يوضح هذا البروتوكول أساليب تمكين الثقافة الموسعة في المختبر من xenografts المستمدة من المريض (PDX). خطوة واحدة يعزز القدرة على البقاء العام للثقافات العنقودية متعددة الخلايا في الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد، من خلال إزالة مباشرة من الخلايا الفردية غير قابلة للحياة. خطوة ثانوية توضح أفضل الممارسات لثقافة PDX في منصة microfluidic perfused.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
xenografts المستمدة من المريض (PDX) ، التي تم إنشاؤها عندما يتم نقش أنسجة ورم المريض مُجَذَّبًا مباشرةً إلى فئران مُنَاعِدة ، تظل مستقرة بيولوجيًا ، وبالتالي الحفاظ على الميزات الجزيئية والوراثية والهظرية ، وكذلك عدم تجانس الورم الأصلي. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه النماذج لإجراء العديد من التجارب ، بما في ذلك فحص المخدرات ، هو أمر باهظ سواء من حيث التكلفة والوقت. تُنظر إلى أنظمة الاستزراع ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع على أنها منصات تحتفظ فيها الخلايا السرطانية بسلامتها البيولوجية من خلال التفاعلات الكيميائية الحيوية، والمورفولوجيا، والهندسة المعمارية. فريقنا لديه خبرة واسعة في زراعة خلايا PDX في المختبر باستخدام مصفوفات ثلاثية الأبعاد مكونة من حمض الهيالورونيكس (HA). من أجل فصل الخلايا الليفية الليفية الماوس الخلايا الضموية المرتبطة PDXs، ونحن نستخدم ثقافة التناوب، حيث الخلايا القوية تلتزم سطح الأنسجة ثقافة معالجة لوحات بينما خلايا الورم PDX تفكك تعويم والنفس المنتسبين في مجموعات متعددة الخلايا. تطفو أيضا في عظمى هي واحدة، وخلايا ميتة في كثير من الأحيان، والتي تشكل تحديا في جمع مجموعات PDX قابلة للحياة لتغليف المصب في الهيدروجيلز لثقافة الخلية 3D. من أجل فصل هذه الخلايا الفردية من مجموعات الخلايا الحية، لدينا استخدام كثافة الخطوة الطرد المركزي. البروتوكول الموصوف هنا يسمح باستنفاد الخلايا الفردية غير القابلة للحياة من السكان الأصحاء من مجموعات الخلايا التي سيتم استخدامها لمزيد من التجارب في المختبر. في دراساتنا، ونحن دمج الثقافات 3D في لوحات microfluidic التي تسمح لضخ وسائل الإعلام أثناء الثقافة. بعد تقييم الثقافات الناتجة باستخدام مقايسة قابلة للتطبيق تستند إلى الصور الفلورية للخلايا النقية مقابل الخلايا غير النقية ، تظهر نتائجنا أن خطوة الفصل الإضافية هذه خفضت بشكل كبير عدد الخلايا غير القابلة للحياة من ثقافاتنا.
المقدمة
على مدى العقد الماضي، وقد أظهرت مجال أبحاث السرطان الحماس المتجدد لxenografts المستمدة من المريض (PDXs) كأداة لتقييم الاعتماد على مسار الخلايا السرطانية وحساسية المخدرات1. يتم تأسيس نماذج PDX الأكثر شيوعًا عن طريق زراعة الخلايا السرطانية البشرية تحت الجلد أو العظام — وهي جزء من الورم ، أو مجموعة من الخلايا المتفرعة عن الورم المنفصلة ، أو عينة من الخلايا السرطانية المنتشرة المعزولة (CTCs) - في مضيف القوارض. إذا كان الورم "اتخاذ" ناجحا، سوف تتكاثر خلايا xenograft، والأوعية الدموية، والتفاعل خلاف ذلك مع الأنسجة المضيفة لخلق ورم، والتي يمكن حصادها في الحجم الأمثل، وتقسيمها، وإعادة زرعها في المضيفين الآخرين. من بين مزاياها العديدة كنظام نموذجي ، تحتفظ PDXs عادة بجزء كبير من عدم تجانس خلايا الورم الأصلية وتمكن من تقييم المسارات البشرية الخاصة واستجابات الخلايا2،3. في سياق vivo تمكن التفاعل الورم مع الأوعية الدموية وغيرها من السترمة المجاورة وتلخص خصائص الأنسجة مثل ديناميات انتشار المخدرات، والتوتر الأكسجين، وتأثير المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر بيولوجيا وميكانيكيا تطور الورم. الجانب السلبي من PDXs هو اعتمادها على مضيف القوارض ، سواء لتوسيع الورم وفي نهاية المطاف لاختبار الفرضية. لأن العديد من PDXs لا يمكن أن تتكيف مع الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) على زراعة الأنسجة البوليسترين دون أن تفقد العديد من خصائصها المرغوبة ، كان هناك الحد الأدنى من الأرضية الوسطى للباحثين بين هذه الطريقة التي تسيطر عليها نسبيا في المختبر ، والزيادة الكبيرة في النفقات والمرافق ومتطلبات الوقت لاستخدام في الطب البصري PDX.
لقد وصفنا نماذج متعددة في المختبر التي تنفذ ثقافة الخلايا 3D داخل مصفوفة داعمة، وتوسعت مؤخرا أن العمل لإثبات ثقافة الجسم الحي السابق من سرطان البروستاتا متعددة (PCa) المشتقة PDXs، سواء وحدها وفي الثقافة المشتركة مع الخلايا الليفية المشتقة من نخاع العظم4،5. حمض الهيالوروني (HA) القائم على المصفوفات hydrogel توفير الدعم للتخصيص والبيولوجيا ذات الصلة لكلا النوعين الخلية، مع السيطرة السهل على خصائص هيدروجيل والوضوح البصري للتصوير من خلال عمق هيدروجيل6.
أنسجة الورم PDX ناضجة تضم خليط متغير من الخلايا السرطانية البشرية غير متجانسة والماوس ستروما (الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، الخ). لدراسة مساهمات محددة من نوع الخلية في تطور الورم في المختبر ، يمكن أن يكون من المفيد فصل الأورام ، وفصل مجموعات الخلايا ، ودمجها تجريبيًا بطريقة منظمة لتشريح مسارات التواصل بين الخلايا. مجموعات الخلايا المختلطة داخل هضم الأنسجة لديها توافق التفاضلية مع ظروف ثقافة محددة. على سبيل المثال، يستلزم قابلية البقاء الليفية المرتبطة بالورم إما الالتزام السطحي أو مصفوفات ثلاثية الأبعاد وظيفية مع أربطة integrin، في حين أن خلايا PDX المشتقة من الظهارية لا تحتوي عادة على هذه المتطلبات، بدلاً من ذلك تفضل تفاعلات الخلايا الخلية. يمكن استغلال هذه الاختلافات لتحقيق فصل فعال من خلايا PDX من الخلايا الماوس اللوّث stromal. تسمح ثقافة الدوران في هضم الأنسجة بتمسك الخلايا الضمية بسطح ثقافة الأنسجة بينما تدفع التصاقات الخلايا الخلوية خلايا PDX العائمة فوق سطح الثقافة الدوارة لتشكيل مجموعات متعددة الخلايا في المابير في 24−48 ساعة. وتختلف الخصائص المحددة لهذه المجموعات مع PDX (مثل، مجموعات كبيرة، ضيقة، كروية للغاية أو مجاميع أصغر وفكها تشبه عناقيد العنب)، ولكنها عادة ما تكون ذات أحجام ذات صلة بيولوجيا (قطر 50-250 ميكرومتر)، كافية لتقييم التفاعلات الخلوية التي تعتمد على الاتصالات بين الخلايا.
يؤدي استرجاع الورم ومعالجته إلى درجة ما من موت الخلايا الجانبية، إما بسبب الأضرار قصيرة الأجل الناجمة عن الاضطراب الميكانيكي/الأنزيمي، أو عدم التوافق على المدى الطويل بين السكان الفرعيين وظروف الثقافة المختارة. على الرغم من فائدة ثقافة التناوب كفصل كبير أولي ، يتم نقل الخلايا الميتة أو المحتضرة لا محالة مع مجموعات PDX ويمكن أن تؤثر على الثقافة الناتجة. هذه الخلايا الميتة غالباً ما تكون خلايا PDX الفردية التي لم يتم دمجها في كتلة، الماوس الخلايا الليفية الليفية الليفية الضمائية التي لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف الثقافة المحددة، أو خلايا بطانة الرحم الهشة بشكل خاص. ويمكن لهذه الخلايا المحتضرة أن تؤثر على النتائج التجريبية من "الناجين" ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياس الكمي، على سبيل المثال، عن طريق مقايسات فحص قابلية البقاء القائمة على الصور الفلورية. لتحسين اختيار خلايا PDX الحية من هذه الطريقة، قمنا بتكييف طرق الطرد المركزي مع خطوات الكثافة لإزالة الخلايا الميتة /المحتضرة الفردية بسهولة من مخاليط PDX والاحتفاظ بمجموعات متعددة الخلايا حية في الغالب.
لتعزيز دراسة الناتجة PDX المستمدة من المجموعات في الثقافة 3D، استخدمنا منصة ثقافة الضخ microfluidics القائم على، OrganoPlate (الشكل 1)، وهو جهاز عالية الإنتاجية على رقاقة منصة تسمح للثقافة في وقت واحد تصل إلى 96 الفردية الم perfused ، 3D الثقافات على 384 جيدا microtiter لوحة القاعدة(الشكل 1A)7،8. في لوحة microfluidic 2 حارة، يتم توصيل شريحة نسيج واحد من قبل اثنين من القنوات microfluidic(الشكل 1B، هلام قناة: الأحمر، قناة التسريب: الأزرق) التي تمتد أربعة آبار في صف واحد. يتم فصل القناتين microfluidic من قبل سلسلة من البلاستيك قصيرة تسمى Phaseguide الذي يمنع تجاوز قناة واحدة في قناة جارتها المجاورة ، ويسمح في وقت واحد لواجهة خالية من الغشاء بين محتويات هلام و perfusion قناة9. لأن الجزء السفلي من لوحة microfluidic يتكون من الزجاج المجهر الصف، يمكن الاطلاع على الثقافات في نافذة المراقبة من خلال الجزء السفلي من لوحة مع مجهر قياسي أو الآلي. يتم تأسيس Perfusion في لوحة microfluidic مع الروك برمجة، وذلك باستخدام الجاذبية لدفع وسائل الإعلام من خلال قنوات microfluidic، بين آبار الخزان (الشكل 1C). يحاكي تدفق القذف بشكل أدق يلخص البيئة الدقيقة للورم من الثقافة الساكنة ، مما يسمح بدمج إجهاد القص وتعزيز توزيع الغازات والمواد المغذية. وقد سبق وصف فوائد الحفاظ على ثقافة الخلايا السرطانية الم PERFUSED في لوحة microfluidic كما أظهرت الثقافات سرطان الثدي perfused القدرة على البقاء الأمثل بالمقارنة مع ثقافة 3D ثابت من نفس الخلايا7.
ويصف هذا التقرير طريقة للانفروج المركزي للكثافة المكيفة لعزل مجموعات PDX الحية متعددة الخلايا، ويبين فائدتها في إنشاء ثقافات PDX ثلاثية الأبعاد داخل ألواح الفلورويديك القابلة للانحلال. ونظرًا لأن عددًا متزايدًا من مختبرات الأبحاث يبحث عن طرق لتسهيل استخدام PDX ، فإننا نتوقع أن تكون البروتوكولات المعروضة هنا ذات فائدة فورية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على أنسجة الورم بموافقة المريض ووفقا لبروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمد (IRB). تم زرع Xenografts ، ونمت ، وحصد وفقا لاتفاقية رعاية الحيوان المؤسسية المقبولة واستخدامها (IACUC) بروتوكول.
ملاحظة: كل العمل هو أن يتم تنفيذها في مجلس الوزراء سلامة البيولوجية المعقمة للحفاظ على العقم. وينبغي إجراء جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد مواد لمعالجة PDX
- ملقط الأوتوكلاف ومشرط مقبض أو شفرات الحلاقة.
- ذوبان محلول انزيم الانفصام عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في درجة حرارة الغرفة في نفس اليوم الذي ينفصل فيه النسيج.
ملاحظة: لا ينصح ذوبان في 37 درجة مئوية، لأن هذا يمكن أن تعطيل بعض الانزيمات الانفصام. - إعداد ما لا يقل عن 100 مل من PDX ثقافة المتوسطة (Dulbecco المعدلة النسر المتوسطة المغذيات خليط F-12 [DMEM-F12] مع 100 U/mL البنسلين وstreptomycin و 30٪ مصل الأبقار الجنين [FBS])، وعلى الأقل 25 مل من PDX معالجة المتوسطة (DMEM-F12 مع 100 U/mL البنسلين وstreptomycin وليس FBS). يُخزن عند 4 درجة مئوية حتى يصبح جاهزاً للاستخدام.
2. PDX تفكك وتنقية الأولية من المكون stromal
- جمع الأواني autoclaved، 70 مصافي الخلايا μm (2−3)، 60 ملم أطباق زراعة الأنسجة المستديرة (2)، 6-جيدا لوحات الأنسجة، عقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية، والملوحة المعقمة 1x الفوسفات المخزنة (PBS). ثقافة دافئة متوسطة إلى 37 درجة مئوية والسماح للتفكك محلول انزيم أنزيم أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
- عندما يصل قطر أنسجة PDX إلى 1.0−1.5 سم في مضيف الماوس، قم بإزالة الورم جراحيًا من الماوس بالوسائل القياسية (على سبيل المثال، تحت التخدير المقبول) وتخزينه على الثلج في أنبوب 50 مل مع وسط ثقافة PDX(الشكل 2A). معالجة الأنسجة على الفور، عن طريق الخطوات أدناه، لتعظيم صلاحية الخلية، ويفضل أن يكون داخل 1-2 ساعة بعد الحصاد.
- نقل أنسجة الورم إلى أنبوب مخروطي وزنها قبل وزنها 50 مل. شطف 6x مع 30 مل من برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم والملوثات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل و وزن أنسجة الورم.
- نقل أنسجة الورم إلى 60 ملم حول طبق زراعة الأنسجة و mince إلى ~ 1 مم3 قطع باستخدام شفرة حلاقة معقمة أو مشرط.
- إضافة 5 مل من PDX تجهيز المتوسطة لجمع الطين الورم ونقلها إلى أنبوب جديد معقم 50 مل. شطف طبق الثقافة مع آخر 5 مل من PDX معالجة المتوسطة، ثم مع حل انزيم الانفصام (10 مل / غرام الورم، على الأقل 5 مل)، مضيفا جميع يشطف إلى أنبوب 50 مل.
- احتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. دوامة الأنبوب بلطف في منتصف الطريق من خلال وقت الحضانة.
- الماصات صعودا وهبوطا بلطف مع ماصة المصلية لتفريق كتل. خلايا تصفية مع مصفاة خلية 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب جديد معقم 50 مل.
ملاحظة: قد يكون من الضروري أكثر من مصفاة واحدة. - جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق إلى خلايا بيليه. إزالة فائقة و resuspend في 2-3 مل من وسط ثقافة PDX. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا التلقائي.
- استخدم الجدول 1 لتقدير العدد المطلوب من الخلايا المشتقة من PDX المنفصلة اللازمة لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة لكل شريحة.
ملاحظة: القيم في الجدول 1 المقصود أن تكون نقطة بداية. وسوف تختلف القيم الفعلية بسبب صلاحية الأنسجة / الخلية وفقدان الخلية من تجميد / الانتعاش. الأورام PDX هي الأفراد حتى داخل نوع معين من السرطان لذلك ينبغي تعديل هذه القيم تجريبيا. - من العدد المحسوب في الخطوة 2.9، لوحة 1-2 × 106 الخلايا في 5 مل من PDX ثقافة المتوسطة لكل بئر من 6-بئر النسيج لوحة. احتضان (37 درجة مئوية، 5٪ CO2،95٪ الرطوبة) لمدة 48 ساعة مع اهتزاز لطيف (50-55 دورة في الدقيقة) لتعزيز تشكيل الكتلة(الشكل 2B). بعد تشكيل المجموعة، انتقل إلى القسم 3 للطرد المركزي.
- Cryopreserve غير المستخدمة خلايا PDX من تفكك الأولي في 50٪ FBS + 40٪ DMEM-F12 + 10٪ ثنائي الفينيل سلفوكسيد (DMSO) أو خلية الأولية المتاحة تجاريا تجميد المتوسطة.
ملاحظة: يمكن أيضاً استعادة الخلايا الوماتية الماوس من سطح لوحة الأنسجة، إذا رغبت في ذلك، عن طريق الشطف لفترة وجيزة مع متوسطة الثقافة والتوسع بالوسائل القياسية. - لاستخدام لاحق من خلايا الورم PDX cryopreserved / الماوس ستروما, تذوب الخلايا في حمام مائي 37 °C لمدة 2 دقيقة. عد وطبقة في لوحة ثقافة الأنسجة 6-جيدا كما هو موضح في الخطوة 2.10 قبل الشروع في القسم 3. زيادة عدد خلايا PDX بنسبة ~ 20٪ لاستيعاب الخسائر القابلة للتطبيق من الحفظ بالتبريد.
3. الكثافة التدرج على أساس الطرد المركزي فصل من الكتل المشتقة من PDX من الخلايا الفردية
- إعداد 20 مل من 100٪ حل التدرج الكثافة عن طريق خلط دقيق 18 مل من حل الطاردة المركزية الانحدار الكثافة مع 2 مل من محلول الملح المتوازن 10x هانكس العقيمة (HBSS) في أنبوب مخروطي معقم 50 مل. جعل 10 مل كل من 20٪، 30٪، 40٪، و 55٪ حلول التدرج الكثافة من خلال تخفيف هذا الحل 100٪ مع HBSS 1x العقيمة وخلط جيدا.
ملاحظة: وحدات التخزين هذه كافية لتدرجين 15 مل التي يمكن استخدامها لفصل ~ 15 × 106 الخلايا لكل منهما. إذا كان يفصل أقل من ~ 15 × 106 الخلايا، يجب استخدام التدرج الثاني كتوازن للطرد المركزي. - إضافة 3 مل من 55٪ محلول التدرج كثافة إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 مل. عقد الأنبوب في زاوية، طبقة بلطف جدا 3 مل من 40٪ حل التدرج كثافة على رأس طبقة 55٪، وصرف ببطء السائل على الجانب الزاوية من الأنبوب لتجنب خلط الطبقات. كرر مع حل التدرج الكثافة 30٪ .
- جمع فائقة من الثقافات دوران PDX مع ماصة المصلية 5 مل، سطح لوحة الشطف بلطف. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة إلى خلايا بيليه.
- إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من 20% حل التدرج الكثافة وفقا لعدد من التدرجات اللازمة لفصل الخلايا. طبقة بعناية 20% كثافة حل التدرج مع الخلايا على الجزء العلوي من التدرج (ق). إذا كان استخدام أنبوب واحد فقط لتدرج الخلايا، أعلى أنبوب التدرج التوازن مع خلية خالية من 20% حل التدرج الكثافة.
- اِكْفَ الأنابيب والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دوار دلو أرجوحة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، 2000 x g،و0 فرامل.
- بعد الطرد المركزي، وسوف تكون الكسور مرئية(الشكل 2C). جمع 2−3 مل من الكسور في أنابيب 15 مل الطازجة. إضافة 3−4 مجلدات من 1x HBSS معقمة لكل كسر وعكس لخلط دقيق.
- جهاز طرد مركزي في 1000 س ز لمدة 3 دقائق إلى خلايا بيليه. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1−2 مل من PDX متوسطة المعالجة.
ملاحظة: عادة ما توجد مجموعات خلايا PDX القابلة للتطبيق في واجهة حل التدرج الكثافة 40-55%(الشكل 2D)مع خلايا وحيدة ميتة/ميتة تتراكم في واجهة حل التدرج الكثافة 20-40% لمعظم PDXs التي تم اختبارها. - إزالة صغيرة, ممثل aliquot (50-100 μL) لإعادة تفكك مع حجم مساو من محلول انزيم الانفصام لتقييم رقم الخلية في نظام التعليق خلية متفاوتة المسافات. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي.
4. Hydrogel إعداد وبذات microfluidic بذر
- إعادة تشكيل ها هيدروجيل الحلول (THIOL المعدلة HA، ها-SH؛ ثيول التفاعلية البولي ايثيلين جلايكول دياكريلات، PEGDA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولتر من HBSS إلى جميع الآبار في أعمدة نافذة المراقبة (العمود 3، 7، 11، 15، 19، 23) من لوحة ميكروفلويدية 2 حارة للحفاظ على الرطوبة الثقافة وظروف التصوير الأمثل.
- حساب حجم تعليق الخلية من القسم 3 اللازمة ل50 ميكرولتر من الهيدروجيل في كثافة الخلية المطلوبة (أي، 5000 خلية / μL). لبذات واحد microfluidic لوحة، aliquot الحجم المحسوب في كل من 4 أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 مل معقم.
ملاحظة: ها هيدروجيلس لديهم وقت ثابت للجلات. ضبط حجم aliquots حل هلام لكفاءة المستخدم في الاستغناء إذا يحدث الجيل المبكر. - اضبط درجة حُس الحل HA-SH إلى 8.0 مع 1 N NaOH قبل الاستخدام مباشرة. إجراء اختبار هلام عن طريق خلط 40 ميكرولتر من HA-SH مع 10 ميكرولتر من PEGDA ورصد هلام مع مرور الوقت. يبدأ الجيلي عادةً 5−8 دقائق بعد خلط HA-SH مع ال crosslinker PEGDA.
- اسكوت تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة (200 × ز، درجة حرارة الغرفة) لخلايا بيليه. قم بإزالة الخلايا فائقة النيا والخلايا ذات الحفّاب في الحجم المناسب لـ HA-SH.
ملاحظة: الهيدروجيل النهائي هو حل HA-SH:PEGDA 4:1 (حسب الحجم) بحيث يجب إعادة اعتماد الخلايا في 40 ميكرولتر من HA-SH للحصول على حجم نهائي 50 ميكرولتر. - إضافة 10 μL من PEGDA إلى aliquot واحد من الخلايا في HA. تخلط جيدا وانتظر 1−3 دقيقة (اعتمادا على الوقت هلام من الخطوة 4.4) قبل البذر لوحة microfluidic.
ملاحظة: السماح لرد فعل الجلات من بداية قبل البذر يساعد على تقليل تسوية الخلية. - ضع نصيحة للاستغناء عن وحدات تخزين 1.5 ميكرولتر إلى قناة واحدة تكرر ماصة وتحميلها مع الخلايا في حل هيدروجيل HA. تذكر أن تبقي على aliquot هيدروجيل مختلطة جيدا لضمان توزيع الخلايا حتى.
- لذرية لوحة microfluidic، محاذاة تلميح ماصة عمودي على لوحة في حين وضع بلطف تلميح في وسط مدخل هلام (الأعمدة 1، 5، 9، 13، 17، 21) لضمان الاتصال ولكن لا ضغط عند الاستغناء عن حل هيدروجيل. تعمل بسرعة لمنع التجمد الهيدروجيل المبكر، الاستغناء 1.5 ميكرولتر من محلول هلام في كل مدخل هلام.
- مراقبة حالة التعبئة للقنوات microfluidic من خلال عرض من أعلى لوحة، أسفل لوحة، أو عن طريق المجهر، وتقييم التحميل، وذلك باستخدام الشكل 3 كدليل (تحميل ناجحة في الشكل 3A، pipet تحديد المواقع التوجيه في الشكل 3B، غاب التحميل في الشكل 3C، لا شغلها إلى نهاية في الشكل 3D، تجاوز في الشكل 3E). تحديد أية تعديلات ضرورية في التقنية التي قد تحسن نجاح التعبئة للجولة التالية من الرقائق (راجع مناقشة لنصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها).
- كرر الخطوات 4.6−4.9 مع 3 بقية من 3 aliquots من الخلايا في حل HA. عكس لوحة أثناء إعداد aliquot المقبل (~ 1 دقيقة).
ملاحظة: إن مدة الانتظار لمدة دقيقة وانعكاس اللوحة يؤديان إلى تحسين التوزيع ثلاثي الأبعاد للخلايا عن طريق تقليل استقرار الخلية عند حدوث الجل. - بعد ملء جميع الرقائق، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب حتى يتم الانتهاء من هلام (~ 45 دقيقة).
- باستخدام دليل المقدمة، وضمان تركيب الروك perfusion في حاضنة ثقافة الخلية مع إعدادات التسريب الصحيح (14 درجة زاوية، 4 فترات دقيقة).
- أضف 50 ميكرولتر من ثقافة PDX متوسطة لجميع المداخل المتوسطة (الأعمدة 2، 6، 10، 14، 18، 22) وتحقق مما إذا كانت القنوات قد ملأت بشكل صحيح عن طريق قلب اللوحة. اضغط بلطف على اللوحة مقابل السطح لتشجيع السائل على ملء القنوات microfluidic.
- أضف 50 ميكرولتر من DMEM-F12 (10% FBS) لجميع منافذ البيع المتوسطة (العمود 4، 8، 12، 16، 20، 24). إذا كانت أي فقاعات الهواء محاصرين في قناة الضخ، إزالة عن طريق النقر بلطف على لوحة على سطح.
- باستخدام المجهر وشكل لوحة تخطيط(الشكل التكميلي 1)،سجل رقاقة ملء النجاح. استبعاد الرقائق المعبأة بشكل غير صحيح من الاستخدام التجريبي الإضافي.
- ضع لوحة على الروك إمالة تعيين إلى 14 درجة إمالة ودورة 4 دقائق لبدء perfusion. استبدال PDX المتوسطة ثقافة كل 2 أيام (أول 50 ميكرولتر في مدخل، ثم 50 ميكرولتر في منفذ).
5. تلطيخ الخلية، والتصوير، وكمية الصورة
- إعداد حل الخلية قابلية البقاء فحص تحتوي على ثلاثة الأصباغ الفلورية (Hoechst 33342، ethidium homodimer-1، calcein acetoxymethyl [صباحا]).
- تحضير حلول الأسهم من كل صبغة على النحو التالي: Hoechst 33342 في 1.6 mM (1 ملغ /مليلتر) في المياه الأيونية؛ calcein AM عند 4 mM في DMSO اللامائية؛ ethidium هوممير-1 في 2 mM في DMSO / H2O (1:4، v/v).
ملاحظة: يتم توفير حلول الأسهم calcein AM و ethidium homodimer-1 في مجموعة لوازم في جدول المواد. - إعداد حل عمل واحد في HBSS أو الفينول الحمراء الخالية من المتوسطة، التي تحتوي على جميع الأصباغ الثلاثة. تحسين التركيز النهائي للعمل لكل نوع خلية ومصفوفة، ضمن نطاقات 1.6−8.0 ميكرومتر لـ Hoechst 33342 و0.1−10 ميكرومتر لـ calcein AM و0.1−10 ميكرومتر للـ ethidium homodimer-1.
- تحضير حلول الأسهم من كل صبغة على النحو التالي: Hoechst 33342 في 1.6 mM (1 ملغ /مليلتر) في المياه الأيونية؛ calcein AM عند 4 mM في DMSO اللامائية؛ ethidium هوممير-1 في 2 mM في DMSO / H2O (1:4، v/v).
- إزالة المتوسطة الثقافة وتطبيق حل صبغة قابلة للتطبيق للعمل على رقائق microfluidic المطلوب (75 ميكرولتر في مدخل، 25 ميكرولتر في منفذ) ووضع مرة أخرى على الروك perfusion في ح ح ثقافة الخلية.
- صورة نوافذ المراقبة من الثقافات الملون باستخدام دليل أو المجهر confocal الآلي(جدول المواد)مع مرشحات الفلورسنت (المدرجة على أنها استثارة / موجات الانبعاثات، في نانومتر) لمراقبة جميع النوى (Hoechst 33342، 350/461)، نوى الخلايا الميتة (الإتوديمر المتجانس-1، 528/617)، والخلايا الحية سيتوبلازم (calcein AM، 494/517).
- التقط 140 ميكرومتراً من Z-المكدسات بحجم خطوة ≤1 ميكرومتر باستخدام هدف هواء 20x. هناك حاجة إلى ثلاثة مجالات للعرض لتصوير القناة الدقيقة بأكملها مع قدر صغير من التداخل. لتجنب أخذ العينات المزدوجة، صورة حقلين فقط من عرض لكل رقاقة.
ملاحظة: يجب تحسين ظروف التصوير لضمان أخذ عينات Nyquist المناسبة. في تجربة المؤلفين ، نظام التصوير السريع ، الذي يعتمد إما على فك الاستئصال لمصدر الفلورية الشعاعية التقليدية أو وضع المسح بالرنين على الدمج ، ضروريًا لفحص كامل لـ Z-stack ، مع ثلاثة ألوان ليزر ، عبر 96 رقائق على طبق في غضون فترة زمنية معقولة (حوالي 3.5 ساعة مع التصوير الآلي ، بما في ذلك الإعداد). - باستخدام برنامج تحليل الصور، قم بتحليل صور Z-stack للبيانات الكمية المطلوبة، مثل التشكل أو حالة التجميع أو الميزات الأخرى. لقياس جدوى الخلية، عد عدد الخلايا الميتة (الحمراء) والنوى الخلية الإجمالية (الأزرق).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إعداد الروك perfusion للبرمجة في حاضنة ثقافة الخلية المياه جاكيد القياسية، وتم إعداد لوحات microfluidic اثنين حارة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية القياسية للتحميل (الشكل 1). تم توسيع ورم PDX MDA-PCA-118b في الجسم الحي، وحصد عندما كان قد وصل إلى أقصى حجم، وفك كما هو موضح في قسم البروتوكول 2 لإنشاء تعليق الطين من الخلايا، في حالة خلية واحدة تقريبا (الشكل 2A). تم الاستغناء عن الطين في 6-جيدا لوحات الأنسجة، ووضعها على الدوار XY كما هو موضح، لمدة 48 ساعة. الماوس ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نحن وصف طريقة لمعالجة واستزراع خلايا الورم القابلة للحياة PDX المستمدة في نظام ثقافة 3D عالية الإنتاجية. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم أنسجة PCa PDX ، فهو فعال بنفس القدر للأورام الأخرى المشتقة من الظهارية. تختلف خصائص الورم بين خطوط PDX الفردية حتى داخل نفس النسيج الأصلي (البروستاتا والثدي وما إلى ذلك). بعض خطوط PCa PDX هي أكثر ليفية ويصعب عزل الخلايا القابلة للحياة من بينما البعض الآخر أكثر خلوية. يمكن أن يختلف حجم الورم المشار إليه هنا ضمن إرشادات IACUC لتوفير المزيد من الأنسجة للأورام منخفضة الغلة بشكل خاص. بال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الوطنية للسرطان المرحلة الأولى SBIR (HHSN26120700015C) وP01CA098912.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1N هيدروكسيد الصوديوم | أي زراعة أنسجة مناسبة من الدرجة | ||
| 60 مم أطباق | المستديرة أي | ||
| لوحات مناسبة لزراعة الأنسجة ذات 6 آبار أي | |||
| 70 وميكرو مناسبة ؛ مصافي الخلايا m | Corning | 431751 | أو ما يعادلها |
| أجهزة الطرد المركزي | Eppendorf | 5810R مع دوار ودلاء مناسبة لأنابيب الطرد المركزي المخروطية 15/50 مل | أو ما يعادلها |
| من محلول الطرد المركزي المتدرج للكثافة | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | تفكك مناسب بدرجة ثقافة الأنسجة | ||
| تقنيات الخلايا الجذعية | 07921 | ACCUMAX | |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | أو ما يعادلها |
| ملقط | |||
| مجموعة هيدروجيل HA | ESI BIO | GS311 | HyStem (حمض الهيالورونيك-SH و PEGDA) |
| محلول الملح المتوازن هانكس | لونزا | 10-527F | أو ما يعادلها |
| معطل بالحرارة مصل الأبقار الجنيني | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| مقياس الدم | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | أو ما يعادله |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | أو ما يعادله |
| برنامج معالجة الصور | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | أو ما يعادله |
| مجموعة قابلية / سمية الخلايا الحية / الميتة (Calcein-AM / Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | أو ما يعادلها |
| من لوحة ثقافة الموائع الدقيقة | Mimetas | 9603-400-B | مجهر OrganoPlate ثنائي المسار |
| Nikon | A1R | أو ما يعادلها | |
| من ماصة | Eppendorf | 3125000036 | أو ما يعادلها |
| من أنسجة | الورم المشتقة من PDXتم الحصول عليها بموجب موافقة IRB للأنسجة البشرية وموافقة IACUC للمضيف الحيواني | ||
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | أو ما يعادلها |
| من الروك | Perfusion Mimetas | OrganoPlate Perfusioner شرائط الأس | |
| (درجة الحموضة 5-9) | أي | ||
| محلول ملحي مناسب مخزن بالفوسفات | Lonza | 17-516F | أو ما يعادله |
| شفرات الحلاقة | أي مناسبة | ||
| الدوارة xy-shaker | VWR | Advanced 3500 شاكر | المداري أو مشرط |
| مكافئ التعامل | أحادية القناة | ||
| مناسبة Eppendorf | 22260201 | ||
| معقمة ، 15 مل أنابيب | الشكل أي معقمة | ||
| مناسبة ، 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | أي مناسبة |
المراجع
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856(2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66(2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431(2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
