الزراعة المشتركة |
| مقص تشريح دقيق | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | مقص تشريح لفتح غطاء مجهر الجمجمة |
| Fisherbrand | 12-545-81 | غطاء دائري لزراعة الخلايا الاختيارية ومعالجة التألق المناعي | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي A | Gibco | 12571063 | قاعدة وسائط الزراعة |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | مضاف مضاف للمضادات الحيوية لوسائط الزراعة المشتركة |
| مثبطات الفوسفاتيز | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | مادة مضافة إلى RIPA Buffer لاستخراج البروتين من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | تستخدم للمساعدة في تعداء خلايا لب الأسنان |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | طلاء Coverslip للمساعدة في الالتصاق خلوي لب الأسنان |
| مثبطات الإنزيم البروتيني | Millipore | 05 892 791 001 | مادة مضافة إلى RIPA Buffer لاستخراج البروتين من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة |
| أنابيب eppendorf الخالية من RNAse / DNAse | Denville | C-2172 | أنابيب معقمة مسبقا سعة 1.7 مل لجمع الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين في نهاية الفحص |
| إدراج | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell إدراج الخلايا العصبية ثلاثية التوائم في فحوصات الزراعة المشتركة |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) | Gibco | 25200056 | تستخدم لتفريق خلايا لب الأسنان |
| التربسين من النوع الثاني | Sigma-Aldrich | T-7409 | تستخدم للتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم |
| ملقط فائق الدقة | أدوات العلوم الدقيقة | 11370-40 | ملقط فائق الدقة لتشريح |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | يستخدم كمثبط انقسامي عند 1 & mu ؛ تركيز M في وسائط الزراعة المشتركة ، نظام الترشيح |
| الفراغي | Millipore | SCNY00060 | مرشح Steriflip القابل للتصرف ، 50 & mu ؛ م نايلون صافي فلتر |
| قارورة ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 110006-15 | ملقط طويل لنقل الأنسجة إلى المخاريط |
المراجع
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morph....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
