نموذجان مختلفان لتفضيل المكان في الوقت الحقيقي باستخدام علم الوراثة البصرية داخل منطقة فينترال تيمنتال من الماوس

Summary

هنا نقدم اثنين من سهلة لمتابعة خطوة بخطوة بروتوكولات لنماذج تفضيل مكان باستخدام optogenetics في الفئران. باستخدام هذه الاجهزة المختلفة ، والأفضلية وتجنب السلوكيات يمكن تقييمها بقوة داخل نفس الجهاز مع الانتقائية المكانية والزمنية العالية ، وبطريقة مباشرة.

Abstract

فهم كيف يؤدي تنشيط الخلايا العصبية إلى إخراج سلوكي محدد أمر أساسي لعلم الأعصاب الحديث. الجمع بين علم البصريات في القوارض مع الاختبار السلوكي في نماذج التحقق من صحتها يسمح لقياس العواقب السلوكية على تحفيز الخلايا العصبية متميزة في الوقت الحقيقي مع الانتقائية المكانية والزمنية العالية، وبالتالي إنشاء العلاقات السببية بين تنشيط الخلايا العصبية والسلوك. هنا ، نصف بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج تفضيل المكان في الوقت الحقيقي (RT-PP) ، وهو نسخة معدلة من اختبار تفضيل المكان المكيف الكلاسيكي (CPP). يتم تنفيذ RT-PP في جهاز من ثلاث مقصورات ويمكن استخدامها للإجابة إذا كان التحفيز الأوفيوراثي لتجمعات عصبية معينة مجزٍ أو مجزٍ. كما نصف أيضًا نسخة بديلة من بروتوكول RT-PP، وهو ما يسمى بروتوكول تفضيل المقصورة المحايدة (NCP) ، والذي يمكن استخدامه لتأكيد النفور. ويستند النهجان على امتدادات المنهجية الكلاسيكية الناشئة من علم الصيدلة السلوكية والتنفيذ الأخير لعلم البصريات في مجال علم الأعصاب. وبصرف النظر عن قياس تفضيل المكان في الوقت الحقيقي، يمكن لهذه الاجهزة أيضا إعطاء معلومات بشأن السلوك مكيفة. نحن نقدم بروتوكولات خطوة بخطوة سهلة المتابعة إلى جانب أمثلة من بياناتنا الخاصة ونناقش الجوانب الهامة التي يجب مراعاتها عند تطبيق هذه الأنواع من التجارب.

Introduction

أدى تنفيذ optogenetics ، وهي أداة تجريبية علم الأعصاب الحديثة التي يتم فيها استخدام الضوء للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية ، في السنوات الأخيرة إلى تقدم كبير في فهم كيفية تأثير مجموعات معينة من الخلايا العصبية على السلوك^1،2،3. الانتقائية المكانية والزمنية المعلقة من علم الوراثة البصرية يسمح بإقامة علاقات سببية بين الإثارة أو تثبيط مجموعات الخلايا ذات الاهتمام والإخراج السلوكي^2،3. يتم ضمان الانتقائية المكانية في علم البصريات عادة من خلال نظام Cre-Lox الذي يؤدي فيه نشاط Rere recombinase إلى إعادة تركيب أي تسلسلات الحمض النووي الموجودة بين مواقع Lox ، ما يسمى أليل المتخبط (محاط بمواقع لوكس)⁴. الهدف من استخدام نظام كري لوكس في optogenetics هو تحقيق التعبير عن الأليسل ترميز optogeneticoptoins في الخلايا العصبية محددة من الفائدة في حين ترك الخلايا العصبية المحيطة خالية من التعبير. Opsins هي بروتينات حساسة للضوء التي على ضوء التحفيز من موجة محددة طول السماح تدفق أيون التي تؤثر على الإثارة العصبية أو تأثير الوظائف الخلوية عن طريق تحوير مسارات المؤثرات المصب. المتغيرات الجديدة من opsins التي تختلف في العمل (مثير، مثبطة، مغيرة)، آلية، تفعيل الطول الموجي الضوء وخصائص الحركية⁵ يجري تطويرها باستمرار لتلبية احتياجات النهج التجريبية المحددة. فيما يتعلق بالإثارة ، فإن استخدام أوبسين إزالة الاستقطاب أو الاستقطاب المفرط يملي نشاط الخلايا العصبية (الإثارة أو التثبيط ، على التوالي) على تحفيز الضوء عند طول موجي محدد يتم توصيله إلى الدماغ³.

النشاط المروج انتقائية توجه التعبير عن Recombinase الكري إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. من خلال تنفيذ أليل تتخبط من opsin من الفائدة, سوف Cre بوساطة إعادة تركيب ضمان أن يتم التعبير عن Opsin بشكل انتقائي في الخلايا العصبية التي تشارك في التعبير عن إعادة الدمج الكري^3,6. وقد ثبت هذا الاستخدام من المعدلة وراثيا مزدوجة لتوجيه الانتقائية المكانية فعالة جدا في علم البصريات. وهكذا، في حين يتم تسليم الضوء لتحفيز لتنشيط opsins على نطاق واسع من خلال الألياف البصرية المزروعة داخل المخ متصلة مصدر الضوء (LED أو الليزر)^3،والخلايا العصبية فقط التعبير عن كل من الكري recombinase وأليل opsin floxed سوف تستجيب لهذا التحفيز. يمكن تحقيق نظام Cre-Lox في القوارض بطرق مختلفة باستخدام المعدلة وراثيا فقط (يتم ترميز كل من Rere recombinase وبناء opsin floxed في الحيوانات المعدلة وراثيا) ، والحقن الفيروسية فقط (يبني الحمض النووي لRecombinase وopsin floxed على حد سواء يتم تسليمها عن طريق الناقل الفيروسي) ، أو مزيج من الاثنين (على سبيل المثال ، يتم ترميز Rere recombinase بواسطة الحيوان المعدل ة وراثيا التي يتم حقنها مع فيروس يحمل بناء opsin floxed)⁵. عادة ما يتم استنساخ بناء الحمض النووي opsin floxed في الإطار مع جين مراسل لتمكين تصور إعادة التركيب بوساطة الكري في أقسام الأنسجة. في حين يمكن أيضا إجراء علم البصريات في الفئران، وقد تم إنشاء البروتوكولات المقدمة للفئران. للبساطة ، سيتم الإشارة إلى الفئران التي تحمل كل من Rere recombinase وopsin floxed باسم "الفئران علم الوراثة البصرية". في البروتوكولات الموضحة أدناه ، تم إنشاء فئران علم البصريات من قبل معدل وراثيا مختلطة (Rere recombinase تحت سيطرة اثنين من المروجين مختلفة) والفيروسية (باستخدام فيروس المرتبطة بالأدينو ، AAV ، لتقديم بناء الحمض النووي opsin floxed -- في حالتنا ChR2/H134R) النهج. إن الحصول على خطوط الماوس المعدلة وراثياً والحفاظ عليها هو جزء أساسي من المنهجية. يمكن إنتاج الفئران المعدلة وراثيا Cre-driver وfloxed opsin لكل غرض، أو شراؤها إذا كانت متاحة تجاريا، كما يمكن لمجموعة من الفيروسات التي تحمل تسلسل الحمض النووي ترميز الـ Rere recombinase وopsins floxed في أشكال مختلفة.

وقد ثبت Optogenetics إلى جانب الاختبار السلوكي ليكون أداة قيمة لدراسة دور مناطق الدماغ متميزة، أو مجموعات الخلايا العصبية منفصلة، في أنواع معينة من السلوك. في سياق السلوك المرتبط بالمكافأة ، مكّن علم البصريات من التحقق من النتائج السابقة في مجالات علم الأدوية السلوكي وعلم النفس التجريبي ، وسمح أيضًا بمستوى جديد من التشريح المرتبط بالتسلسل الزمني في كيفية تأثير بعض الخلايا العصبية على السلوك. إحدى الطرق التي تم استخدامها في العديد من الدراسات لتقييم السلوك المرتبط بالمكافأة هي نسخة معدلة من الطريقة الكلاسيكية المعروفة باسم تفضيل المكان المكيف (CPP). وقد استخدمت الكلاسيكية CPP لتقييم الخصائص المجزية أو aversive من المخدرات من تعاطي من خلال قدرتها على حث الجمعيات بافلوفيان مع العظة من البيئة^7،8. في بافلوفيان ، يكون الدواء حافزًا غير مشروط لأنه يمكن أن يثير الاقتراب أو الانسحاب إذا كان مجزياً أو مُفاقًا ، على التوالي. الاقتران المستمر للدواء مع مختلف المحفزات المحايدة ، التي هي نفسها لا تثير أي استجابة ، يمكن أن يؤدي إلى الاقتراب أو الانسحاب بمجرد عرض المحايد سابقًا ، ولكن بعد الاقتران ، ما يسمى المحفزات المكيفة ⁹. عادة ما يتم إجراء تحليل CPP في جهاز يحتوي على جزأين من نفس الحجم ولكن حيث يتم تعريف كل مقصورة من خلال خصائص متميزة ، مثل نسيج الأرض وأنماط الجدار والإضاءة (المحفزات المحايدة). يتم توصيل المقصورات اثنين إما عن طريق ممر أو فتحة بين المقصورات. أثناء التكييف ، يتلقى هذا الموضوع ، عادة ما يكون قارضًا صغيرًا ، حقنًا سلبية من الدواء بينما يقتصر على إحدى الحجرتين الرئيسيتين والمالحة بينما يقتصر على المقصورة الأخرى. يتم تقييم الآثار المجزية للدواء في وقت لاحق في جلسة خالية من المخدرات عندما يسمح للموضوع لاستكشاف الجهاز بأكمله بحرية. ويعتبر مقدار الوقت الذي يقضيه في المقصورة سابقا المخدرات يقترن (استجابة مشروطة) لتعكس آليات التعلم بافلوفيان بوساطة بين الآثار المجزية للدواء والعظة من المقصورة المرتبطة إدارتها (المحفزاتمشروطة). إذا كان الحيوان يقضي المزيد من الوقت في المقصورة المقترنة بالمخدرات ، فقد تسبب الدواء في تفضيل مكان مشروط مما يعني أن له آثارًا مجزية على السلوك. من ناحية أخرى ، إذا كان يُنظر إلى الدواء على أنه أفيرسي ، فإن الحيوان سيتجنب المقصورة المقترنة بالمخدرات ويقضي المزيد من الوقت في المقصورة المقترنة بالمالحة ، مما يشير إلى نفور المكان المكيف (CPA)^8،9،10،11.

منذ optogenetics يمكن تنفيذها للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية في "الوقت الحقيقي" ، واستخدام نموذج سلوكي مماثل ، ولكن متميزة عن ، والإعداد CPP يسمح لقياس تفضيل المكان على التنشيط العصبي المباشر. ولذلك غالباً ما يشار إلى التحليل المستند إلى علم الوراثة البصرية لتفضيل المكان على أنه نموذج تحليل يُفضل في الوقت الحقيقي (RT-PP). في نموذج RT-PP ، يحل التحفيز البوجيني للخلايا العصبية المتميزة عبر نظام Cre-Lox محل التسليم النظامي لدواء يتم إجراؤه في CPP الكلاسيكي ، بحيث يقيس نموذج RT-PP بدلاً من ذلك إذا كان التحفيز العصبي المستحث بعلم الوراثة هو ينظر إليها على أنها مجزية أو أفيرسية. سيركز الوصف الحالي على فئران علم الوراثة البصرية ، ولكن أيضًا يمكن اختبار الفئران البصريات باستخدام بروتوكولات مماثلة.

بدلاً من التكييف إلى حجرة واحدة في وقت واحد كما هو الحال في نموذج CPP الكلاسيكي ، يُسمح للفأر ة علم الوراثة البصرية في نموذج RT-PP بالتحرك بحرية في الجهاز بأكمله ويتم تسجيل السلوك طوال الجلسة. يتم إقران الدخول إلى إحدى المقصورات مع التحفيز الضوئي داخل الجمجمة. تحت معلمات تحفيز الضوء المناسبة، سيتم تنشيط الخلايا العصبية التي تعبر عن opsin مثير بذلك. إذا كان ينظر إلى تحفيز الضوء على أنه مجزٍ ، فسيبقى الماوس optogenetics في المقصورة المقترنة بالضوء ، بينما إذا كان ينظر إلى تحفيز الضوء على أنه أفيرسيفي ، فإن الماوس سوف يخرج من المقصورة للهروب من التحفيز. يسمح هذا النوع من التحليل بتقييم التعلم الطارئ: يمكن أن يؤدي هذا الموضوع إلى تحفيز الضوء وبالتالي تنشيط الخلايا العصبية عن طريق إدخال حجرة ، ووقف التحفيز عن طريق الخروج من المقصورة ، على غرار الضغط على الرافعة أثناء مهمة مفيدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم آليات التعلم النقابي خلال الدورات اللاحقة حيث يقاس الوقت الذي يقضيه في كل مقصورة في غياب التحفيز. بهذه الطريقة ، يمكن للباحث أن ينفصل بين الآثار المجزية على الفور على تحفيز الخلايا العصبية ذات الأهمية وتكوين الذاكرة النقابية المتعلقة به^12.

في الدراسة الحالية ، ونحن نصف اثنين خطوة بخطوة بروتوكولات الإعداد لoptogenetics يحركها سلوك تفضيل مكان الفئران تتحرك بحرية. يصف البروتوكول الأول RT-PP ضمن جهاز من ثلاث حجرات وتم تحديده استنادًا إلى البروتوكولاتالتي قدمها الجذر وزملاؤه¹³ والمؤلفون الآخرون^{12و14و15و16}و17^و18. تتكون التجربة من مرحلتين تتألفان من عدة جلسات يومية (كما هو موضح في الشكل 1A). تم تصميم كل جلسة لأغراض مختلفة ويتم تغيير معلمات التحفيز بالاقتران مع مقصورة وفقا لذلك. يتم استخدام الجلسة الأولى ،"Pretest" ، لتقييم الأفضلية الأولية للموضوع لأي من المقصورات. أثناء الاتصال بسلك التصحيح ، يُسمح لهذا الموضوع باستكشاف الجهاز بحرية في غياب التحفيز لمدة 15 دقيقة. إذا كان تفضيل الأولي ة إلى أي مقصورة واحدة هو أكثر من 80٪، يتم استبعاد الماوس من التحليل منذ التحيز الجانب الأولي قد يؤدي إلى انحراف التحليل. بعد"Pretest"،"المرحلة 1"يبدأ. الجزء الأول يتكون من جلستين متتاليتين، يوميا، 30 دقيقة من "RT-PP". خلال "المرحلة 1"، يتم توصيل الماوس optogenetics إلى مصدر الليزر من خلال سلك التصحيح ووضعها في الساحة لاستكشاف بحرية. يتلقى الفأر تحفيز الليزر داخل الجمجمة عند الدخول إلى واحدة من المقصورات الرئيسية. ويمكن إجراء تجارب تجريبية لتحديد المقصورة التي سيتم تعيينها كمقصورة بالليزر وأيها غير مقترنة. إذا ثبت أن التحفيز مجزٍ ، سيتم اقتران الليزر بالمقصورة الأقل تفضيلًا خلال"Pretest"وإلى الأكثر تفضيلًا إذا كان التحفيز أفيرسي. وهكذا ، فإن البروتوكول RT -PP المقدم يتبع تصميمًا متحيزًا بمعنى أن تحفيز الليزر لا يتم تعيينه عشوائيًا إلى أي من المقصورات الرئيسية (تصميم غير متحيز) ، ولكن يتم اختياره لتجنب أي تفضيل أولي للفأرة. الدخول إلى المقصورة الرئيسية الأخرى أو المقصورة المحايدة التي تربط المقصورات الرئيسية اثنين لا يؤدي إلى تحفيز الضوء داخل الجمجمة وبالتالي ليست خفيفة مقترنة. تسمح هذه الجلسات بإجراء تقييم في الوقت الحقيقي للخصائص المجزية أو الوافر لتحفيز مجموعات عصبية محددة. في اليوم الأخير من "المرحلة 1"، جلسة 15 دقيقة دون أي تحفيز يحدث. تعمل هذه الجلسة على معالجة الاستجابات المكيفة ("CR") التي تنتج عن التعلم النقابي بين التحفيز والبيئة التي تم تلقيها فيها. بعد ثلاثة أيام على الأقل من "المرحلة 1"،"مرحلة الانعكاس"يحدث الذي يتبع نفس الهيكل مثل "المرحلة 1" ولكن يتم الآن إقران المقصورة الرئيسية غير المقترنة سابقا مع التحفيز الضوئي. كما هو الحال في"المرحلة 1"، ويتبع جلستي التحفيز جلسة"CR". يتم استخدام"مرحلة الانعكاس"لتأكيد أن سلوك الماوس يعتمد على التحفيز الأوبتوبجيني ولا يرتبط بالمعلمات العشوائية. يجب برمجة كل جلسة من جلسات تجربة RT-PP بشكل منفصل داخل برنامج التتبع. يصف البروتوكول الحالي مثل هذه الإعدادات داخل برنامج معين، ولكن يمكن استخدام أي برنامج تتبع آخر قادر على إرسال إشارات التشكيل الترانزستور-ترانزستور-منطق (TTL) إلى مصدر الضوء.

يصف البروتوكول الثاني إعداد ًا جديدًا يطلق عليه نموذج تفضيل المقصورة المحايدة (NCP). يستفيد هذا البروتوكول المعدل من RT-PP من صغر حجم وشفافية ممر الربط الذي يتم تجنبه بشكل طبيعي بواسطة الماوس بسبب تكوينه الضيق والشفاف. من خلال إقران كل من المقصورات الرئيسية مع تحفيز الضوء وترك الممر فقط خالية من تحفيز الضوء ، يمكن استخدام إعداد NCP لاختبار ما إذا كان التحفيز البوجيني سيجبر الماوس على قضاء المزيد من الوقت في الممر لتجنب تلقي التحفيز الأوجيني. من خلال مقارنة الوقت المستغرق في المقصورات المقترنة بالضوء مع الوقت الذي يقضيه في الممر ، يمكن التحقق من النفور الناجم عن البوجينيات. تتكون تجربة NCP من جلستين متتاليتين يوميتين حيث تتلقى فئران علم الوراثة البصرية التحفيز (30 دقيقة لكل منها) لقياس الأفضلية في الوقت الفعلي ، وجلسة واحدة خالية من الليزر (15 دقيقة) لتقييم الاستجابات المشروطة بشكل مماثل لتلك الموجودة في RT-PP البروتوكول.

تم التحقق من بروتوكولات RT-PP و NCP الواردة أدناه مؤخرًا في مختبرنا في دراسة كيفية مشاركة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية الموجودة في منطقة tegmental البطنية (VTA) في جوانب مختلفة من السلوك المرتبط بالمكافأة¹². هنا، لتجسيد تنفيذ بروتوكولات RT-PP و NCP، تم حقن ناقل الدوبامين (DAT)-Cre¹⁹ وناقل الغلوتامات المصنوعة على المركبات 2 (VGLUT2)-Cre²⁰ الفئران المعدلة وراثياً بشكل مجسم مع AAV تحمل بناء الحمض النووي channelrhodopsin2 (ChR2) في VTA حيث تم زرع ألياف بصرية فوق VTA. الاستجابات السلوكية التي تم الحصول عليها عند تحليل هذه الفئران باستخدام RT-PP والبروتوكولات NCP المقدمة يبين كيف تفعيل الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتجية داخل VTA يؤدي إلى استجابات سلوكية مختلفة(الشكل 1).

يتم توفير بروتوكولات خطوة بخطوة لنماذج RT-PP و NCP بمعلومات تتراوح بين الجينوغرافيا للفئران المعدلة وراثياً والحقن الفيروسية الاستريوتاكسية ووضع الألياف البصرية، إلى برمجة برامج التتبع للتحكم بالليزر والسلوك تقييم. وبالإضافة إلى ذلك، تناقش اقتراحات إدخال تعديلات على البروتوكول من حيث بارامترات التحفيز والجوانب التجريبية التي يمكن أن تؤثر على النتيجة العلمية. في حين يتم وصف البروتوكولات في سياق VTA ، يمكن تطبيقها على أي منطقة الدماغ أو السكان العصبية ، شريطة أن تتوفر أدوات علم الوراثة البصرية ذات الصلة ، مثل Cre-driver وopsins floxed.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة باستخدام heterozygous DAT-Cre¹⁹ و VGLUT2-Cre²⁰ الفئران من كلا الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين > 8 أسابيع ووزنها > 20 غرام. وأجريت جميع التجارب وفقا ً لقانون رعاية الحيوان SFS 1998:56) وتشريعات الاتحاد الأوروبي (الاتفاقية ETS 123 والتوجيه 2010/63/EU) بإذن من اللجان الأخلاقية الحيوانية المحلية.

1. جينوجية الفئران

1. تناول خزعات الأذن باستخدام جهاز لكمة الأذن لاستخدامها في الجينوبة للفئران المعدلة وراثياً.
2. إعداد اللكمات الأذن لأداء تفاعل سلسلة البوليميراز (PCR) باستخدام التمهيديات المصنوعة لهذا الغرض.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام التمهيديات الموجهة Cre.
   1. أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانليس (المخزن المؤقت 1: 250 mM NaOH، 2 mM EDTA) في كل أنبوب 1.5 مل يحتوي على لكمة الأذن.
   2. احتضان في كتلة التدفئة في 96 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   3. دع العينات تبرد لمدة 5 دقيقة ثم أضف 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد (المخزن المؤقت 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
3. تنفيذ PCR وفقا للإجراءات القياسية^12،21 باستخدام التمهيديات المناسبة (هنا : Cre FW 5'-ACGAGTGATAGAGTTCGCAAGA-3'، Cre REV 5'-ACCGACGATAGAGGTGTTAG-3').
   تنبيه: العمل على الجليد تحت غطاء PCR وإيلاء الاهتمام لعدم تلويث الكواشف والعينات.
   1. إعداد مزيج ماجستير PCR. ضرب وحدات التخزين التالية وفقا لكيفية العديد من العينات التي سيتم تحليلها، بما في ذلك عينات التحكم المناسبة. اخلط الكواشف لتفاعل نهائي واحد للحجم 25 ميكرولتر بالترتيب التالي: الماء المقطر (18.9 ميكرولتر)، 10 x المخزن المؤقت مع MgCl₂ (2.5 ميكرولتر)، 10 mM dNTP مزيج (0.5 ميكرولتر)، 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي (1 μL)، 10 μM التمهيدي العكسي (1 μL)، 5 U/μL الحمض النووي البوليمر (0.1 μL)، والحمض النووي القالب (1 μL). سيتم إضافة في الخطوات التالية).
      ملاحظة: دائماً إضافة عنصر تحكم سالب وموجب وفارغ (بدون الحمض النووي القالب) لضمان نتائج صالحة.
   2. أضف 24 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR.
   3. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي القالب (القادمة من لكمة الأذن من كل فأرة) في كل أنبوب PCR.
   4. الطرد المركزي أنابيب PCR لفترة وجيزة لضمان الحمض النووي القالب داخل المزيج الرئيسي.
   5. تنفيذ PCR مع الدراجة الحرارية باستخدام برنامج ركوب الدراجات في الجدول 1.
4. إعداد هلام أغاروز لتشغيل العينات باستخدام الكهربائي.
   ملاحظة: يعتمد الحجم على عدد العينات التي تحتاج إلى تحليل.
   1. إضافة 1٪ ث / v مسحوق أغاروز في 1x تريس-خلات-EDTA (TAE) عازلة في زجاجة. الحرارة في الميكروويف حتى يذوب الأغروس تماما، والتحقق بانتظام أنه لا يغلي.
      تنبيه: اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الحروق.
   2. دع الجل يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية وأضف بقعة هلام ية من الحمض النووي (0.5 ميكرولتر/50 مل من الجل).
   3. صب الجل في علبة الصب التي تحتوي على أمشاط جيدا وتركها في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح صلبتماما. إزالة الأمشاط بلطف.
   4. ملء خزان الكهربائي مع 1x تاي العازلة ووضع الجل في الخزان.
   5. أضف 2 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي 1x في كل عينة من عينات الحمض النووي.
   6. تحميل 4 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في البئر الأول من الجل ، ثم المضي قدما لتحميل الحجم الكامل للعينات في الآبار المتبقية.
   7. تعيين مصدر الطاقة من الكهربائي إلى 140 V وتشغيل لمدة 25-30 دقيقة.
   8. ضع الجل تحت مصدر الأشعة فوق البنفسجية وخذ صورة للنتائج.

2. جراحة Stereotaxic

1. بعد الجينوبة ، والفئران منفصلة حفظ تلك إيجابية لكري. انتظر حتى يبلغ واهمًا 8 أسابيع من العمر ويزن 20 جرامًا لإجراء عملية جراحية.
   1. تعقيم البيئة وتعقيم الأدوات الجراحية لإجراء الجراحة في ظل ظروف معقمة.
   2. حقن الفئران تحت الجلد مع مسكن 30 دقيقة قبل الجراحة.
   3. تخدير الفئران بالإيزوفران (2-3% في الهواء العادي للحث و1.5−2.0% للحفاظ على التخدير). ضمان مستوى التخدير الكافي يتحقق عن طريق اختبار عدم وجود ردود فعل الألم عن طريق قرص بلطف إصبع القدم من الماوس. ضبط تسليم isoflurane وفقا لذلك.
   4. وضع الماوس على جهاز stereotaxic. إضافة زيوت التشحيم العين لمنع آفات العين بسبب جفاف وحلاقة الشعر من أعلى الجمجمة. استخدام وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة مستقرة الماوس.
   5. حقن 100 ميكرولتر من مخدر موضعي تحت جلد الجمجمة والسماح 5 دقيقة لتأخذ حيز التنفيذ.
   6. إعداد موقع شق من قبل ثلاثة تطبيقات دائرية من الكحول أو المالحة المعقمة بالتناوب مع اليود. استخدام طرف القطن المعقم وبدء التطبيق من خط شق، إلى الخارج.
   7. رفع بلطف الجلد مع ملقط، وجعل شق ~ 1.5 سم على طول محور rostrocaudal مع مقص الجراحية للكشف عن سطح الجمجمة.
   8. باستخدام عصا القطن، وتطبيق H₂O₂ الحل لإزالة periosteum.
   9. شطف الجمجمة مع المالحة المعقمة وتجفيفها باستخدام أطراف القطن المعقمة.
   10. تحديد موقع bregma ولامدا.
   11. تأكد من محاذاة الجمجمة المسطحة عن طريق وضع طرف إبرة الحقن ، المعدلة على الإطار الاستريوكليك ، على bregma و lambda. قياس الإحداثيات البطنية لكل موقف ومقارنة. عندما تكون الجمجمة مسطحة الإحداثي البطني لكل من البريجما ولامدا متطابقة. إذا لم يكن كذلك، ضبط موقف الرأس واتخاذ القياسات مرة أخرى.
   12. العثور على ووضع علامة على الموقف (ا ف ب: -3.45 ملم, ML: -0.2 مم من bregma وفقا لفرانكلين وPaxinos²²⁾حيث حقن الفيروس المعتمد على الكري وزرع الألياف البصرية سوف تجري وجعل حفرة صغيرة باستخدام الحفر الدقيقة.
   13. تحميل 400 nL من الفيروس في حقنة 10 ميكرولتر التي شنت على جهاز stereotaxic باستخدام مضخة دقيقة.
   14. خفض الإبرة (34 G، beveled) بعناية وحقن 300 nL من فيروس الرجعية المعتمدة على الكري(AAV5-EF1a-DIO-ChR2 (H134)-eYFP [5.6 × 10¹² vg/mL]) في VTA (AP: -3.45 مم، ML: -0.2 مم من bregma و-4.4 مم من سطح الجمجمة، وفقا لفرانكلين وباكسينوس²²⁾بمعدل حقن 100 nL/min باستخدام مضخة دقيقة.
   15. بعد الحقن ، اترك الإبرة في مكانها لمدة 10 دقيقة إضافية للسماح بنشر الفيروس(الشكل 2A).
   16. اسحب الإبرة ببطء من موقع الحقن.
   17. جعل ثقوب صغيرة باستخدام microdrill لتناسب مسامير مرساة من شأنها أن استقرار الألياف البصرية ومجمع الاسمنت الأسنان.
   18. اتخاذ إحداثيات bregma مرة أخرى وزرع الألياف البصرية (قطرها 200 ميكرومتر، 0.37 NA) في: AP: -3.45 ملم، ML: -0.2 ملم من bregma و -4.0 ملم من سطح الجمجمة(الشكل 2B)وفقا لفرانكلين وباكسينوس²².
   19. تأمين الألياف على الجمجمة باستخدام الاسمنت الأسنان. تطبيق ما يكفي من الاسمنت حول ferule الألياف البصرية لتأمينه إلى الجمجمة ولكن إيلاء الاهتمام لترك 3-4 ملم من الجزء العلوي من ferule خالية من الاسمنت للسماح اتصال الحبل التصحيح(الشكل 2C).
       ملاحظة: إيلاء الاهتمام لا لملء الثقب مع الاسمنت لأن هذا يمكن أن يسبب تلف أنسجة الدماغ. يمكن إضافة مواد الهيموستاتيكي في الحفرة لمنع حدوث ذلك.
   20. استخدام الغراء الأنسجة أو الغرز القابلة للامتصاص لإغلاق أي جرح مفتوح وترك الحيوان للتعافي لمدة أسبوعين على الأقل. إعطاء جرعة إضافية من المسكنات 12-24 ساعة بعد الجراحة.

3. إعداد السيطرة على مصدر الليزر

1. استخدام وحدات تحكم دقيقة لوحة واحدة للسيطرة على مصدر الليزر. كتابة برنامج نصي باستخدام البرنامج المناسب. تحميل البرنامج النصي على لوحة متحكم باستخدام كابل الاتصال المناسب إلى الكمبيوتر.
   ملاحظة: يجب أن يتضمن البرنامج النصي التشكيل الخارجي (الإدخال) القادم من برنامج التتبع من خلال مربع TTL، وإخراج إلى الليزر للتحكم في معلمات التحفيز. لعرض نبض 10 مللي ثانية في تردد 20 هرتز، استخدم البرنامج النصي الموجود في ملف الترميز التكميلي.
2. قم بتوصيل اللوحة بالليزر ومربع TTL لأجهزة التتبع.
   1. استخدام كابل شبكة لتوصيل مربع TTL إلى المجلس (دبوس 5 للبرنامج النصي المقدمة)(الشكل 3A, C).
   2. تأكد من تعيين الليزر للتحكم عن طريق التشكيل الخارجي وربط الليزر إلى المجلس باستخدام كابل FC / PC (دبوس 13 للسيناريو معين)(الشكل 3B، C).
   3. قم بتوصيل الدبابيس المناسبة بالأجزاء الأرضية من اللوحة.
3. قم بتوصيل مصدر الليزر بالألياف البصرية.
   1. توصيل مصدر الليزر إلى مشترك دوار(الشكل 3D).
   2. توصيل سلك التصحيح(الشكل 3E)إلى المفصل الدوار.
   3. استقرار المفصل الدوار فوق الجهاز ولكن خارج منطقة التسجيل. تأكد من طول سلك التصحيح الألياف البصرية هو المناسب للسماح للفأرة للتحرك دون صعوبات في الساحة(الشكل 3F).

4. إعداد التجربة لنهج RT-PP داخل برنامج التتبع

1. معايرة إعداد الساحة. استخدم مسطرة لقياس جزء معين من الجهاز المادي ، ورسم خط مطابق للجزء الذي تم قياسه على الصورة داخل البرنامج تحت مقياس السحب لمعايرة علامة التبويب وأدخل القيمة المعروفة بالفعل (الخطوة 1 في الشكل 4).
2. تصميم الساحة. رسم المنطقة حيث سيتم تسجيل حركة الفئران (الخطوة 2 في الشكل 4).
3. إنشاء المناطق. رسم المناطق التي سيتم تعيينها في نهاية المطاف كليزر يقترن، ليزر غير مقترنة و "محايدة" (الخطوة 3 في الشكل 4).
4. التحقق من صحة الإعداد للتأكد من عدم وجود معلمات متعارضة، على سبيل المثال المناطق خارج الساحة (الخطوة 4 في الشكل 4)
5. تعيين المعلمات التجريبية تحت إعدادات التحكم التجريبي علامة التبويب (الخطوة 5 في الشكل 4).
   1. تعيين وقت المحاكمة كما هو موضح في الخطوة 1 في الشكل 5 لجلسة RT-PP 30 دقيقة.
   2. التأكد من تمكين "التحكم في الأجهزة"، قم بتعيين حجرة كاقتران بالليزر حيث سيؤدي إدخال الماوس إلى تشغيل إشارة TTL من خلال برنامج التتبع إلى لوحة المتحكم الدقيق. في الشكل 5 (الخطوة 2) المقصورة المقترنة بالليزر هي المقصورة A. بالنسبة لمرحلة الانعكاس، قم بتبديل المقصورات بحيث يتم إقران المقصورة B بالليزر وسيتم إلغاء إقران المقصورة A. القيام بذلك عن طريق استبدال A مع B و B مع A في البرنامج.

5. تعديل الإعداد لاختبار الخصائص الوافية للتحفيز باستخدام نهج NCP

1. اتبع الخطوات 4.1−4.4 كما هو موضح سابقاً.
2. تعيين وقت التجربة إلى 30 دقيقة من خلال خيار "تكرار حتى" في إعدادات مربع "مرجع" (الخطوة 1 في الشكل 6).
3. تعيين كل من المناطق A و B كليزر مقترن (الخطوة 2 في الشكل 6)عن طريق إضافة "عندما تكون نقطة الوسط في أي من المنطقة A و المنطقة B" لمربع الشرط المتعلقة بإعدادات المقصورات A و B. لاحظ أن الليزر سيتم إيقاف عند الحيوان يقع في المقصورة المحايدة.

6. إجراء تجربة باستخدام التحفيز بالليزر

1. إعداد إعدادات الكشف.
   1. استخدم دمية لتشبه الماوس من أجل ضمان إعدادات الكشف المناسبة.
   2. ضع الدمية في حجرة واحدة من الجهاز واستخدم الإعداد الآلي مع الطرح الديناميكي.
   3. إزالة دمية ووضعها في المقصورة المقابلة. تأكد من الكشف عن دمية تماما وإذا لم يكن كذلك، ضبط الإعدادات عبر البرنامج لتحقيق الكشف السليم.
      1. خلال هذه الخطوة أيضا تحقق مما إذا كان يعمل التحفيز كما هو مفترض. ابدأ عملية الشراء باستخدام إعدادات التحكم التجريبي التي تم تكوينها مسبقًا ووضع الدمية في حجرة الليزر المقترنة ومعرفة ما إذا كان التحفيز قد تم تشغيله كما يجب. ثم ضع الدمية في المقصورة غير المقترنة و / أو محايدة ومعرفة ما إذا كان يتم إيقاف التحفيز.
2. استخدام عداد الطاقة مع جهاز استشعار لتعيين قوة الليزر إلى 10 mW باستخدام مقبض الباب على الليزر(الشكل 3B). تنفيذ هذه الخطوة في كل مرة يتم فيها استخدام تحفيز الليزر.
   تنبيه: استخدام معدات العين الواقية كما التعرض المباشر لضوء الليزر يمكن أن يسبب تلف العين الدائم.
3. وضع الماوس في الجهاز.
   1. أخرج الماوس برفق من قفصه وتوصيل غرسة الألياف البصرية بسلك التصحيح من الألياف البصرية باستخدام كم خزفي.
   2. ضع الماوس برفق في المقصورة المحايدة لجهاز الحجرة الثلاثة.
   3. انتظر حتى يتم الكشف عن الماوس بواسطة البرنامج.
   4. إزالة الأبواب المنزلقة الرأسية التي تقيد الحيوان من دخول المقصورات الرئيسية.
   5. السماح للالحيوان لاستكشاف بحرية دون أي اضطرابات.
      ملاحظة: يتم اتباع نفس الإجراء عندما لا يتلقى الحيوان التحفيز باستثناء أن الخطوة 6.2 غير مطلوبة وأن الليزر خارج طوال الوقت.

Results

جهاز ثلاث مقصورات(الشكل 3F)هو مناسبة لمعالجة الآثار المجزية للمخدرات وتقييم في الوقت الحقيقي الخصائص المجزية أو aversive من التحفيز المباشر للخلايا العصبية باستخدام optogenetics. وهو يتألف من مقصورتين رئيسيتين (20 سم [W] × 18 سم [L] × 25 سم [H]) ومقصورة ربط أصغر (20 سم [W] × 7 سم [L] × 25 سم [H]). تحتوي المقصورات الرئيسية على جدار ونسيج منفصل ونقوش من أجل تسهيل التعلم النقابي ، في حين أن المقصورة المحايدة / الاتصال ضيقة وشفافة بحيث تقضي الفئران وقتًا أقل بشكل طبيعي فيها. كما هو موضح أعلاه ، يمكن استخدام برنامج التتبع لتسجيل العديد من المعلمات السلوكية للفئران بما في ذلك الحركة والوقت الذي يقضيه في كل حجرة ، وللتحكم في تحفيز الليزر. تجري تجربة RT-PP بأكملها طوال 8 جلسات(الشكل 1A)وتتيح كل من تقييم الخصائص المجزية أو الوافرلل للتحفيز المباشر (الأيام 3 و 4 و 6 و 7) وتشكيل الجمعيات ، الإيجابية أو السلبية ، استجابة للتجربة السابقة (اليومان 5 و 8 ،"CR").

أولا، اختبرنا الفئران DAT-Cre حقنمع فيروس AAV-ChR2-eYFP في VTA لاستهداف الخلايا العصبية الدوبامين. وفقا ً للأدبيات لاحظنا أن الفئران فضلت قضاء بعض الوقت في المقصورة مقترنة بالتحفيز(الشكل 1B، المرحلة 1 ، الأيام 3 و 4 ، الدوائر الزرقاء ، تحليل المقاييس المتكررة في الاتجاهين [RM] تحليل التباين [ANOVA] ، تأثير المقصورة F_(2،18) = 141 ، p < 0.001 ؛ تأثير الجلسة x المقصورة F_(12،108) = 42.1 ، p & lt; 0.001 اختبار Tukey في مرحلة ما بعد مخصصة يقترن مقابل غير مقترنة ف < 0.001). مرحلة الانعكاس، حيث تم تبديل الاقتران بين المقصورات لتحفيز الليزر، أكدت هذه الملاحظات(الشكل 1B، أيام 6 و 7 ، الدوائر الزرقاء ، اختبار Tukey post hoced paired مقابل مقصورة غير مقترنة p < 0.001) وبالتالي استبعاد إمكانية أن النتائج التي تم الحصول عليها من المرحلة 1 كانت مرتبطة بالتحيزات الجانبية أو المعلمات العشوائية. في المتوسط الوقت الذي يقضيه في كل مقصورة خلال الأيام الأربعة من RT-PP أكد أن الفئران قضى في المتوسط حوالي 70٪ من وقتهم في مقصورة الليزر المقترنة بدلا من غير مقترنة (~ 20٪) ومحايد (~ 10٪) مقصورات(الشكل 1B شريط الرسم البياني، اتجاه واحد RM ANOVA، تأثير التحفيز F_(2،6) = 139، p < 0.001، آخر توكي كيف يقترن مقابل مقصورات غير مقترنة ومحايدة ف < 0.001). وعلاوة على ذلك، في غياب التحفيز، في اليومين 5 و 8، أمضى الفئران وقتاً أكبر بكثير في المقصورة سابقاً يقترن التحفيز بالليزر (توكي في مرحلة ما بعد مخصصة ف < 0.001)، مما يشير إلى أن التجربة السابقة كانت كافية لتحفيز سلوكيات التعلم النقابي ينعكس على أنها "تسعى" للتحفيز. هذه البيانات هي وفقا للمؤلفات وتبين أن الطريقة الحالية يمكن استخدامها بشكل موثوق للتحقيق في الآثار المجزية للتحفيز optogenetic من مجموعات عصبية محددة في VTA.

ثم اختبرنا الفئران VGLUT2-Cre حقنمع AAV-ChR2-eYFP في VTA على النحو الوارد أعلاه، لاستهداف الخلايا العصبية الجلوتاماتمن VTA. في هذه التجربة، لاحظنا نمط ظاهري سلوكي معاكس من النمط الذي أظهرته فئران DAT-Cre. وهكذا، تجنبت الفئران المقصورة مقترنة بالتحفيز وأمضت المزيد من الوقت في غير مقترنة خلال جميع أيام RT-PP(الشكل 1C اليسار، في اتجاهين RM ANOVA، تأثير المقصورة F_(2،12) = 40.9، p < 0.001؛ تأثير الجلسة x المقصورة F_(12،72) = 16.1، p < 0.001؛ اختبار Tukey في مرحلة ما بعد مخصصة يقترن مقابل p غير مقترنة < 0.001; الشكل 1C الحق، في اتجاه واحد RM ANOVA تأثير التحفيز F_(2،6) = 162، p < 0.001، آخر توكي مخصص يقترن مقابل مقصورات غير مقترنة ومحايدة ف < 0.001). ومن المثير للاهتمام، خلال"CR"أيام 5 و 8، لم الفئران لم تظهر تجنب واضح للمقصورة مقترنة سابقا (لا توجد اختلافات بين المقصورات المقترنة وغير مقترنة). من الممكن أن يعزى عدم وجود استجابة مشروطة إلى عدم كفاية الوقت الذي يقضيه في المقصورة المقترنة بالليزر ، مما حال دون تكوين روابط بين تنشيط الليزر والبيئة الخاصة التي حدث فيها ذلك. لمزيد من استكشاف هذا النمط الظاهري تجنب، استخدمنا بروتوكول تعديل الذي كنا اسمه "تفضيل مقصورة محايدة"، اختصار NCP. في هذه التجربة ، تم إقران كل من المقصورات الرئيسية إلى التحفيز وبقيت المقصورة المحايدة خالية من التحفيز(الشكل 7A). افترضنا أنه إذا كان للتحفيز خصائص وافية، فإن الفأر سيضطر لقضاء بعض الوقت في المقصورة المحايدة الأصغر، لتجنب ذلك. في الواقع ، في كل من أيام التحفيز (Stim1 و Stim2) الفئران قضى معظم الوقت في المقصورة المحايدة (حوالي 80 ٪) ، والفئران في وقت واحد (حوالي 80 ٪) بالمقارنة مع المقصورات المقترنة(الشكل 7B, C; اليسار: في اتجاهين RM ANOVA تأثير المقصورة F_(2,8) = 70.9, p < 0.001؛ تأثير الجلسة × المقصورة F_(4,16) = 6.9، p = 0.002، مقصورة Tukey post hoc "التحفيز 1" محايدة المقصورة مقابل 1 و 2 p < 0.01، "التحفيز 2" مقصورة محايدة مقابل المقصورة 1 و 2 p < 0.001; إلى اليمين: اتجاه واحد RM ANOVA، تأثير التحفيز F_(2,2) = 54.2، p = 0.018، اختبار توكي بعد مخصص يقترن 1 و 2 مقابل p < محايدة 0.05). كما هو الحال في"CR"أيام خلال اختبار RT-PP ، لا يبدو أن الفئران تشكل روابط سلبية بين المقصورات والتحفيز ؛ وهذا هو، في غياب التحفيز (CR)، أنها استكشاف جميع المقصورات إلى نفس الدرجة(الشكل 7B،لا توجد اختلافات بين الوقت الذي يقضيه في مقصورات مقترنة ومقصورة محايدة). وأكدت نتائج هذه التجارب النمط الظاهري السلوكي الذي لوحظ أثناء إعداد RT-PP وبالتالي دعم التنفيذ الجمعي لكل من نماذج RT-PP و NCP.

الشكل 1: الاختبار السلوكي باستخدام علم الوراثة البصرية في نموذج RT-PP. (أ)التمثيل التخطيطي للجدول الزمني للتجارب. (B, C) أعلى اليسار: رسم بياني يمثل النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه في كل مقصورة في جميع أنحاء تجربة RT-PP لDAT-Cre (N = 10) وVGLUT2-Cre (N = 7) الفئران التي تم حقنها بالفئران AAV-ChR2-eYFP. الدوائر الزرقاء: مقصورة مقترنة بالليزر؛ دوائر بيضاء سوداء: مقصورات رئيسية؛ الدوائر الرمادية: مقصورة محايدة. أعلى اليمين: متوسط النسبة المئوية للوقت المستغرق في كل مقصورة خلال الأيام 3 و 4 و 6 و 7 (RT-PP). أسفل: خرائط الحرارة التمثيلية للوقت الذي يقضيه في كل مقصورة لDAT-Cre وماوس VGLUT2-Cre. وكانت جميع البيانات توزع عادة (اختبار شابيرو - ويلك). يتم تقديم النتائج على أنها متوسط ± SEM. ***p < 0.001 مقترنة مقابل غير مقترنة؛ #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 يقترن مقابل مقصورة محايدة; §§p < 0.01, §§§p < 0.001 غير مقربين مقابل مقصورة محايدة. وقد عُدِّل هذا الرقم من بيمبيسيديديس^{وآخرين.} يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إجراء العمليات الجراحية للتجارب البوجينية. (أ)حقن ناقلات الفيروسية التي تعتمد على الكري في VTA. (ب)زرع الألياف البصرية فوق موقع الحقن. لاحظ مسامير مرساة المستخدمة لتحقيق الاستقرار. (ج)الرسو الدائم للألياف على الجمجمة باستخدام أسمنت الأسنان. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: المعدات المستخدمة في تجارب علم الوراثة البصرية. (أ)مربع TTL المستخدمة في الدراسات. فإنه يتلقى المدخلات من برنامج التتبع ويرسل إشارات TTL إلى لوحة متحكم دقيق. (ب)الجبهة (أعلى) والرؤية الخلفية (أسفل) من مصدر الليزر المستخدمة للتجارب. (C)لوحة متحكم تستخدم للسيطرة على التحفيز الليزر. لاحظ الاتصالات من مربع TTL وإلى مصدر الليزر. (د)الروتاري المشترك. (E)الألياف البصرية وتر التصحيح المستخدمة في التجارب. (واو)جهاز الحجرة الثلاث المستخدمة لتجارب RT-PP وNCP. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تصميم الساحة والمناطق داخل برنامج التتبع. الخطوة 1: معايرة الإعداد. الخطوة 2: رسم الساحة بأكملها. الخطوة 3: مناطق الرسم داخل الساحة. الخطوة 4: التحقق من صحة الإعداد. الخطوة 5: علامة التبويب إعدادات التحكم التجريبي لإعداد معلمات الوقت والتحفيز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: إعداد معلمات الوقت والتحفيز لتجربة RT-PP داخل برنامج التتبع. إضافة قواعد محددة لمدة (الخطوة 1) وشروط تحفيز الضوء (الخطوة 2). يمكن تغيير الشروط بسهولة لتناسب متطلبات مرحلة الانعكاس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: إعداد الوقت ومعلمات التحفيز لتجارب NCP داخل برنامج التتبع. مدة جلسات التحفيز (الخطوة 1) مماثلة لتلك التي لRT-PP ولكن شروط تنشيط تحفيز الضوء (الخطوة 2) مختلفة. يؤدي الدخول إلى أي من المقصورة الرئيسية (هنا تسمى المنطقة A والمنطقة B) إلى التحفيز البوجيني الذي يتم إنهاؤه فقط عندما يدخل الماوس إلى المقصورة المحايدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: الاختبار السلوكي باستخدام علم الوراثة البصرية في نموذج NCP. (أ)التمثيل التخطيطي للإعداد التجريبي. (ب)إلى اليسار: رسم بياني يمثل النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه في كل مقصورة خلال يومي التحفيز (Stim1 وStim 2) وخلال جلسة الاستجابة المكيفة (CR) لفئران VGLUT2-Cre التي تم حقنها بـ AAV-ChR2 في VTA (N = 5). اليمين: متوسط النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه في كل مقصورة خلال يومين من تحفيز NCP. (C)خريطة حرارة تمثيلية للوقت الذي يقضيه في كل مقصورة لفأر VGLUT2-Cre خلال أحد أيام التحفيز. وكانت البيانات توزع عادة (اختبار شابيرو - ويلك). يتم تقديم النتائج على أنها متوسط ± SEM. *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001 غير مقترن مقابل 1 ومقترنة 2 مقصورات. وقد عُدِّل هذا الرقم من بيمبيسيديديس^{وآخرين.} يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خطوه	درجه الحراره	مده	دورات
1- التهيئة الأولية	95 درجة مئوية	4 دقيقة	1
2- التهيّر	95 درجة مئوية	30 s	30
3. أنالينغ	55 درجة مئوية	30 s
4- التمديد	72 درجة مئوية	40 s
5- التمديد النهائي	72 درجة مئوية	6 دقيقة	1
6. عقد	4 درجات مئوية	حتى توقف من قبل المجرب	1

الجدول 1: برنامج ركوب الدراجات PCR.

ملف ترميز تكميلي. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).

Discussion

في الدراسة الحالية، نقدم بروتوكولين خطوة بخطوة لكيفية إجراء أنواع مختلفة من تحليلات تفضيل المكان باستخدام علم الوراثة البصرية في الفئران. تم استخدام البروتوكولات المبينة لتقييم الأنماط الظاهرية السلوكية المجزية أو الوافر للخلايا العصبية VTA(الشكل 1 والشكل 6)¹²، ولكن يمكن استخدامها لاستكشاف الدور السلوكي للخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى أيضًا.

وقد وصفت العديد من الدراسات الحديثة نماذج RT-PP في اثنين من المقصورة^23،24 وثلاثة أجهزة مقصورة^{13،14،15، 16،17،18}. تصف البروتوكولات الحالية الإعدادات التفصيلية لبروتوكولات RT-PP و NCP في جهاز من ثلاث مقصورات يشبه تلك المستخدمة تقليديًا في تجارب CPP لتقييم الآثار السلوكية على إعطاء أدوية التعاطي. في حين يتم تقديم النتائج هنا فقط كنسبة مئوية من الوقت الذي يقضيه الماوس في كل حجرة ، فإن برنامج التتبع يسمح بتحليل العديد من المعلمات السلوكية الأخرى ، مثل التحولات إلى المناطق والسرعة والوقت الذي يقضيه غير متحرك وأكثر من ذلك. ويمكن أن يكون تحليل البارامترات المختلفة ذات أهمية لتفسير البيانات.

بروتوكولات RT-PP الحالية مرنة ويمكن تعديلها لاختبار ما إذا كانت أنواع مختلفة من أنماط التحفيز لها تأثيرات مجزية. يمكن تغيير معلمات التحكم بالليزر بسهولة إما من خلال البرنامج النصي للوحة المتحكم الدقيق أو داخل برنامج التتبع ، مما يدل على براعة الإعداد. نقترح تردد تحفيز 20 هرتز الذي هو ضمن نطاق، وأحيانا أقل، من الترددات المطبقة في الدراسات السابقة باستخدام نفس البديل opsin (ChR2/H134R) لدراسة الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتية ومحطاتها^{13،14،16،17،18،23،24، 25،26،27}. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ترددات التحفيز العالي يمكن أن يكون لها آثار عكسية على السلوك من الترددات المنخفضة ، وأن هذه الآثار يتم التوسط من خلال كتلة نزع الاستقطاب الناجمة عن الترددات الأعلى^28. وبالمثل ، وقد تبين الاختلافات في الإخراج السلوكي عند تحفيز الجلوتاماتال والخلايا العصبية GABAergic في المنطقة قبل البصري الجانبي^15. فحصت هذه الدراسات الخلايا العصبية من مناطق مختلفة من VTA ولوحظت أكبر الآثار على الترددات العالية من الخلايا العصبية غير الجلوتامات15^،28. ويستند اختيارنا على 20 هرتز على الدراسات السابقة من الخلايا العصبية VTA الجلوتاميتي والدوبامين مما يدل على أنه من خلال ترددات التحفيز المختلفة، لا يتم تغيير المخرجات السلوكية ذات الصلة بالمكافأة بشكل كبير^24،26.

معلمة إضافية يمكن تعديلها والتي قد تؤثر على النتيجة التجريبية هي قوة مصدر الضوء. قوة ليزر أعلى يمكن أن تزيد من حجم المنطقة التي تحفز الضوء ، والتي قد تكون مفيدة في بعض أنواع التجارب ولكن مع عيب زيادة في درجة الحرارة^5. في الواقع ، أظهرت دراسة حديثة أن الزيادات الناجمة عن الليزر في درجة الحرارة يمكن أن تغير فسيولوجيا الدماغ وتؤثر على القياسات السلوكية^29. هذه الملاحظات تسليط الضوء على أهمية إدراج الضوابط السلبية opsin في التصميم التجريبي. في البروتوكول الحالي، استخدمنا 10 mW قوة الليزر التي هي مماثلة، وقد ثبت سابقا أن تكون فعالة في تحفيز الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتفية في VTA^16،24،26. عند إعداد التجارب ، من المهم الانتباه إلى حجم المنطقة التي توجد فيها الخلايا ذات الاهتمام وخصائص الألياف البصرية وحبل التصحيح (الفتحة العددية ، القطر الأساسي). هذه المعلمات ضرورية لتأخذ في الاعتبار عند إجراء العمليات الحسابية المتعلقة بقوة الليزر. لمزيد من التفاصيل، يمكن استخدام الآلة الحاسبة التي طورها مختبر كارل ديسيروث(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).

التحقق من الهيسولوجية لإعادة تركيب Cre-Lox هو جانب حاسم آخر عند تطبيق تجارب علم الوراثة البصرية. التحقق من كفاءة إعادة التركيب يجب أن يتم دائمًا في مجموعة تجريبية قبل بدء أي تجارب سلوكية في مجموعة كبيرة من الحيوانات. وهذا أمر مهم لأسباب أخلاقية ولكن أيضا للناتج التجريبي الأمثل. قد يظهر كل بناء فيروسي خصوصية متغيرة لأنواع الخلايا العصبية المتميزة وفي مناطق مختلفة⁵، وهي معلمة يمكن أن تؤثر على التجارب بطرق لا يمكن التنبؤ بها وحتى مضللة. على سبيل المثال، قمنا في السابق بالتحقق من صحة نمط إعادة تركيب Cre-Lox لفيروسات AAV5 في VTA من فئران DAT-Cre ووجدنا أن الحقن الأحادية كانت كافية لاستهداف غالبية منطقة الاهتمام. عندما درسنا بعد ذلك التجمعات الفرعية المقيدة مكانًا داخل VTA ، مثل تلك التي تتميز بتعبير NeuroD6 ، لاحظنا أن الحقن الفيروسية الثنائية كانت أكثر كفاءة لاستهداف عدد أكبر من الخلايا العصبية مما يعطي تأثيرات سلوكية أكثر وضوحًا على التحفيز الضوئي للضوء¹². وعلاوة على ذلك، فإن الوقت من الجراحة إلى بدء التجارب السلوكية يجب أن تعالج بعناية. أسبوعين هو الوقت الكافي لبناء الحمض النووي ChR2 أن أعرب في الهيئات الخلية كما نظهر هنا، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى فترات انتظار أطول (~ 8 أسابيع) إذا كان المحقق هو اختبار تأثير التحفيز في مناطق الإسقاط^{13،14،15،17}.

تجدر الإشارة إلى أن حجم الفيروس الذي تم حقنه (في حالتنا 300 nL) قد يكون مناسبًا عند دراسة الخلايا العصبية في VTA ، ولكن يجب تعديل الحجم وtiter اعتمادًا على كفاءة النقل وحجم الهيكل المدروس. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للهياكل الثنائية الواقعة على مسافة من المحور الاصطلاحي، قد يكون من الضروري إجراء حقن ثنائية، وكذلك زرع الألياف البصرية بشكل ثنائي لضمان التنشيط/التثبيط في نصفي الكرة الأرضية.

وأخيراً، من الضروري دائماً إجراء تحليل النسيج بعد الوفاة للتحقق من كفاءة إعادة تركيب Cre-Lox وتأكيدها والتحقق من موقع الزرع الصحيح للألياف البصرية في الموقع المقصود. غير متوقع، الإفراط في تقييد أو الإفراط في إعادة تركيب الكريلوكس قد يحدث بسبب التوزيع غير معروف للخلايا العصبية التعبير عن كري خارج حدود المنطقة المقصودة، أو بسبب الاختلافات في النمط المصلي الفيروس، وسوء التعامل مع الفيروس، انسداد حقنة لتوصيل الفيروس أو غيرها من المشاكل المتعلقة بالجراحة. يجب إجراء التحقق من إعادة تركيب Cre-Lox المرضية وزرع الألياف البصرية الصحيحة لتأكيد أي نتائج إحصائية للتقييمات السلوكية من أجل استخلاص استنتاجات آمنة.

من حيث البيانات المقدمة هنا كأمثلة على كيفية استخدام النموذجين السلوكيين ، كان من المتوقع تفضيل كبير للجانب المقترن بالضوء الذي تم الحصول عليه عن طريق التحفيز الأوبتوري للخلايا العصبية الدوبامين في VTA من خلال تحليل فئران DAT-Cre في نموذج RT-PP استنادًا إلى النتائج السابقة^{23،24،25،26،27} في حين لم يكن من المتوقع تجنب هذا الجانب الذي أظهرته الفئران VGLUT2-Cre. وقد ثبت VGLUT2 الخلايا العصبية من VTA وإسقاطاتها أن تشارك في كل من المكافأة والنفور^{16،17،24،30،31}، ولذلك قمنا بتحليل NCP لتقييم سلوك تجنب واضح لوحظ في الإعداد RT-PP الحالي بمزيد من التفصيل. باستخدام الممر الضيق والشفاف كحجرة غير مضاءة فقط لتأكيد الخصائص الوافرة لتحفيز الخلايا العصبية الجلوتامية VTA ، فمن الواضح أنه في هذا الإعداد ثلاثي المقصورة خاصة ، يؤدي التنشيط البوجيني لهذه الخلايا العصبية إلى استجابة وافيرسية. هذه التجارب، التي أظهرت هنا لمثال الحالات التي قد تستفيد من استخدام كل من بروتوكول RT-PP وNCP، كانت جزءا من دراسة نشرت مؤخرا، ويمكن الاطلاع على مجموعة البيانات الكاملة وكذلك المناقشات بشأن هذه النتائج في هذا المنشور¹².

بالإضافة إلى NCP ، تتضمن الطرق البديلة لتأكيد النفور الإضاءة القوية لمنطقة داخل منطقة حقل مفتوح أثناء إقران بقية الساحة بتنشيط الليزر ، أو تنفيذ مهمة تجنب نشطة حيث يتعين على الماوس تنفيذ نمط سلوك معين لإنهاء التحفيز بالليزر¹⁵.

باختصار، توفر البروتوكولات الموصوفة معلومات هامة حول كيفية إجراء تحليل RT-PP و NCP بنجاح بالطريقة الأكثر كفاءة من أجل كشف دور تنشيط الخلايا العصبية في المكافأة والنفور. اعتمادا على الفرضية العلمية، يمكن تحليل مجموعة من المعلمات باستخدام هذه البروتوكولات، ويمكن أيضا الجمع بين كل بروتوكول مع نماذج أخرى التحقق من صحتها للتحليلات السلوكية الأمثل تنفيذ علم البصريات لمعالجة الدماغ محددة المناطق والخلايا العصبية ذات الأهمية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الفيروس المعتمد على AAV-Cre	UNC Vector Core	-	مجموعة كبيرة ومتنوعة من الفيروسات لتناسب احتياجات أي مشروع
Agarose	VWR Life Science	443666A
Buffer for PCR	KAPA BIOSYSTEMS	KB1003	10x ، يحتوي على 1.5 ملي مولار MgCl2 في 1x
Bupivacaine (Marcain)	Aspen	N01BB01	مخدر موضعي ، محلول 5 مجم / مل ، يتطلب وصفة طبية
كاربروفين (نوروكلوب)	N-Vet	27636	مضاد للالتهابات ومسكن. محلول 50 مجم / مل ، يتطلب وصفة طبية
مجموعة dNTP	Thermo Fisher Scientific	R0181	100mM ، يجب تخفيفه إلى 10 ملي متر وسلم
الحمض النووي	المختلط Thermo Fisher Scientific	SM0243	100 نقطة أساس ، 50 & ز صبغة تحميل الحمض
النووي	Gene Ruler Thermo Fisher Scientific	R0611	6x ، مخفف إلى 1x قبل استخدام
مثقاب الأذن	AgnThos	AT7000	لكسر الأذن لأخذ عينات من الأنسجة ل PCR أو لتمييز
عدسات الألياف البصرية	عدسات دوريك	MFP_200 / 240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
عدسات	دوريك المصنوعة من الألياف البصرية	القابلة للزرع MFC_200 / 245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT	قد تتغير خصائص الألياف اعتمادا على التجربة
مضخة التسريب لحقن الفيروسات يحتوي	AgnThos	Legato 130	على مضخة عن بعد لتأمين المحقنة مباشرة على إطار stereotexi
Isoflurane (Forane)	Baxter	N01AB06	مخدر متطاير ، يتطلب وصفة
طبية مسامير مجوهرات	AgnThos	MCS1x2
مصدر	ليزريمكن طلب لوحة متحكم Marwell Laser	Systems CNI MBL-III-473-100mW
لوحة متحكم Arduino	"Uno"	من عدة شركات
يمكن طلب Microdrill	AgnThos	1474	مع أو بدون حامل مجسم
إبرة (34G)	World Precision Instruments	NF36BV
صبغة جل الحمض النووي - Gel Red	Biotium	41003-T
أنابيب PCR	Axygen	PCR-0208-CP-C
عداد الطاقة	Thorlabs	PM100D
مكان جهاز تفضيل	Panlab	76-0278
عدسات دوريك المشتركة الدوارة		FRJ_1x1_FC-FC
الأكمام عدسات	دوريك	SLEEVE_ZR_1-25	كم التزاوج لتوصيل الرقعة مع البصرية المزروعة
أسمنت تثبيت	Ivoclar Vivadent	Tetric EvoFlow
حقنة (10ul)	الأدوات الدقيقة العالمية	NanoFil
Taq polymerase	KAPA BIOSYSTEMS	KE1000	500U
TAE العازلة	أوميغا BIO-TEK	SKU:	تركيز 50x ، يجب تخفيفه قبل الاستخدام
Cycler الحراري	BIO-RAD S1000	1852148	الضروري لإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل
غراء الأنسجة	برنامج تتبع الأنسجة AgnThos	Vetbond
	صندوق Noldus	Ethovision XT
TTL box	Noldus	Noldus USB-IO صندوق
الأشعة فوق البنفسجية Transilluminator	Azure Biosystems	c200 model