مقالة منهجية

تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60834

⸱

مارس 29, 2020

 ,  ,  , 
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

نحن نصف طريقة لتحديد الفخاخ خارج الخلية العدلات (NETs) في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من القلب القلب والقلب thrombi باستخدام استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة وبروتوكول تسمية المناعة المزدوجة.

الملخص

الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، تتألف من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) والبروتينات مثل الهستونات واللاستاز العدلات (NE)، يتم تحريرها من قبل العدلات استجابة لالتهاب الجهازية أو مسببات الأمراض. على الرغم من أن NETs قد ثبت سابقا لزيادة تكوين الجلطة وتثبيط الانف في البشر والكلاب، ودور NETs في القطط مع تجلط الشرايين القلب (CATE)، وهي مضاعفات تهدد الحياة الثانوية لاعتلال عضلة القلب فرط التروب ، غير معروف. طريقة موحدة لتحديد وقياس NETs في تجلط الشرايين القلب في القطط سوف تعزز فهمنا لدورها المرضي في CATE. هنا ، نصف تقنية لتحديد NETs في الفورمالديهايد ثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من thrombi داخل بيثرة الأبهري ، المستخرجة أثناء النخر. بعد إزالة البارافينمع الزيلين، خضعت الأقسام الأبهرية لاسترجاع مستضد غير مباشر بسبب الحرارة. ثم تم حظر الأقسام ، permeabilized ، وex vivo NETs تم تحديدها عن طريق توطين الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) ، citrullinated histone H3 (citH3) ، وelastase العدلات (NE) باستخدام المجهر المناعي. لتحسين الكشف المناعي للNETs في thrombi ، تم الحد من الفلور اتمنامن عناصر الأنسجة باستخدام عملية إخماد الفلور الذاتي قبل المجهر. يمكن أن تكون هذه التقنية أداة مفيدة لدراسة NETs وتجلط الدم في الأنواع الأخرى وتقدم رؤى جديدة في الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالة المعقدة.

المقدمة

القطط مع اعتلال عضلة القلب الضخامي هي في خطر من مضاعفات تجلط الدم المهددة للحياة1,2. على الرغم من ارتفاع معدلات الاعتلال والوفيات المرتبطة بتجلط الشرايين القلبوية (CATE) ، فإن الفيزيولوجيا المرضية الكامنة في CATE في القطط غير مفهومة بشكل جيد. وهناك أيضا محدودة أدوات التشخيص والعلاج لعلاج وتحديد القطط المعرضة لخطر هذه الحالة المدمرة3.

بالإضافة إلى دورها في الحصانة الفطرية، وقد ثبت العدلات للعب دور في تجلط الدم من خلال الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية العدلة (NETs)، والتي هي شبكات تشبه على شبكة الإنترنت من الحمض النووي خالية من الخلايا (cfDNA) مرصعة الهستون والبروتينات الحبيبية مثل العدلات الإيلاداس (NE) وmyeloperoxidase. العدلات الخضوع لتكوين NETs استجابة لالتهاب الجهازية، ومواجهة مباشرة مع مسببات الأمراض، والتفاعل معالصفائحالدموية المنشط4،,5،,6،,7. في الكلاب ، وقد ثبت الحمض النووي المستمدة من العدلات لمنع تجلط الجلطات ، في حين أن البروتينات NET تسريع تشكيل الجلطة. قدرة NETs على اعتراض الخلايا المتداولة ومكونات التخثر هو أيضا مفتاح لخصائصها تخثر8،9،10،11،12.

يتم الكشف عن NETs عن طريق توطين البروتينات العدلات خارج الخلية، الهستونات، وcfDNA. وبسبب هذا، فإن تحديد وقياس NETs في الأنسجة الثابتة عن طريق immunofluescence من الأنسجة deparaffinized متفوقة على الهيماتوكسيلين التقليدية والإيوسين (H & E) وصمة عار باستخدام المجهر حقل مشرق4،5. حددت العديد من الدراسات البشرية باستخدام المجهر المناعي NETsك المكونات الهيكلية للتجلط الشرياني التاجي، السكتة الدماغية الدماغية، التروثرومبوسيس، وتجلط الرثرة الوريدية13،14،15،16،17. وحتى الآن، لم يتم وصف طريقة موحدة للكشف عن الـ NETs وقياسها كمياً في ثثرم القطط. لأن تحديد NETs في تجلط الشرايين القلب والقلب القطط قد يسهل البحوث الانتقالية في المستقبل في NETs والتجلط، ونحن وصف تقنيات تحديد صافي وتقييم في تجلط الشرايين جزءا لا يتجزأ من البارافين في القطط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كاليفورنيا، ديفيس. وأجريت النُقاز وخزعات الأنسجة بموافقة المالكين.

1. تثبيت الأنسجة، والتضمين، وأقسام

  1. تشريح التشعب الأبهري ، بما في ذلك الشريان الأورطي التنازلي ، الشريان الفخذي ، والشرايين الحرقفية الشائعة(الشكل 1A)، بعد وقت قصير من القتل الرحيم أو الموت الإنساني. بصراحة تشريح اللفافة(الشكل 1B)قبل غمره تماما في 10٪ محايدة عازلة الرسمية لمدة لا تقل عن 24 ساعة وليس أكثر من 48 ساعة.
  2. لتجفيف العينة، الغمر أولاً في 10% محايد ة المخزنة احتياطيا formalin ساخنة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم، غمر في تركيزات متزايدة من الإيثانول ساخنة إلى 37 درجة مئوية (70٪، 95٪، 100٪) 2x ل1 ساعة لكل منهما. وأخيرا، دون الرص، غمر 2x في 100٪ تولوين ساخنة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لكل منهما.
  3. إضافة البارافين ساخنة إلى 62 درجة مئوية والسماح للبارافين لترسيخ تماما بين عشية وضحاها.
  4. القسم 2-3 ميكرومتر من الأنسجة المضمنة بالبارافين باستخدام ميكروتوم ووضعها على شرائح زجاجية مشحونة بشكل إيجابي. تخزين الأنسجة المقطعة في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

2. Deparaffinization، الإماهة، واسترجاع المستضد الناجم عن الحرارة

  1. لإجراء إزالة البارافينة والإماهة من المقاطع على الشرائح الزجاجية، ضع الشرائح الزجاجية في الرفوف وعملية بالترتيب التالي:
    1. غمر تماما في 100٪ xylene لمدة 3 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2x. لا تشطف بين الخطوات.
    2. الغمر بالكامل في تركيزات تناقص الإيثانول (100٪، 95٪، 70٪) في درجة حرارة الغرفة (RT)، 3x لمدة 3 دقيقة لكل منهما. لا تشطف بين الخطوات.
    3. غمر تماما في المياه اللامؤنة لمدة 2 دقيقة. كرر.
  2. ضع المقاطع في خط اللاين المخزن مؤقتًا مع 0.1٪ Tween (TBST، pH = 7.6) لمدة 2-3 دقيقة.
  3. ملء الخزان مع المياه المنزوعة الأيونات ساخنة إلى 100 درجة مئوية. السماح لغرفة الباخرة للتوازن لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يتم تنفيذ استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة بشكل أفضل مع التدفئة غير المباشرة التي يتم إنشاؤها بواسطة باخرة مع إعداد درجة حرارة محددة مسبقًا، مثل باخرة الطعام.
  4. سخني محلول استرجاع المستضد المتاح تجاريًا الذي يحتوي على Tris و EDTA (درجة الحموضة = 9) إلى 95-97 درجة مئوية على لوحة ساخنة يتم التحكم فيها درجة الحرارة مع التحريك المستمر. تأكد من أنه لا يغلي.
    ملاحظة: يجب أن يتحول الحل غائمًا بمجرد تسخينه.
  5. صب محلول استرجاع المستضد ساخنة في حاوية الشريحة ووضع الحاوية في غرفة الباخرة. السماح لمحلول استرجاع المستضد بالاعتدال في درجة حرارة الباخرة لمدة 3-4 دقيقة. تأكد من أن درجة حرارة الغرفة هي ~ 95 درجة مئوية.
  6. غمر الشرائح تماما في حل استرجاع مستضد ساخنة ومواصلة تطبيق التدفئة الخارجية عبر باخرة لمدة 20 دقيقة.
  7. قم بإزالة حاوية الشريحة من الباخرة واسمح للشرائح وحل استرداد المستضد بالتبريد إلى RT. احفظ محلول استرداد المستضد المخفف عند درجة حرارة 4 درجة مئوية وإعادة الاستخدام حتى 2x إذا لزم الأمر.
  8. اغسل الشرائح 3x مع TBST لمدة 5 دقيقة.

3. المناعة وإخماد الفلورات

ملاحظة: الجدول 1 تفاصيل تكوين المخازن المؤقتة حظر المستخدمة في الخطوات التالية.

  1. أقسام الاحتضان في حظر المخزن المؤقت 1 لمدة 2 ساعة في RT تحت هزاز لطيف (30-50 دورة في الدقيقة). ختم مع فيلم البارافين لتجنب التجفيف.
  2. دون غسل، وتطبيق على الفور 100 ميكرولتر من الأرانب المخففة المضادة للجلد الإنسان يسيلون H3 (citH3) الأجسام المضادة (0.03 ملغ / مل المخفف في منع العازلة 1) مباشرة على الشريحة.
  3. ضع قسيمة غطاء (24 مم × 40 مم × 0.13-0.17 مم) على كل قسم للسماح بالتوزيع المتساوى لخليط الأجسام المضادة.
  4. احتضان لمدة 12-16 ساعة في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف (30-50 دورة في الدقيقة). ختم مع فيلم parafilm لتجنب التجفيف.
  5. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقيقة.
  6. تطبيق 100 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب الأجسام المضادة الاقتران إلى اليكسا فلور 488 (المخفف إلى تركيز النهائي من 0.04 ملغ / مل أو 1:50 في حظر المخزن المؤقت 1) كما هو موضح في الخطوة 3.3. احتضان لمدة 1 ساعة في RT تحت هزاز لطيف (30-50 دورة في الدقيقة). حماية الشرائح من الضوء.
  7. يغسل مع TBST 3x لمدة 5 دقيقة.
  8. أقسام الاحتضان في حظر المخزن المؤقت 2 بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية تحت هزاز لطيف (30-50 دورة في الدقيقة). حماية من الضوء.
  9. يغسل مع TBST 3x لمدة 5 دقيقة.
  10. كتلة المقاطع في حظر المخزن المؤقت 3 كما هو موضح في الخطوة 3.3 في RT لمدة 2 ساعة تحت هزاز لطيف (30-50 دورة في الدقيقة).
  11. أقسام الاحتضان مع الأرانب متعددة النسيلة الحيوية المضادة للإنسان NE الأجسام المضادة (التركيز النهائي = 0.2 ميكروغرام / مل في حظر المخزن المؤقت 3) في 4 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.4.
  12. يغسل مع TBST 3x لمدة 5 دقيقة.
  13. احتضان مع اليكسا فلور 594 streptavidin الاقتران (تمييع إلى 1:100 أو 0.02 ملغ / مل في حظر المخزن المؤقت 3) كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.3 لمدة 1 ساعة في RT. حماية من الضوء وختم مع البارافين لمنع التجفيف.
  14. يغسل مع TBST 1x لمدة 5 دقيقة.
  15. تطبيق 100 ميكرولتر من خليط محلول إخماد الفلور الفلور اتوئاك مباشرة على الأقسام لمدة 1 دقيقة وفقا لتعليمات من قبل الشركة المصنعة.
  16. غسل الشرائح على الفور مع TBST 6x لمدة 10 دقيقة.
  17. تغطية كل شريحة مع 100 ميكرولتر من 300 nM DAPI لمدة 5 دقيقة في الظلام.
  18. يغسل مع TBST لمدة 3 دقيقة. كرر هذا لما مجموعه 5x.
  19. تطبيق قطرة (~ 50 ميكرولتر) من antifade تصاعد المتوسطة، وهي جزء من طقم إخماد autofluorescence، مباشرة على الشريحة الزجاجية المحيطة القسم. ضع قسيمة تغطية (24 مم × 40 مم × 0.13-0.17 مم) برفق على القسم دون إنشاء أي فقاعات.
  20. السماح للعينات لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في 4 درجة مئوية حتى تصلب المتوسطة المتصاعدة للتحليل المجهري مع عدسات الغمر.

4. نيوتروفيل خارج الخلية فخ تحديد

ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي مجهر ًا مقلوبًا للكشف عن الفلوروسينية مع كاميرا CCD رقمية 1,280 × 960 (انظر جدول المواد).

  1. لتحديد موقع thrombi، مسح بشكل مؤقت لcaudally على طول الشريان الأورطي، التشعب الأبهري، وكل شريان الفخذ باستخدام المجهر على النقيض المرحلة مع هدف 10x. الجلطة هي تكتل الأنسجة التي تحتوي على خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية المجاورة للبطانة على تباين المرحلة والمجهر الميداني الساطع(الشكل 2A، الشكل 2B).
  2. أولا فحص أقسام لNETs باستخدام قناة DAPI (الإثارة = 357/44 نانومتر) مع 10x و 20x الأهداف(الشكل 2C). لاحظ أن cfDNA يظهر كالحمض النووي المجرد الذي ليس ضمن حدود السيتوبلازم من خلية عندما ينظر إليها على النقيض من المرحلة أو المجهر الميداني مشرق.
  3. تحديد NE خارج الخلية وcitH3 على قنوات تكساس الحمراء (الإثارة = 585/29 نانومتر، والانبعاثات = 628/32 نانومتر) وقناة البروتين الفلوري الأخضر (الإثارة = 470/22 نانومتر، الانبعاثات = 525/50 نانومتر)، على التوالي مع أهداف 10 و 20 و 40x.
  4. تقييم وتحليل NETs داخل thrombus باستخدام البرامج المتاحة، مثل صورة J (المعاهد القومية للصحة). يتم تحديد تشكيل NET استنادًا إلى التوطين المشترك لـ cfDNA و citH3 خارج الخلية وNE كما سبق وصفه18. الحفاظ على وقت التعرض متسقة والمكاسب من كل قناة في جميع أنحاء اقتناء الصور لتجنب التشبع في كثافة بكسل.
  5. قم بتعيين كل خثارة استنادًا إلى قربها من الأبهر التنازلي عن طريق تقسيمها إلى ثلاث مناطق متساوية ، مع المنطقة 1 الأقرب إلى الأبهر ، والمنطقة 3 الأبعد من الأبهر ، والمنطقة 2 بين المنطقتين 1 و 3). مع المشغل أعمى عن الحالة الطبية لكل موضوع، واتخاذ ما لا يقل عن عشرة حقول عشوائية في كل منطقة. توصيف توزيع المؤشرات الجديدة في thrombi عن طريق متوسط أعداد الحقول مع NETs في كل منطقة أو حساب متوسط صافي منطقة احتلال لكل منطقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول لdeparaffinization، استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة، وتسمية المناعة المزدوجة من thrombi البارافين المضمنة، حددنا NETs في FELINE CATE للمرة الأولى. تم تحديد موقع Thrombi داخل التشعب الأبهري عن طريق المجهر الفلوري والمجهر الميداني الساطع باستخدام تلطيخ H & E القياسي والمجهر التباين في المرحلة. على المجهر حقل مشرق، وتجلط الشرايين القطط تتكون من خلايا الدم الحمراء، الكريات البيض، الفيبرين، والصفائح الدموية(الشكل 3A). على الرغم من أن H & E لا يمكن وصمة عار مكونات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن نصف بروتوكول لتحديد NETs في خثرة الشرايين القلب ية الثابتة القطط باستخدام بروتوكول تسمية المناعة المزدوجة والمجهر الفلورات المناعية. على الرغم من أن فقط تجلط الشرايين القلبية كانت ملطخة، من الناحية النظرية يمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من thrombi وفي الأنواع البيطرية الأخرى. يشير تحديد NETs داخل الجلقط الشرياني القططي إلى أن NETs قد تلعب دورًا في تجلط الدم في القطط.

الكشف عن NETs عن طريق الفلور المناعة في الأنسجة الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ متفوقة على البقع النسيجية التقليدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسة بأموال من جامعة كاليفورنيا، ديفيس، مركز الصحة الحيوانية المرافقة (CCAH 2018-30-F). يود المؤلفون أن ينوهوا بالدكتور كيفن وولارد لاستخدام المجهر الفلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4،6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin ConrupgateThermoFisherScientific Catalog # S11227
الأجسام المضادة للهيستون H3للسيترولين AbcamAb5103
EVOS FL نظام تصوير الخليةThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging هدف النظام 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25 ، WD 6.9 / 7.45 مم
هدف نظام التصوير EVOS 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40 ، WD 6.8 مم
هدف نظام التصوير EVOS 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75 ، WD 0.72 مم
الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 الجسم المضادThermoFisher العلمي# A32723
مصل الماعزمختبرات أبحاث مناعة جاكسون# NC9660079. الجزء الصانع # 005-000-121
الأجسام المضادة للإيلاستاز العدلاتBioss الأجسام المضادةBs-6982R-BiotinRabbit الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، البيوتين المترافق
NP40بيرسالمنتج # 28324. الكثير # EJ64292
شرائح المجهر الإيجابي المشحونة توماسالعلميةرقم 1354W-72
مصل الأرانبكتالوج تكنولوجياالحياة # 10510
حل استرجاع الهدفAgilent DakoS2367TRIS / EDTA ، درجة الحموضة 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400
المضادة كتالوج

المراجع

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721(2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322(2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083(2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928(2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210(2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H3

مقالات ذات صلة