Method Article

قياس مستقبلات مكملة الإريثروسيت 1 باستخدام قياس التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذه الطريقة هو تحديد كثافة CR1 في كريات الدم الحمراء من أي موضوع عن طريق مقارنة مع ثلاثة مواضيع التي يعرف كثافة CR1 الكريات الحمراء. تستخدم هذه الطريقة قياس الخلايا المتدفقة بعد المناعة من كريات الدم الحمراء للأشخاص بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CR1 إلى جانب نظام مضخم باستخدام phycoerythrin (PE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (CD35, مكمل مستقبلات نوع 1 لC3b/C4b) هو غشاء الوزن الجزيئي عالية جليكوبروتين من حوالي 200 كيلو دا التي تسيطر على استكمال التنشيط, ينقل المجمعات المناعية, ويشارك في استجابات المناعة الفكاهية والخلوية. CR1 موجود على سطح العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك كريات الدم الحمراء، ويعرض تعدد الأشكال في الطول، والهيكل (Knops، أو KN، مجموعة الدم)، والكثافة. متوسط كثافة CR1 لكل كريات الدم الحمراء (CR1/E) هو 500 جزيء لكل كريات الدم الحمراء. تختلف هذه الكثافة من فرد إلى آخر (100-1200 CR1/E) ومن كريات حمراء إلى أخرى في نفس الشخص. نقدم هنا طريقة قوية لقياس الخلايا المتدفقة لقياس كثافة CR1/E ، بما في ذلك في الموضوعات التي تعبر عن كثافة منخفضة ، بمساعدة نظام تضخيم المناعة. وقد مكنتنا هذه الطريقة من إظهار انخفاض التعبير عن كريات الدم الحمراء CR1 في أمراض مثل مرض الزهايمر (AD) ، الذئبة الجهازية erythematosus (SLE) ، الإيدز ، أو الملاريا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (استكمال مستقبلات النوع 1، CD35) هو 200 كيلو دا بروتين سكري عبر الغشاء الموجود على سطح العديد من أنواع الخلايا، مثل كريات الدم الحمراء1،B الخلايا الليمفاوية2،الخلايا الأحادية، بعض الخلايا التائية،خلايادالجريب 3، الخلايا الفلكية الجنينية4،والخلايا البوائية الكروية5. CR1 التدخل مع ليغاندس C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,,9,وحدة فرعية من مكون تكملة الأولى, C1q10 و MBL (المنان ملزمة lectin)11....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استعرضت لجنة الأخلاقيات الإقليمية بروتوكول جمع الدم البشري والتعامل معه ووافقت عليه، ورقم البروتوكول هو 2011-A00594-37. ولأن البروتوكول التالي يصف التعامل مع الدم البشري، ينبغي اتباع مبادئ توجيهية مؤسسية للتخلص من المواد الخطيرة بيولوجياً. يجب ارتداء معدات السلامة المختبرية، مثل معاطف المختبر والقفازات.

1. غسل كريات الدم الحمراء

ملاحظة: في اليوم السابق للمعالجة، قم بإعداد عازل PBS-BSA مع محلول ملافي احتياطي للفوسفات (PBS) يحتوي على 0.15٪ من ألبوم مصل البقر (BSA) ووضعه في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت كمخزن مؤقت للغسيل وكمخزن مؤقت للتخفيف.

  1. Pipette 20 مل من PBS-BS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكريات الحمراء من ثلاثة مواضيع التي من المعروف كثافة CR1 ("منخفضة" الموضوع [180 CR1/E], موضوع "متوسط" [646 CR1/E]، وموضوع "عالية" [966 CR1/E])، ومن بين اثنين من المواضيع التي كثافة CR1 التي تحتاج إلى تحديد كانت مناعية من قبل الأجسام المضادة المضادة لCR1 إلى جانب نظام تضخيم باستخدام فلوروكروم phycoerythrin. في البداية ، تم تحديد كثافة CR1 للمواضيع من النطاق المنخفض المرتفع بواسطة طريقة Scatchard29 باستخدام الأجسام المضادة المسماة إشعاعيًا. المعايير (منخفضة ومتوسطة وعالية) تم استخدامها لمنحنى المعا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتوفر العديد من التقنيات لتحديد كثافة الكريات الدم الحمراء CR1 (CR1/E). وكانت التقنيات الأولى المستخدمة agglutination من خلايا الدم الحمراء من قبل الأجسام المضادة المضادة لCR131 وتشكيل الورود في وجود كريات الدم الحمراء المغلفة مع C3b32. تم استبدال هذه التقنيات البدائية بسرعة بأساليب المناعة باستخدام الأجسام المضادة لـ CR1 المسماة بالراديو1،33. من الممكن أيضًا قياس تركيز CR1 في مستخلصات الأغشية عن طريق الفحص المناعي .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جميع أعضاء URCACyt ، منصة قياس الخلايا التدفق ، وموظفي قسم علم المناعة ، وموظفي قسم الطب الباطني وطب الشيخوخة ، الذين ساهموا في تحسين البروتوكول والتحقق من صحته. تم تمويل هذا العمل من قبل مستشفيات جامعة ريمس (رقم المنحة AOL11UF9156).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000E حاجز تلميحثيرمو فيشر العلمي ، F-67403 Illkirch ، فرنسا2079Eعينة ماصة
1-100 & micro ؛ L مشطوفة ، طرف مرشحStarlab GmbH ، D-22926 Ahrenburg ، ألمانياS1120-1840عينة ماصة
الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للبيوتينيل المضاد CR1 (J3D3)الإنتاج المنزلي للأجسام المضادة أحادية النسيلة غير التجارية ، بإذن من الدكتور J. Cook
Bovin مصل الألبومين (7,5٪)Thermo Fischer Scientific ، F-67403 Illkirch ، فرنسا15260037القياس الخلوي
الطرد المركزيثيرمو فيشر العلمي ، F-67403 Illkirch ، فرنسا11176917الطرد المركزي
الحل النظيفBD ، F-38801 Le Pont de Claix ، فرنسا340345القياس الخلوي
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS ، F-67172 Brumath944060P
مقياس الخلوي للرف & طقم حبات التتبعBD ، F-38801 Le Pont de Claix ، فرنسا655051القياس الخلوي
محلول الفورمالديهايد 36.5٪سيجما ألدريتش ، F-38070 سانت كوينتين فالافييه ، فرنساF8775-25MLتثبيت
10 & micro ؛ L تخرج ، طرف مرشحStarlab GmbH ، D-22926 Ahrenburg ، ألمانياS1121-3810عينة ماصة
LSRFORTESSA مقياس التدفق الخلويBD ، F-38801 Le Pont de Claix ، فرنسا647788قياس الخلايا
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS ، F-67172 Brumath067494عينة ماصة
Micronic 1.40 مل أنابيب قاعية مستديرةDominique DUTSCHER SAS ، F-67172 BrumathMP32051مزيج
Micropipette Microman - النوع M25 -Dominique DUTSCHER SAS ، F-67172 Brumath066379عينة ماصة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ThermoFischer Scientific ، F-67403 Illkirch ، فرنسا10010031الخلايا
Pipette PS 325 مم ، 10 ملDominique DUTSCHER SAS ، F-67172 Brumath391952عينة ماصة
خالية من مسحوق النتريل قفازاتMedline Industries، Inc ، Mundelein ، IL 60060 ، الولايات المتحدة الأمريكية486802حماية العينة
المرجع 2 ماصة ، 0،5-10 & micro ؛ LEppendorf France SAS ، F-78360 Montesson ، فرنسا4920000024عينة ماصة
مرجع 2 ماصة ، 20-100 & micro ؛ LEppendorf France SAS ، F-78360 Montesson ، فرنسا4920000059عينة ماصة
مرجع 2 ماصة ، 100-1000 & micro ؛ LEppendorf France SAS ، F-78360 Montesson ، فرنسا4920000083عينة ماصة
محلول شطفBD ، F-38801 Le Pont de Claix ، فرنسا340346القياس الخلوي
أنبوب القاعالمستدير Sarstedt ، F-70150 Marnay ، فرنسا55.1579الخلايا
أنابيب القفل الآمن ، 1.5 ملEppendorf France SAS ، F-78360 Monteson ، فرنسا0030120086مزيج
ستربتافيدين R-PETebu Bio ، F-78612 Le Perray-en-Yvelines ، فرنساAS-60669
الطرد المركزي المدببة المناعية 50 ملThermo Fischer Scientific ، F-67403 Illkirch ، فرنسا10203001مزيج
ناقلات مضادة للستربتافيدين البيوتينEurobio Ingen ، F-91953 Les Ulis ، فرنساBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries، Inc ، بوهيميا ، نيويورك 111716 ، الولايات المتحدة الأمريكيةSI-0236ميكس
حماية بلوزة تلطيخ المناعي إعداد قياس قياس أنابيب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

Related Articles