يتم إنشاء و وصف بروتوكول تعدين الجينوم الموجه قياس الطيف الكتلي هنا. وهو يستند إلى معلومات تسلسل الجينوم وتحليل LC-MS/MS ويهدف إلى تسهيل تحديد الجزيئات من المستخلصات الميكروبية والنباتية المعقدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج الجينوم الموجه بالطيف الكتلي كأداة للكشف عن المنتجات الطبيعية الجديدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المساحة الكيميائية التي تغطيها المنتجات الطبيعية هائلة وغير معترف بها على نطاق واسع. ولذلك، فإن المنهجيات الملائمة لإجراء تقييم واسع النطاق لوظائفها من حيث طبيعتها والفوائد البشرية المحتملة (مثل تطبيقات اكتشاف العقاقير) هي المنـزل. يصف هذا البروتوكول الجمع بين تعدين الجينوم (GM) والشبكات الجزيئية (MN)، وهما نهجان معاصران يطابقان التعليقات التوضيحية المشفرة العنقودية الجينية في تسلسل الجينوم الكامل مع توقيعات البنية الكيميائية من المستخلصات الأيضية الخام. هذه هي الخطوة الأولى نحو اكتشاف كيانات طبيعية جديدة. هذه المفاهيم، عند تطبيقها معا، يتم تعريفها هنا على أنها تعدين الجينوم الموجه MS. في هذه الطريقة، يتم تعيين المكونات الرئيسية مسبقًا (باستخدام MN)، وترتبط المرشحين الجدد ذات الصلة هيكلياً بالتعليقات التوضيحية لتسلسل الجينوم (باستخدام جنرال موتورز). الجمع بين جنرال موتورز وMN هو استراتيجية مربحة لاستهداف العمود الفقري جزيء جديد أو حصاد ملامح التمثيل الغذائي من أجل تحديد نظائرها من المركبات المعروفة بالفعل.
المقدمة
غالبًا ما تتكون تحقيقات التمثيل الغذائي الثانوي من فحص المستخلصات الخام لأنشطة بيولوجية محددة يتبعها تنقية وتحديد وتوصيف المكونات التي تنتمي إلى كسور نشطة. وقد أثبتت هذه العملية كفاءتها، مما يعزز عزل العديد من الكيانات الكيميائية. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر يعتبر هذا غير ممكن ، ويرجع ذلك أساسا إلى ارتفاع معدلات إعادة اكتشاف. وبما أن صناعة الأدوية أحدثت ثورة دون معرفة أدوار ووظائف الأيض المتخصصة، فقد تم تحديدها في ظروف مختبرية لا تمثل الطبيعة بدقة1. اليوم ، هناك فهم أفضل لتأثيرات الإشارات الطبيعية ، والإفراز ، ووجود معظم الأهداف بتركيزات منخفضة بشكل لا يمكن اكتشافه. بالإضافة إلى ذلك، سيساعد تنظيم العملية المجتمع الأكاديمي وصناعة الأدوية على الاست....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- تعدين الجينوم لمجموعات الجينات الاصطناعية الأحيائية
- تنفيذ تسلسل الجينوم الكامل (WGS) كخطوة أولى لانتخاب مجموعة جينات اصطناعية بيولوجية (BCG) لتعدين الجينوم الموجه بالتصلب المتعدد. ويمكن الحصول على مشروع الجينوم كله من سلالة من الفائدة (البكتيريا) من قبل تكنولوجيا MiSeq Illumina باستخدام ما يلي مع الحمض النووي الجينومي عالية الجودة: بندقية TruSeq PCR خالية مكتبة الإعدادية وNextera ماتي زوج مكتبة إعداد كيت33.
ملاحظة: بعد التسلسل، يمكن تجميع مكتبة بندقية Illumina ومكتبة زوج Illumina mate باستخدام Newbler v3.0 (روش، 454) برنامج المجمّع (وجد في ) ومشروح باستخدام خط أنابيب يستند إلى FgeneSB (وجد في http://lt;http://www.softber....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تجسد البروتوكول بنجاح باستخدام مزيج من تعدين الجينوم، والتعبير غير المتجانس، ونهج التعليمات الموجهة بالتصلب المتعدد/الشفرة للوصول إلى جزيئات نظائرها المتخصصة الجديدة. يتم تمثيل سير عمل الجينوم إلى الجزيء للهدف ، فالينوميسين (VLM) ، في الشكل 8. تم تحليل Streptomyces sp. CBMAI 2042 مشروع الجينوم في silico، ثم تم تحديد الكتلة الجينية VLM ونقلها إلى مضيف غير ياللوغوس. وزرعت سلالات من النوع الهيتيروغلوج والبري في ثلاثة توائم باستخدام ظروف التخمير المناسبة، مقسمة مع خلات الإيثيل، وترك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الميزة الأقوى لهذا البروتوكول هي قدرته على إزالة الملامح الأيضية بسرعة وجسر المعلومات الجينومية مع بيانات التصلب المتعدد من أجل توضيح هياكل الجزيئات الجديدة ، وخاصة نظائرها الهيكلية2. واستناداً إلى المعلومات الجينية، يمكن تحري الأنماط الكيميائية للمنتجات الطبيعية المختلفة، مثل البوليكيتتيدات (PK)، والببتيدات غير الخاضعة للرب (NRP)، والمنتجات الطبيعية الجليكوزية (GNP)، وكذلك BGCs. وهكذا، يمكن استنساخ BGC لتوجيه إنتاج مركب جديد أو نظائرها غير معروفة تتعلق BGC معروفة بالفعل، التي تيسرها أوجه التشابه .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
تم تقديم الدعم المالي لهذه الدراسة من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث - FAPESP (2019/10564-5، 2014/12727-5 و2014/50249-8 إلى L.G.O؛ 2013/12598-8 و 2015/01013-4 إلى R.S.؛ و 2019/08853-9 إلى C.F.F.A). حصلت شركة B.S.P وC.F.F.A. و L.G.O. على زمالات من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية - CNPq (205729/2018-5 و 162191/2015-4 و 313492/2017-4). كما أن L.G.O. ممتنة للدعم المقدم من المنح ة من قبل برنامج المرأة في العلوم (2008، الطبعة البرازيلية). جميع المؤلفين يعترفون بـ CAPES (التنسيق لتحسين موظفي التعليم العالي) لدعمبرامج ما بعد التخرج في البرازيل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أسيتونيتريل | تيديا | AA1120-048 | HPLC الصف |
| أجار | أكسويد | LP0011 | NA |
| أبراميسين | سيجما ألدريتش | A2024 | NA |
| Carbenicillin | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| أجهزة الطرد المركزي | Eppendorf | NA | 5804 |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| العمود C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18 ، 80 & Aring ؛ 2.1 × 50 مم ، 1.8 & micro ؛ م ، 1200 بار حد الضغط P / N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrifuge | Eppendorf | NA | 5418 |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF مطياف الكتلة | تقنيات Agilent | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC / MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | موالفة | NA | NA |
| شاكر / حاضنة | Marconi | MA420 | NA |
| كلوريد الصوديوم | موالفة | NA | P. A. - |
| ACS مستخلص الصويا | NA | NA | NA |
| السكروز | سينث | NA | P. A. - ACS |
| الدورات الحرارية | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma ألدريتش | T8902 | NA |
| تريبتون | أكسويد | LP0042 | NA |
| تريبتون مرق الصويا | أكسويد | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| مستخلص الخميرة | Oxoid | LP0021 | NA |
المراجع
- Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
- Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
