يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين

6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60809

⸱

فبراير 14, 2020

 ,  , 
1Cell, Developmental and Integrative Biology Department, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

نحن نصف العزلة والتشتت والطلاء من الخلايا الأولية لب الأسنان (DP) مع الخلايا العصبية ثلاثية التوائم (TG) المستزرعة فوق مرشحات عبر ويل فوق. يمكن تحليل الاستجابات الخلوية لخلايا DP مع الفلور المناعي أو تحليل الحمض النووي الريبي / البروتين. الفلور المناعي من علامات الخلايا العصبية مع المجهر المعالبؤر يسمح تحليل استجابات نمو النيوتر.

الملخص

يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. بدون تعصيب حسي ، فإن الأنشطة الشفوية اليومية ستسبب ضررًا لا يمكن إصلاحه. على الرغم من أهميتها ، تم تجاهل أدوار التعصيب في تطوير الأسنان وصيانتها إلى حد كبير. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا DP تفرز بروتينات مصفوفة خارج الخلية وإشارات الباراكرين لجذب وتوجيه محاور TG في جميع أنحاء السن. ومع ذلك ، قدمت دراسات قليلة نظرة مفصلة في الحديث المتبادل بين mesenchyme DP والخلايا العصبية afferents. ولمعالجة هذه الفجوة في المعرفة، بدأ الباحثون في استخدام الثقافات المشتركة ومجموعة متنوعة من التقنيات للتحقيق في هذه التفاعلات. هنا، ونحن نشرح الخطوات المتعددة المشاركة في الزراعة المشتركة الخلايا DP الأولية مع الخلايا العصبية TG المنتشرة على مرشح عبر ويل فوقمع المسام قطرها كبيرة للسماح نمو محور عصبي من خلال المسام. تم استخدام خلايا DP الأولية مع جين الفائدة محاطة بمواقع loxP لتسهيل حذف الجينات باستخدام نظام الـ Adenovirus-Cre-GFP recombinase. باستخدام الخلايا العصبية TG من الماوس Thy1-YFP يسمح للتصوير afferent دقيقة، مع التعبير أعلى بكثير من مستويات الخلفية عن طريق المجهر confocal. يمكن التحقيق في استجابات DP من خلال جمع وتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي ، أو بدلاً من ذلك ، من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا DP المطلية على قسائم الأغطية الزجاجية القابلة للإزالة. يمكن تحليل وسائل الإعلام باستخدام تقنيات مثل التحليلات البروتينية ، على الرغم من أن هذا سيتطلب استنفاد الزلال بسبب وجود مصل الأبقار الجنينفي في وسائل الإعلام. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة يمكن التلاعب بها لدراسة الاستجابات المورفولوجية والوراثية والهيكلية للخلايا العصبية TG وخلايا DP استجابة للبيئة الخاضعة للرقابة من تحليل الثقافة المشتركة.

المقدمة

يسمح تعصيب الأسنان للأسنان باستشعار الضغط ودرجة الحرارة والالتهاب ، وكلها حاسمة لاستخدام وصيانة جهاز الأسنان. يؤدي الفشل في الشعور بألم الأسنان المرتبط بتسوس الأسنان والصدمات النفسية إلى تطور المرض. وبالتالي ، فإن التعصيب السليم هو شرط لنمو الأسنان العادية ، وظيفة والرعاية.

في حين أن معظم الأجهزة تعمل بكامل طاقتها وتُدمج بحلول وقت الولادة ، فإن تطور الأسنان يمتد إلى حياة البالغين ، مع تعصيب الأسنان والتمعدن الذي يحدث بالتنسيق خلال مراحل ما بعد الولادة1،2. ومن المثير للاهتمام أن اللب الأسنان (DP) mesenchyme تفرز في البداية إشارات طاردة أثناء تكوين الأجنة لمنع دخول محور عصبي إلى جهاز الأسنان النامية ، والتي تتحول في وقت لاحق إلى إفراز عوامل جذب مع اقتراب الأسنان من ثوران3،4. خلال مراحل ما بعد الولادة ، تخترق المحاور المحورية من العصب الثلاثي التوائم (TG) في الأسنان وفي جميع أنحاء هافيالوقت الذي يبدأ فيه ترسب دنتين (تمت مراجعته في باجيلا ، P. وآخرون5). وقد أظهرت العديد من الدراسات في الجسم الحي أن التفاعلات العصبية-mesenchymal دليل تعصيب الأسنان في الفئران (استعرضت في لوكو، K. وآخرون6)،ولكن تفاصيل قليلة من الآليات الجزيئية المتاحة.

توفر الثقافات المشتركة للخلايا بيئات خاضعة للرقابة حيث يمكن للمحققين التعامل مع التفاعلات بين الخلايا العصبية والسكان الميسينشيم. تجعل تجارب الثقافة المشتركة من الممكن التعمق في مسارات الإشارات التي توجه تعصيب الأسنان وتطورها. ومع ذلك، فإن العديد من الأساليب التقليدية المستخدمة لدراسة الخلايا في الثقافة المشتركة تطرح تحديات تقنية. على سبيل المثال، يمكن تلطيخ الكريستال البنفسجي من النيوريت outgrowth غير محددة وصمة عار شوان الخلايا المدرجة في تشتت حزمة TG، وربما يكون هناك قمم في كثافة اللون مع استجابات صغيرة نسبيا7. تقدم غرف Microfluidic خيارًا جذابًا ، ولكنها أكثر تكلفة بكثير من مرشحات ترانسويل8،9 وتسمح فقط بالتحقيق في استجابات الخلايا العصبية لإفرازات DP. لمعالجة هذه القضايا، وضعنا بروتوكوليسمح ل: أ) تلطيخ دقيق والتصوير من نمو TG neurite استجابة لإفرازات DP، ب) التعديل الوراثي للخلايا DP و / أو الخلايا العصبية TG للتحقيق في مسارات إشارة محددة، و ج) التحقيق في استجابات خلايا DP للعوامل التي تفرزها الخلايا العصبية TG. يوفر هذا البروتوكول القدرة على التحقيق بدقة في العديد من ميزات تعصيب الأسنان في البيئة الخاضعة للرقابة في فحص الثقافة المشتركة في المختبر.

   

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب على الفئران من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في البنك العربي المتحد (IACUC).

1. إعداد لوحة

ملاحظة: يمكن استخدام قسائم التغطيات لتصوير خلايا DP في نهاية الفحص. تأكد من أن غطاء اللوحة موجود أثناء جميع خطوات الحضانة والإنضار خارج غطاء زراعة الأنسجة المعقمة لمنع التلوث أثناء معالجة العينات.

  1. إعداد قسيمة الغلاف
    1. التغطيات الدائرية الأوتوكلاف.
    2. تصفية المياه فائقة النقاء تحت غطاء محرك السيارة.
    3. نقل القسائم إلى لوحة 24 جيدا وتغطي كل واحد مع 400 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل بولي D-ليسين.
    4. السماح للcoverslips نقع، مغمورة لمدة 5 دقيقة، على الروك في 12 دورة في الدقيقة أو شاكر المداري في 40-50 دورة في الدقيقة. تأكد من أن الغطاء على منع التلوث.
    5. شطف القسائم مع المياه فائقة النقاء المصفاة لمدة 5 دقيقة على الروك في 12 دورة في الدقيقة أو شاكر في 50 دورة في الدقيقة. كرر.
    6. السماح للcoverslips لتجف لمدة 2 ساعة على الأقل تحت غطاء محرك السيارة مع غطاء لوحة قبالة لتسهيل التبخر. وينبغي استخدام هذه القسائم في غضون 48 ساعة.
    7. خلايا DP البذور فوق التغطيات وعملية في نهاية اختبار للفلورية المناعية (القسم 3.3).
  2. مرشحات الطلاء
    1. تمييع اللامينين إلى 10 ميكروغرام/مل. تصفية الصفيحة المخفف تحت غطاء محرك السيارة.
    2. ماصة 450-500 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/ مل لامينين في كل بئر من لوحة 24 جيدا.
    3. ضع فلتر ترانسويل، 3 ميكرومتر مسامية، في بئر بحيث يتصل بمحلول اللامينين وتركه في حاضنة 37 درجة مئوية إما لساعتين أو بين عشية وضحاها. يجب أن تسمح مسام الفلتر ببعض المحلول لنشر وطبقة أعلى وأسفل الفلتر. يجب استخدام هذه الفلاتر في غضون 48 ساعة أو أن تكون مبردة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

2. طلاء الخلايا مع التلاعب الجيني الاختياري

  1. الفئران: يمكن إجراء التغيير الوراثي لخلايا DP (ولكن ليس مطلوبًا) لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والمتوسطة. انظر القسمين 2.3 و 2.4 للاطلاع على الاختلافات الجينية المقترحة.
  2. تشريح DP والتشتت والطلاء(الشكل 1)
    ملاحظة: بالنسبة لتشريح DP، استخدم ملقط ًا فائق الدقة ومستقيم ًا. وحواف فائقة غرامة تسمح للمستخدم لإسفين حافة forcep بين الهيكل المععدن والأنسجة DP.
    1. حصاد الفئران P5-P8. في هذه المرحلة ، يجب أن تكون الأسنان تمعدن ، والجذر مفتوح.
    2. تخدير الولدان عن طريق انخفاض حرارة الجسم عن طريق وضعهم في طبق في الثلاجة 4 درجة مئوية حتى لا يتحركوا بعد الآن أو يستجيبون للمس. القتل الرحيم الولدان عن طريق قطع الرأس ووفقا لإجراءات IACUC في المرفق المعين.
    3. إعداد 3-5 مل aliquot من 0.25٪ التربسين-EDTA في أنبوب مخروطي 50 مل لجمع DP من كل فأرة. وهذا سوف يسهل هضم لب الأسنان من الفئران بعد الولادة. استخدم أكثر من 3 مل إذا هضم الأنسجة من أكثر من 10 فئران ما بعد الولادة.
    4. ضع الرأس على لوحة تحت ية يمكن التخلص منها بحيث يكون الفم نحو السقف وقاعدة الرقبة مسطحة على سطح العمل. استخدام شفرة حلاقة في حركة منشار لفصل الفك السفلي من الفك العلوي.
    5. إزالة اللسان اختياريا إما مع مقص أو مع ملقط للسماح بالوصول إلى أسهل الأضراس.
    6. ضع الرأس المفتوح في طبق فوق وسادة شاش معقمة وضع العينة تحت مجهر تشريح(الشكل 1D).
    7. إزالة أنسجة العظام السنخية المحيطة الأضراس الأولى. لا تثور الأسنان تحت الفك السفلي بالكامل في هذه المرحلة. أدخل الملقط في فتح السنخية وندف الأنسجة بعيدا عن الأسنان نحو الصد (الخد) أو اللغوية (اللسان) الجانب من الفم. سوف الأسنان الفك العلوي تتطلب إزالة كاملة من مشقوق حول الأسنان للتعرض وإزالتها.
    8. نقل بلطف الأضراس الأولى تحت الفك السفلي والفك العلوي (M1s) إلى طبق ثقافة خلية منفصلة مع 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
    9. كرر 2.2.4-2.2.8 حتى يتم جمع جميع M1s. الحفاظ على الطبق الذي يحتوي على M1s على الجليد أثناء الحصاد.
    10. قم بإزالة الجهاز الخارجي للمينا (EOE) المحيط بالجزء الخارجي من كل M1. ويمكن أن يتم ذلك بدلا ً من ذلك بعد الخطوة 2.2.11.
    11. مع مجموعة من ملقط، تدوير M1 بحيث cusps أسفل ويتعرض الجذر المفتوح. سيكون هناك فتحة بيضاوية على الجزء السفلي من الأسنان، وأنسجة DP مبهمة مغلفة بطبقة رقيقة من العاج والمينا.
    12. باستخدام طرف ملقط، تخفيف بلطف DP عن طريق تشغيل ذراع واحد من ملقط حول محيط الداخلية للأنسجة المعدنية. إزالة الأنسجة DP من الهيكل المعدني ونقلها إلى طبق ثالث يحتوي على 1x PBS. إزالة EOE إذا لم يكن مفصولًا بالفعل(الشكل 1E).
    13. نقل جميع الأنسجة DP إلى 0.25٪ التربسين-EDTA في أنبوب مخروطي 50 مل. دوامة الخليط ومكان في حمام الماء الدافئ 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ويمكن القيام بذلك مع نفس اللقط أو مع ملقط قارورة طويلة. الأنسجة سيكون من الصعب تفريق وسوف تتطلب دوامة كل 3-4 دقيقة. لا تتجاوز 10 دقيقة التربسين منذ التربسين يمكن أن تلحق الضرر أغشية الخلايا.
    14. تحت غطاء محرك السيارة المعقم، أضف وسائط الثقافة المشتركة الدافئة(الجدول 1)إلى نسبة نهائية لا تقل عن 1:1 وسائط للالتربسين لتعطيل الإنزيم. نسب أكبر مقبولة إذا كان المطلوب المزيد من تشتت الأنسجة.
    15. ماصة وسائل الإعلام صعودا وهبوطا عدة مرات مع ماصة 10 مل لمزيد من تفريق DP في وسائل الإعلام. يجب الحرص على تجنب فقاعات كبيرة. التشتت الكامل يكاد يكون مستحيلا بسبب الطبيعة اللزجة للأنسجة. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري أيضا منذ الخلايا سوف تهاجر إلى الخارج من الأنسجة مرة واحدة مطلي.
    16. نقل 1 مل من DP مشتتة إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24-well(الشكل 1F).
    17. ضع اللوحة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واسمح للخلايا بإرفاقها وترحيلها من الأنسجة غير المشتتة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط. الخلايا الأولية تحتاج إلى أن تكون مطلية بتركيزات عالية نسبيا من أجل الوصول إلى 85-90٪ التقاء في غضون أسبوع واحد. إذا لم يتحقق ذلك بعد أسبوع واحد، تخلص من الطبق.
  3. التلاعب الوراثي الاختياري لخلايا موانئ دبي
    1. لتغيير مسارات إشارات الخلايا، حصاد خلايا DP من الفئران بالضربة القاضية الوراثية أو من الفئران التي يحيط بها جين من الفائدة من قبل مواقع loxP. في الحالة الأخيرة، يمكن حذف الجين باستخدام أدينو فيروس-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) المؤتلف لإزالة الجين المحيط، كما هو موضح أدناه. استخدم Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) كفيروس تحكم لضمان عدم تسبب العدوى الفيروسية في استجابة خلوية.
      ملاحظة: يتم التحكم في Ad-eGFP بواسطة محسن مروج CMV، وهو قوي جداً. يتم تنظيم Ad-Cre-GFP من قبل IRES ، وهي منطقة تنظيمية داخلية بين Cre و GFP ، وهي ليست قوية جدًا. وهذا يؤدي إلى سطوع أكثر إشراقا في خلايا Ad-eGFP من خلايا Ad-Cre-GFP. تأكيد مستويات العدوى المكافئة على أساس العدد الإجمالي للخلايا الفلورية، وليس على مستويات الفلورسين الخلوي.
    2. إعداد 500 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على فيروس و 10 ميكروغرام/مل من البوليبرين لكل بئر. Polybrene يساعد مع العدوى الفيروسية في الخلايا بالقرب من التقاء10. ويستند هذا البروتوكول على تعدد العدوى (MOI) من 100 لAd-eGFP و 200 Ad-Cre-GFP لعدوى الجينات فعالة مع تأثير ضئيل أو معدوم على صلاحية الخلية. عدد الخلايا المقدر هو 4 × 104 خلايا / بئر من لوحة 24-well:
      figure-protocol-1
    3. مزيج وسائل الإعلام مع دوامة قصيرة أو pipetting وإضافة 500 ميكرولتر إلى كل بئر.
    4. بعد 24 ساعة، إضافة 500 ميكرولتر إضافية من الوسائط الثقافة المشتركة التي لا تحتوي على بوليبرين إضافية أو فيروس.
    5. بعد ما مجموعه 48 ساعة، يستنشق الوسائط التي تحتوي على الفيروسات واستبدالها بوسائط ثقافية مشاركة جديدة. عند هذه النقطة، يمكن إضافة الخلايا العصبية TG فوق مرشحات عبر ويل.
  4. تشريح الخلايا العصبية الثلاثية التوائم والتشتت والطلاء
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم تحسين تصوير نمو النيوتر في الثقافة المشتركة مع خلايا DP باستخدام المراهقين (6 أسابيع) B6.Cg-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J الفئران. الأنظمة العصبية المركزية والمحيطية للفئران Thy1-YFP لديها علامة بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) الذي يبدأ التعبير حول P6-P10 في الخلايا العصبية ويزيد أضعافا مضاعفة في جميع أنحاء الجهاز العصبي خلال فترة ما بعد الولادة وحياة الكبار11,12. وقد حافظت YFP وGFP تسلسل التي تسمح لهذه الأعصاب لتكون ملطخة مع الأجسام المضادة GFP، مما أدى إلى وصمة عار عموم الخلايا العصبية. في نهاية المطاف، تسمح هذه الفئران لتصور أفضل والقياس الكمي للخلايا العصبية المستخدمة ونمت في ثقافة الخلايا.
    1. قتل فئران المراهقين مع ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم.
    2. قطع رأس الفئران وإزالة الجلد من الجمجمة. تأكد من تضمين أعداد مكافئة من الذكور والإناث.
    3. أدخل طرف زوج من مقص تشريح الصغرى في قاعدة الجمجمة. قطع على طول خياطة القوس من الجمجمة(الشكل 1A).
    4. جعل أربعة تخفيضات أفقية صغيرة: اثنين على طول الغرز التاجية من الأذنين، واثنين على طول الغرز lambdoid في قاعدة الجمجمة. هذا يجب أن يخلق اثنين من اللوحات من العظام.
    5. استخدام ملقط لتقشير مرة أخرى اثنين من اللوحات من العظام. هذا يجب أن يكشف عن الدماغ.
    6. إزالة الدماغ. نقل الرأس إلى طبق زراعة الأنسجة مع 1x PBS ووضعها تحت المجهر.
    7. تحديد موقع العقدة TG، والتي يمكن رؤيتها بسهولة في القوارض13،تقع في المادة دورا بين الدماغ والعظام من عملية الفك العلوي(الشكل 1B).
    8. قطع الفروع الثلاثة التي تسافر إلى العينين، maxillae والفك السفلي ونقل العقد إلى 1x الباردة PBS باستخدام ملقط غرامة على التوالي الحافة. الحفاظ على الطبق الذي يحتوي على العقد TG على الجليد أثناء الحصاد.
    9. مرة واحدة يتم حصاد جميع حزم TG، نقل العقد إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 5 ملغ / مل الكولاجين المعقمة تصفية نوع الثاني باستخدام ملقط القارورة.
    10. دوامة الكولاجين مع حزمة TG ووضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25-30 دقيقة. خلال هذا الوقت، واتخاذ أنبوب مخروطي من حمام الماء، دوامة، والعودة إلى الحمام كل 5-10 دقيقة.
    11. الطرد المركزي حل الخلايا العصبية الكولاجين TG لمدة 2 دقيقة في 643 × ز.
    12. تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، يستنشق بلطف الكولاجين مع ميكروبيبيت.
    13. أضف 5 مل من 1٪ التربسين المعقم من النوع الثاني والدوامة. ضع الأنبوب المخروطي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 سنوات.
    14. الطرد المركزي مزيج التربسين-TG لمدة 5 دقيقة في 643 × ز. إزالة الجزء العلوي من التربسين مع ميكروبيبيت, بحيث لا تتم إزالة الخلايا العصبية TG. سيظل هناك سائل في الأنبوب
    15. إضافة ما يكفي من وسائل الإعلام لإلغاء تنشيط التربسين المتبقية (بنسبة 1:1 أو أقل من التربسين إلى وسائل الإعلام).
    16. عد عدد الخلايا وتمييع المحلول إلى 200،000 خلية / مل (250 ميكرولتر من الخلايا التي تحتوي على 50،000 خلية).
    17. ضع مرشحات الترانسويل المغلفة من القسم 1.2 إلى آبار مع DP.
    18. تمييع المحلول الذي يحتوي على الخلية بحيث يكون هناك 200,000 خلية/مل. ماسيت 250 ميكرولتر على مرشح transwell، وثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها(الشكل 1F).
    19. في اليوم التالي، استبدال وسائل الإعلام مع 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة المشتركة مع 1 μM uridine و 15 μM 5'-فلور-2'deoxyuridine لوقف الانتشار المفرط للخلايا المتوسطة التي قد تمنع نمو النيوتيور. اختياري: إضافة عوامل النمو أو مثبطات في هذه الوسائط إذا حاولت المزيد من التلاعب.
    20. ثقافة الخلايا للحصول على نقاط زمنية إضافية مطلوبة. تم تحسين هذا البروتوكول لمدة 5 أيام إجمالية من الثقافة مع تغيير الوسائط فقط في اليوم 2 لإضافة مثبطات mitotic. تتطلب الفترات الزمنية الأطول تغييرات إضافية في الوسائط.

3. جمع العينات ومعالجتها

  1. تلطيخ ثلاثي التوائم
    1. ماسيت 1 مل aliquots من 1x PBS المعقم في لوحة 24 جيدا تحت غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة لكل مرشح transwell ليتم معالجتها.
    2. إزالة السائل فوق مرشح تتم إزالتها مع ماصة 200-1000 ميكرولتر، مع الحرص على ترك طبقات الخلية سليمة. وينبغي أن تبقى الخلايا المرفقة المرفقة والخلايا غير المرفقة سوف تأتي فضفاضة خلال هذا pipetting لطيف. مرشح فراغ يمكن أن تلحق الضرر طبقة الخلية وليس من المستحسن للطموح.
    3. نقل مرشح إلى لوحة PBS 1x، مع التأكد من إزالة الطبقة العليا من وسائل الإعلام كما ذكر في الخطوة السابقة.
    4. ضع اللوحة مع جميع المرشحات والأغطية عبر ويل على الروك في 12 دورة في الدقيقة أو 40-50 دورة في الدقيقة على شاكر المداري لمدة 10 دقيقة.
    5. يستنشق برنامج تلفزيوني، بما في ذلك الطبقة العليا كما هو موضح أعلاه، إضافة 500 ميكرولتر من 1xPBS ووضع على الروك أو شاكر المداري لشطف إضافية 5-10 دقيقة.
    6. يستنشق 1x PBS مرة أخرى واستبدالها بنسبة 4٪ paraformaldehyde (PFA). استخدم ما لا يقل عن 500 ميكرولتر بحيث يتم غمر سطح الفلتر بالكامل. ضع اللوحة على الروك عند 12 دورة في الدقيقة أو شاكر مداري عند 40-50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    7. إزالة PFA وشطف لوحات مرتين لمدة 5-10 دقيقة لكل منعلى الروك مع 500 ميكرولتر من 1x PBS.
    8. كتلة مع 10٪ الألبومين مصل البقر (BSA) + 5٪ مصل الماعز / حمار، اعتمادا على الحيوان المضيف الأجسام المضادة الثانوية، في 0.05٪ Tween-1xPBS (PBST). استخدام 450-500 ميكرولتر من المحلول بحيث يتم غمر الفلتر في السائل.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين هذه اللوحات عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر لمعالجتها في وقت لاحق. استخدم البارفيلم لختم اللوحة لضمان عدم حدوث التبخر والتحقق بانتظام من التبخر بحيث تظل أسطح التصفية مغمورة بالمياه.
    9. إزالة كتلة وإضافة 450-500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA-PBST دون شطف إضافية. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، هزاز بلطف.
    10. إزالة محلول الأجسام المضادة الأولية وشطف مع 500 ميكرولتر من 1xPBST على الروك، 3 مرات، في درجة حرارة الغرفة
    11. إزالة PBST، إضافة الأجسام المضادة الثانوية واحتضان على الروك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ملفوفة في رقائق الألومنيوم لحماية الفلوروفوريات من تدهور الضوء. شطف مرة أخرى، 3 مرات، مع 1x PBST على الروك في درجة حرارة الغرفة. استبدال مع 1x PBS.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين لوحة لعدة أشهر في 4 درجة مئوية إذا ملفوفة في رقائق الألومنيوم لمنع تدهور الفلوروفور. استخدم البارفيلم لختم اللوحة لضمان عدم حدوث التبخر والتحقق بانتظام من التبخر بحيث تظل أسطح التصفية مغمورة بالمياه. فمن الأفضل أن صورة في غضون شهر واحد.
    12. للتصوير الأمثل، والاستفادة من الخلايا العصبية الماوس Thy1-YFP مع الأجسام المضادة GFP لوصمة عار على وجه التحديد afferents الخلايا العصبية أعلى بكثير من مستويات الخلفية. استخدام المضادة Neurofilament 200 لوصمة عار بدقة الهياكل المحورية إذا كانت الفئران Thy1-YFP غير متوفرة.
    13. الصورة على النحو المطلوب. لا تحتاج الفلاتر إلى أن تكون مطلية ويمكن بدلاً من ذلك وضعها فوق قسيمة تغطية أو شريحة للتصوير باستخدام مجهر مقلوب.
      ملاحظة: لن تحتوي مناطق عامل التصفية على بنيات afferent. التقط العديد من الصور بعمق z-stack الذي يلتقط جميع الهياكل الخالية من المباني. استخدام برنامج خياطة لتصور نمو النيوتر على مساحات واسعة، أو (يفضل) مناطق التصفية بأكملها.
  2. الحمض النووي الريبي والبروتين وجمع وسائل الإعلام
    1. في حين أن مرشحات transwell هي المعالجة ، وجمع وسائل الإعلام في RNAse / DNAse الأنابيب الخالية وتجميد للمقالات اللاحقة (ELISA ، البروتينات ، الخ).
    2. مباشرة بعد جمع وسائل الإعلام، aliquot العازلة الليكوت أو الراديو المناعي ة الترسيب العازلة (RIPA) العازلة مع البروتينات ومثبطات فوسفاتاز في الآبار. تم تحسين هذا البروتوكول ل100 ميكرولتر / جيد في لوحة 24-well.
    3. السماح للمخازن المؤقتة لخلايا lyse لمدة 5 دقيقة، ثم كشط كل مرشح مع تلميح ماصة جديدة، وجمع عينات الخلية في أنابيب RNAse/DNAse الخالية. تجميد تحليل للمقالات المستقبلية (شبه الكمية و / أو الكمية PCR، لطخة الغربية، الخ).
  3. الفلور المناعي الاختياري لخلايا لب الأسنان:
    1. رفع بلطف القسائم من القسم 1.1 مع ملقط ونقلها إلى آبار مختلفة مع 4٪ PFA ل1 ساعة مع هزاز.
    2. اسشق PFA وشطف التغطيات مرتين مع 1x PBS. اتبع هذا مع permeabilization، وحجب ومثبطات المناعة لعلامات الفائدة مع تقنيات الفلورة المناعية القياسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذه النتائج تبين أن TG neurite النمرة قد زاد في وجود خلايا DP الأولية في البئر الكامنة مقارنة مع السيطرة على TG النوريت أحادية الاستزراع(الشكل 2A, C). هناك بعض التقلبات من أجل التقافي في نمو النيوت. وهكذا، ينبغي إدراج الثقافة العصبية TG monoculture في جميع المقالات كتحكم للكشف عن المستويات القاعدية للنتروجين النيوريت. تم استخدام الخلايا الأولية من الماوس Tgfbr2و / و في هذا البروتوكول بعد أن تم تأكيد عدوى Ad-Cre-GFP وAd-eGFP بأعداد مكافئة من الخلايا

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تتطلب الأنشطة اليومية لتجويف الفم أن تستشعر الأسنان المحفزات الخارجية والالتهاب اتّهات داخليًا من أجل السماح بالاستخدام السليم والصيانة. ومع ذلك ، لا تتوفر سوى معلومات محدودة بشأن الإشارات التي تحرك عمليات تطوير تعصيب الأسنان. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل والمشاركة في زراعة خلايا DP الأولية والخلايا العصبية TG من أجل دراسة الاتصال المتبادل بين السكان. وتم تحسين العديد من المتغيرات وترك سبل البحث مفتوحة، على النحو المبين أدناه.

الضوابط مهمة في كل خطوة في هذا المنقّي. يجب تضمين مرشح ترانسويل م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل أ) المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS (أرقام المنحR01 AR062507 و R01 AR053860 إلى RS) ، ب) جامعة ألاباما في برمنغهام التدريب الأكاديمي للبحوث الأكاديمية (DART) منحة (رقم T90DE0022736 (PI MacDougall)) إلى SBP من المعهد الوطني لبحوث الأسنان والعناية بالجمجمة / المعاهد الوطنية للصحة ، ج) مركز الجامعة العربية العربية العالمي لاضطرابات الوجه القحفي والفم والأسنان (GC-CODED) نموذج تجريبي ومنحة جدوى لSBP و d) المعهد الوطني لطب الأسنان والوجه القحفي البحوث / المعاهد الوطنية للصحة K99 DE024406 منحة إلى SBP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-Fluoro-2'-deoxyuridineSigma-AldrichF0503يستخدم كمثبط انقسامي عند 15 & mu ؛ تركيز M في وسائط الزراعة المشتركة ، اليوم 2
24 لوحة ثقافة الخلايا الجيدةCorning3524لوحة الزراعة المشتركة
Alexa-546InvitrogenA-11040الثانوية لنمو العصبية المضادة للبقع المسمى بالجسم المضاد المضاد ل GFP ، 1: 500 التخفيف
المضاد للأجسامل GFP Aves Lab، IncGFP-1010الجسم المضاد الأساسي لتسمية الخلايا العصبية Thy1-YFP ، 1: 200 التخفيف
المضاد للخيوط العصبية 200 جسم مضادSigma-AldrichNO142جسم مضاد أولي أحادي النسيلة لتسمية الخلايا العصبية ، تخفيف 1: 1000 ، بديل إذا لم تكن الفئران YFP
متوفرة B6 ؛ 129- Tgfbr2tm1Karl / Jمختبر جاكسون12603Tgfbr2f / f< / sup> نموذج فأر يستخدم لخلايا لب الأسنان في بروتوكول B6
الأمثل. Cg-Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / Jمختبر جاكسون3709النمط الجيني لنموذج الفأر Thy1-YFP المستخدم في الخلايا العصبية ثلاثية التوائم
الكولاجيناز النوع الثانيميليبور234155-100مجم يستخدم لتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم
مصل الأبقار الجنينيجيبكو10437مادة مضافة لوسائط الزراعة
المشتركة ملقط ناعمأدوات العلوم الدقيقة11413-11ملقط دقيق لتشريح TG
LamininSigma-AldrichL2020يغطي إدخالات transwell بتركيز نهائي يبلغ 10 مو ؛ جم / مل ، يفترض محلول المخزون عند 1.5 مجم / مل
محلول التحلل المؤقت (Buffer RLT)Qiagen79216يستخرج الحمض النووي الريبي من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة
L-GlutamineGibco25030081مادة مضافة لوسائط الزراعة المشتركة
مقص تشريح دقيقSigma-AldrichS3146-1EAمقص تشريح لفتح غطاء مجهر الجمجمة
Fisherbrand12-545-81غطاء دائري لزراعة الخلايا الاختيارية ومعالجة التألق المناعي
الحد الأدنى من الوسط الأساسي AGibco12571063قاعدة وسائط الزراعة
Penicillin-StreptomycinGibco15070063مضاف مضاف للمضادات الحيوية لوسائط الزراعة المشتركة
مثبطات الفوسفاتيزSigma-Aldrich04 906 837 001مادة مضافة إلى RIPA Buffer لاستخراج البروتين من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة
PolybreneMilliporeTR-1003-Gتستخدم للمساعدة في تعداء خلايا لب الأسنان
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280طلاء Coverslip للمساعدة في الالتصاق خلوي لب الأسنان
مثبطات الإنزيم البروتينيMillipore05 892 791 001مادة مضافة إلى RIPA Buffer لاستخراج البروتين من خلايا لب الأسنان بعد الزراعة المشتركة
أنابيب eppendorf الخالية من RNAse / DNAseDenvilleC-2172أنابيب معقمة مسبقا سعة 1.7 مل لجمع الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين في نهاية الفحص
إدراجGreiner Bio-One662631Transwell إدراج الخلايا العصبية ثلاثية التوائم في فحوصات الزراعة المشتركة
Trypsin-EDTA (0.25٪)Gibco25200056تستخدم لتفريق خلايا لب الأسنان
التربسين من النوع الثانيSigma-AldrichT-7409تستخدم للتفريق الخلايا العصبية ثلاثية التوائم
ملقط فائق الدقةأدوات العلوم الدقيقة11370-40ملقط فائق الدقة لتشريح
UridineSigma-AldrichU3750يستخدم كمثبط انقسامي عند 1 & mu ؛ تركيز M في وسائط الزراعة المشتركة ، نظام الترشيح
الفراغيMilliporeSCNY00060مرشح Steriflip القابل للتصرف ، 50 & mu ؛ م نايلون صافي فلتر
قارورة ملقطأدوات العلوم الدقيقة110006-15ملقط طويل لنقل الأنسجة إلى المخاريط
المضادة المشتركة لليوم 2

المراجع

  1. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
  2. Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  3. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  4. Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
  5. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
  6. Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
  7. Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
  8. de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
  9. Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).
  10. Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
  11. Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
  12. Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
  13. Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
  14. Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
  15. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).
  16. Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
  17. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
  18. Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
  19. Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
  20. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
  21. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  22. Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799(2016).
  23. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).
  24. Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

خلايا لب الأسنانعصبونات العصب ثلاثي التوائممرشح ترانسويل (Transwell)Adenovirus-Cre-GFPفأر Thy1-YFPالمجهر البؤريالتصبيغ المناعي الفلوريالتحليل البروتومي
طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.