يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

7.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60914

⸱

يونيو 14, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Virology, Ulm University Medical Center, 2CNRS UMR-8601, Centre Interdisciplinaire Chimie Biologie, 3Team Chemistry & Biology, Modeling & Immunology for Therapy, Université Paris Descartes, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, 5Pediatric Otolaryngology Department, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Université de Paris, Institut Cochin

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة بسهولة وتربية الخلايا أحادية النوى tonsillaar من البشر الأصحاء التي تخضع لعملية استئصال اللوزتين الجراحية الجزئية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية.

الملخص

دراسة الخلايا المعزولة من الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) يسمح فهم استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية، لأنها يمكن أن نموذج التفاعلات المضيف الممرض في الأنسجة. في حين أن الخلايا المعزولة المستمدة من الأنسجة كانت أول نموذج لثقافة الخلية ، فقد تم إهمال استخدامها لأن الأنسجة قد يكون من الصعب الحصول عليها. في هذا البروتوكول، ونحن شرح كيفية معالجة وتربية الخلايا أحادية النوى اللوزتين بسهولة (TMCs) من اللوزتين البشرية السليمة لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية عند التنشيط، وتقليد العدوى الفيروسية في الأنسجة المخاطية. إن عزل اللجان عبر الأراضي المُمَرَكَة من اللوزتين سريع، لأن اللوزتين بالكاد تحتويان على ظهارة وتُسفر عن مليارات من جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية. هذه الطريقة تسمح بالكشف عن إنتاج السيتوكين باستخدام عدة تقنيات، بما في ذلك immunoassays، qPCR، المجهر، تدفق cytometry، الخ. ، على غرار استخدام الخلايا أحادية النوى الطرفية (PBMCs) من الدم. وعلاوة على ذلك، تبدي الشركات عبر الأراضي عبر الوطنية حساسية أكبر لاختبار المخدرات من تلك التي تبديها شركات PBMCs، التي ينبغي النظر فيها من أجل إجراء اختبارات السمية في المستقبل. وهكذا، فإن ثقافات شركات TMCs التي تعمل في الجسم الحي هي نموذج مخاطي سهل وسهل الوصول إليه.

المقدمة

وتقتصر الدراسات على الأعضاء البشرية بسبب إمكانية الوصول إلى المعلومات، فضلا عن أسباب أخلاقية واضحة. ومع ذلك ، فهي ضرورية لفهم تعقيد البيولوجيا البشرية بشكل كامل. ثقافات الخلايا المعزولة (الثقافات الأولية أو خطوط الخلايا) هي نظام قياسي في دراسات بيولوجيا الخلايا بسبب توافرها. في حين أن الثقافات الخلية المعزولة سمحت باكتشافات بارزة ، فإن استخدام خطوط الخلايا قد جاء عند التدقيق الدقيق لأنها لا تحاكي تمامًا بيولوجيا الجهاز الحي. ومع ذلك ، فإن ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد أو الأنسجة explants معقدة للغاية4،5،6. في الواقع ، قطعة من الأنسجة أو الجهاز هيطروجينية للغاية لأن تكوينها الخلوي يختلف اعتمادًا على التعريب في الأنسجة. وهكذا، فإن استخدام كتل الأنسجة يتطلب تحليل العديد من النسخ المتماثلة التقنية والبيولوجية، مما يؤدي إلى حاجة عدد كبير من المتبرعين أو المرضى.

الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (MALT) مشابهة هيكلياً للغدد الليمفاوية ولكن لها وظائف فريدة من نوعها، لأن دورها الرئيسي هو تنظيم المناعة المخاطية7. على عكس الغدد الليمفاوية، والتي تقع عادة على مسافة ما من الأنسجة، وتقع الشعير عادة مباشرة تحت ظهارة الأنسجة المخاطية. من الناحية النسيجية ، تتكون بشكل رئيسي من تركيزات عالية من الخلايا B و T ، ولكن أيضًا الخلايا التي تقدم المستضد مثل الضامة والخلايا التكجرية. الشعير تشكل حوالي 50٪ من الأنسجة اللمفاوية في جسم الإنسان. وتنقسم الشعير إلى تسع مجموعات اعتمادا على موقعها: غالت (القناة الهضمية- ) ، BALT (bronchus-) ، NALT (الأنف - ) ، CALT (الملتحمة) ، LALT (الحنجرة - ) ، SALT (الجلد - ) ، VALT (vulvo-) ، O -MALT (منظمة) ، ود - مالت (منتشر). و O-MALT يتكون أساسا من اللوزتين من خاتم لوزتيلار والداير وهو الأكثر سهولة MALT8,9. في الواقع، اللوزتين الموجودة في البلعوم تشكل الحاجز الرئيسي لحماية الجهاز الهضمي والجهاز التنفسي من (المحتملة) الكائنات الحية الدقيقة الغازية10. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية اللوزتين من قبل ظهارة حرشفية غير كيراتينية طبقية ، مدعومة بكبسولة من النسيج الضام تحتوي على الأوعية الدموية والأعصاب واللمفية ، مما يوفر سهولة الوصول إلى الخلايا المناعية11،12. وعلاوة على ذلك، استئصال اللوزتين، وهو الفعل الجراحي لإزالة اللوزتين، هو إجراء شائع يتم إجراؤه على الأطفال الذين يعانون من اضطراب في التنفس، مما يجعل اللوزتين نسيجًا متاحًا بسهولة13 في البيئات الفسيولوجية.

اللوزتين تسمح بدراسة استجابة الخلايا المناعية في الأمراض التي تنطوي على مناعة المخاطية. في الواقع، في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، لأن اللوزتين تتكون من تركيز عال من الخلايا المناعية، فهي الهدف الرئيسي للتكاثر الفيروسي ولكن أيضا إنتاج كمية كبيرة من السيتوكينات التي لم يتم الكشف عنها في الدورة الدموية14،15. في الولايات ثابتة, نادرة السّكان من فطريّة مثل خلايا حاضرة في مختلفة نسيج مخاطيّ, بما في ذلك اللوزتين, غير أنّ أساسيّا غائبة من دم.

وهكذا، فإن الخلايا أحادية النواة من اللوزتين هي نموذج أكثر أهمية وتعقيداً من الخلايا PBMCs ويمكن أن تجيب على أسئلة أكثر عمقاً. من ناحية أخرى، يمكن استخدام explants الأنسجة تكون معقدة وغير ذات الصلة دائما إلى الدراسات المناعية الفطرية. وهكذا، أنشأنا نموذجا لدراسة تنشيط المناعة المخاطية باستخدام TMCs16. ونصف هنا طريقة لعزل الشركات عبر الأراضي الممَعَرَفَة بشكل فعّال عن اللوزتين البشريتين الطازجتين. هذه الطريقة تسمح باستعادة عدد كبير من الخلايا المناعية مع الحفاظ على سلامتها للدراسات في الجسم الحي السابق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لا يتم جمع العينات خصيصا لأغراض البحث ولا تعتبر الدراسة الغازية. ومع ذلك، جمع اللوزتين البشرية يتطلب موافقة أخلاقية من قبل السلطات المحلية ذات الصلة. في حالتنا، تمت الموافقة عليها من قبل لجنة حماية الأشخاص (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847). وعلاوة على ذلك، يطلب موافقة كل مريض أو ممثل قانوني للحصول على البيانات الشخصية للمانحين (مثل الجنس، والعمر، وتاريخ الإصابة بالحنجرة) التي يمكن أن تساعد في تفسير النتائج التجريبية.

1. التعامل مع الأنسجة لوزتيلار الإنسان

  1. وضع اللوزتين من كل متبرع في قارورة واحدة معقمة 50 مل تحتوي على 25 مل PBS 1x ونقل في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى المختبر وفقا لتوصيات الهيئة (استخدام ثلاثة مستويات من الحماية: قارورة، صندوق أمان، وكيس).
    ملاحظة: وينبغي إجراء العملية بأكملها في مختبر من المستوى البيولوجي للسلامة 2. وينبغي التعامل مع جميع العينات البشرية بعناية لأنها لم تكن مؤهلة من قبل، وقد تحتوي على عوامل معدية.
  2. تنظيف جميع الأدوات في بين كل استخدام.
    1. بعد الاستخدام، تفكيك مصفاة الخلية والحفاظ على جميع الأدوات الأخرى (مثل، الحشرات، ملقط) في حمام يحتوي على محلول المنظفات (1/10 حجم المنظفات في H2O) بين عشية وضحاها.
    2. فرشاة كل أواني لإزالة الأنسجة وغسلها بالماء واضحة.
    3. جفف جميع الأجزاء بشكل جيد ، ثم أعد مصفاة الخلايا (85 مل ، قطر 37 مم) عن طريق وضع شبكة صلبة 60 شبكة فوق شبكة صلبة 10 شبكة وإغلاق الحلقة بإحكام.
    4. ضع جميع الأدوات في أكياس معقمة والأوتوكلاف.

2. تشريح الأنسجة اللوزتين البشرية وعزل الخلايا أحادية النوى Tonsillaar (TMCs)

  1. ضع مصفاة الخلايا على طبق استزراع الخلايا 150 × 25 مم2 (SPL150) وجميع الأدوات في SPL150 أخرى لإبقائها عقيمة.
  2. نقل اللوزتين من القارورة إلى مصفاة الخلية باستخدام ملقط معقمة. يصب أيضا في كل من برنامج تلفزيوني، الذي يحتوي على بعض الخلايا التي قد الخروج اللوزتين. إذا لزم الأمر ، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني لتزج الشبكة.
    ملاحظة: وينبغي أن تكون مغمورة الأنسجة في جميع الأوقات لتجنب جفاف.
  3. إزالة الكي، والأنسجة الدموية، والليفية باستخدام ملقط ومشرط.
    ملاحظة: اللوزتين إزالتها من الأطفال لا تحتاج هذه الخطوة.
  4. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة من أقل من 0.5 سم في القطر باستخدام مشرط وملاقط المنحنية. قطع جميع الأنسجة بحيث يمكن أن تكون مغمورة قطع صغيرة في جميع الأوقات.
  5. وضع بضع قطع من الأنسجة في مصفاة الخلية وكشط لهم على الشبكة مع آفة الزجاج حتى طبقة رقيقة حقا فقط من السترما الأبيض يبقى. إزالة والتخلص من stroma لتجنب انسداد الشبكة.
  6. مرة واحدة وقد تم ضغط جميع الأنسجة من خلال الشبكة، واستخدام ماصة 10 مل لنقل كل تعليق الخلية على الشبكة وكشط مرة أخيرة.
  7. نقل تعليق الخلية مع ماصة 10 مل في قارورة معقمة. غسل الشبكة ومصفاة الخلية مع برنامج تلفزيوني 1x. دع تعليق الخلية يستريح لمدة 5 دقائق في RT على مقاعد البدلاء. هذه الخطوة تسمح لهطول الأمطار وتكتل من بقايا ستروما، والخلايا الميتة، وأي الدنا صدر، وسوف تسهل الخطوة التالية.
  8. ضع منخلًا معقمة 70 ميكرومترًا فوق قارورة جديدة سعة 50 مل (أزيلي بعناية من المغلف) ونقل تعليق الخلية بلطف عليه مع ماصة 10 مل. لا تخلط التعليق، لأن بيليه موجود في كثير من الأحيان. إذا تم انسداد المنخل، استخدم الجزء الخلفي من طرف ماصة 1 مل عقيمة لخدش الخلايا الحوض الصغير منخل. تغيير منخل كلما لزم الأمر.
  9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  10. تجاهل افراط و resuspend بيليه عن طريق خلط بلطف القارورة، ثم إعادة تعليق الخلايا في 35 مل من برنامج تلفزيوني.
  11. في قارورة جديدة، ضع منخلًا جديدًا 70 ميكرومترًا على القمة ونقل تعليق الخلية عليه مع ماصة 10 مل. إذا كان منخل مسدوداً، استخدم التقنية المفصلة في الخطوة 2.7.

3- عزل الشركات عبر الأراضي الممْرَكَة بتدرج كثافة الخلايا

ملاحظة: ويمكن استخدام هذه الشركات بعد الخطوة 2-10. ومع ذلك، للحصول على حل خلية أوضح وإزالة غيرها من حطام الخلية وأي خلايا حمراء، ينصح بإجراء عزل تدرج كثافة الخلية من الخلايا أحادية النوى.

  1. إضافة 15 مل من متوسط الكثافة التدرج (د = 1.076 ز / مل) في قارورة جديدة 50 مل. صب حل TMCs على أعلى متوسطة التدرج الكثافة، مع الحرص على تقليل خلط التعليق مع متوسط التدرج الكثافة.
  2. الطرد المركزي الحل في 1000 س ز لمدة 30 دقيقة في RT مع تسارع وانقطع.
  3. إزالة مع ماصة 10 مل وتجاهل الطبقة العليا (التي تحتوي على معظمها PBS 1x) دون إزعاج الواجهة بين TMCs والكثافة الانحدار المتوسطة.
    ملاحظة: تحتوي TMCs على عدد قليل من كريات الدم الحمراء، وبالتالي فإن الحل واضح. وهكذا، يمكن أن يكون من الصعب تصور التفاعل بين حل TMCs في برنامج تلفزيوني ومتوسط تدرج الكثافة. وبناء على ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا في RPMI 1640 تكملها 20 M HEPES (بدون FBS) قبل أن يتم تنفيذ تدرج الكثافة.
  4. إزالة TMCs مع تلميح ماص معقمة 1 مل والميصة مكان في قارورة جديدة 50 مل.
  5. غسل الخلايا عن طريق إضافة 50 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 2٪ من مصل الأبقار الجنين (FBS) و 2 mM EDTA والطرد المركزي الأنبوب في 250 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الصفائح الدموية المتبقية.
  6. كرر الخطوة 3.5، ولكن الطرد المركزي الأنبوب في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. إعداد المتوسطة الثقافة (R10) من خلال استكمال RPMI 1640 مع 10٪ مع تنشيط الحرارة FBS، 2 M L-الجلوتامين، والمحلول المضاد الحيوي (100 U/mL البنسليوم و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
  8. إعادة تعليق TMCs في 10 مل من R10 وفرز الخلايا. وفي المتوسط، تنتج هذه التقنية 5 × 108-2 × 109 TMCs لكل زوج من اللوزتين. ويمكن الآن استخدام الخلايا لتحقيقات مثل PBMCs من الدم كله (على سبيل المثال، تنقية نوع الخلية المحددة، والخلايا، والخلايا الخلوية، والارتشاء- qPCR، والتجميد، الخ).
  9. إذا لزم الأمر، قم بتجميد الخلايا لاستخدامها باستخدام تقنيات قياسية لتجميد الخلايا الأساسية.
    1. حساب عدد الخلايا.
    2. الطرد المركزي الخلايا وإزالة المنازع. قم بحل بيليه في ما يكفي من 100٪ FBS لتركيز النهائي من 1 × 108 خلايا / مل، ثم إضافة نفس الحجم من 80٪ FBS + 20٪ DMSO الحل. الخلايا ستكون بعد ذلك في 5 × 107 خلايا / مل. وينبغي أن يتم هذه الخطوة في 4 درجة مئوية و FBS وDDSO الحل ينبغي أن تبقى عند 4 درجة مئوية قبل استخدام.
    3. توزيع 1 مل من حل الخلية في الأنابيب المبردة ووضعها في وعاء التجميد البطيء الذي كان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسيطرة على معدل تجميد الخلايا. وضعه في -80 درجة مئوية.
    4. لإذابة الخلايا، ضع cry في حمام دافئ في 37 درجة مئوية لبضع ثوان مع الانفعالات المستمرة. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الذوبان، نقلها إلى 49 مل من R10 والطرد المركزي لإزالة DMSO. عد الخلايا واستخدامها كـ PBMCs.
      ملاحظة: وعلى الرغم من أن تجميد وذوبان الجليد في هذه اللجان سيزيلان الأنقاض، فإن ذلك سيلحق الضرر أيضاً ببعض أنواع الخلايا النادرة. إذا كانت الكتل أو الحطام موجود بعد الذوبان ، فمن الأفضل تمرير تعليق الخلية من خلال منخل عقيم 70 ميكرومتر قبل استخدامه.

4- فيينوتيبينغ من TMCs حسب قياس تدفق الدراجات

  1. استرداد 5 × 106 خلايا من الحل السابق لكل لوحة خليط الأجسام المضادة التي تحتاج إلى اختبار ووضع في أنبوب 5 مل cytometry. استرداد 1 × 106 خلايا لعنصر التحكم غير المُطَرَّد.
  2. اغسل الخلايا في PBS والطرد المركزي عند 400 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. Resuspend لهم في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (1 × 106 الخلايا / مل) واحتضان مع وصمة عار قابلة للحياة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
  3. إضافة 5 μL الحرارة المعطلة الإنسان AB مصل لكل 100 μL من تعليق الخلية واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
  4. اغسل الخلايا في PBS + 2٪ FBS + 2 mM EDTA (غسيل العازلة) والطرد المركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
  5. إعادة إنشاء TMCs في 500 ميكرولتر من الغسيل العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة على النحو المفصل في الجدول 1. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام.
  6. اغسل الخلايا في عازلة الغسل والطرد المركزي عند 400 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إعادة إنشاء TMCs في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.5٪ من ما قبل الفورمالدهيد (PFA). تبقى في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى الحصول عن طريق تدفق cytometry.
    ملاحظة: PFA خطرة. استخدم حلًا تجاريًا جاهزًا للاستخدام لإعداد حل PFA بنسبة 0.5٪ .
جسماستنساخفلووتشرومالشركه
يعيش الميتBV405ثيرموستر العلمية
CD3SP34-2V500BD فارمجن
CD8SK1أميسانBD فارمجن
CD8BW135/80VioBlueميلتيني بيوتيك
CD4RPA-T4PE-Cy7BD فارمجن
CD45HI30PerCP-cy5.5دينار بحريني
CD19HD237النماء في مرحلة الطفولة المبكرةبيكمان كولتر
CD202H7أليكسا فلور 700BD فارمجن
CD14M5E2PE-cy7BD فارمجن
CD14M5E2ApcBD فارمجن
CD163G8APC-H7BD فارمجن
CD56MEM188PeBD فارمجن
CD1237G3PeBD فارمجن
BDCA-1L161أزرق المحيط الهادئBD فارمجن
BDCA-3AD5-14H12FITCميلتيني بيوتيك
BDCA-4AD5-17F6Apcميلتيني بيوتيك
HLA-DRG646-6PerCP-cy5.5BD فارمجن
CD11c3.9أليكسا فلور 700العلوم الحيوية

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة لتوصيف الخلية حسب قياس التدفق الخلوي.

5- مثال على تفعيل الشركات عبر الإقليمية وقياس إنتاج السيتوكين

  1. تخفيف TMCs في R10 المتوسطة للحصول على تركيز 2 × 106 خلايا / مل.
  2. توزيع 400,000 TMCs في 200 ميكرولتر من R10 في 96 بئر أسفل لوحة مستديرة.
  3. لتنشيط الخلايا، إضافة 5 ميكروغرام / مل من TLR7/8 ناهض resiquimod (R848) بين عشية وضحاها.
  4. أجهزة الطرد المركزي لوحات واسترداد الشركات عبر الفلورية 'سوبرفنت وتجميده لمزيد من التحليل. وسيتم تقييم إنتاج السيتوكين باستخدام مناعة قائمة على الخرز لتحديد عدد السيتوكينات القابلة للذوبان في وقت واحد باستخدام مقياس تدفق cytometer بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  5. تقييم جدوى الخلايا باستخدام قياس الخلية مضيئة البقاء بعد بروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، إضافة 60 ميكرولتر من حل صلاحية الخلية إلى الآبار وقياس الإنارة في غضون 10 دقيقة (اقتناء لمدة 1 s/well).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن أولاً وصفنا الملامح المناعية للخلايا الموجودة في الثقافة و حللنا كمية TMCs. نحن فينوتاد TMCs من اللوزتين مع عملية استئصال cytometry التدفق. كما هو مبين في الشكل 1، كانت تمثل جميع أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في PBMCs من الدم في TMCs من اللوزتين. بيد أن تواتر جميع أنواع الخلايا في البلدان عبر المدى، باستثناء الخلايا باء، كان أقل منه في مراكز عمل الشركات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اللوزتين البشرية تمثل نموذج فيزيولوجي السابقين فيزيولوجية لدراسة الاستجابات المناعية الفطرية في واجهة المخاطية، لأنها تحاكي دور الجهاز اللمفاوي الثانوي. ومن المثير للاهتمام أن التركيب الخلوي للبلدان عبر التخصصات الإقليمية يشبه مراكز PBMCs ويشمل جميع مجموعات الخلايا الرئيسية، على الرغم من أن نسبتها المئوية يمكن أن تكون مختلفة عن PBMCs من الدم(الشكل 1). ويمكن أيضاً العثور على مجموعات سكانية إضافية، حيث أن جميع الاستجابات المناعية تبدأ في الأنسجة (الغشاء المخاطي أو الأعضاء اللمفاوية الثانوية) و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل الوكالة الوطنية لمراقبة التنمية في منطقة سيدا وهرهبات ANRS (J-P. ح) للتجارب وN.B. زمالة (AAP 2017 166). تعترف N.S. بالدعم المقدم من ANRS للحصول على الزمالة (AAP 2016 1)، والمنظمة الأوروبية لبيولوجيا الجزيئية EMBO للزمالة (LT 834 2017)، وبرنامج تمويل الشركات الناشئة "باوشتاين" من كلية الطب في جامعة أولم (LSBN.0147) وDFG دويتشه Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 شبكات شبكة فولاذية - 1910 & مايكرو ؛ مDutscher198586لوضع في مصفاة الخلية Cellector
60 شبكة فولاذية شبكية - 230 & mDutscher198591لوضع مصفاة الخلية Cellector
70 & micro; م مصافي خلايا ClearLine بيضاءDutscher141379C
Anios Excell D منظفDutscher59852
محلول مضاد حيوي منظف ، 100xThermo Fisher15140122100 U / mL Penicilium و 100 مو ؛ جم / مل ستربتومايسين - لإضافة إلى وسائط الثقافة
BD FalconTM أنابيب القاع المستديرة ، 5 ملBD Biosciences352063أنابيب FACS
مصفاة خلية Cellector ، 85 مل وقطر 37 ممDutscher198585
CellTiter-Glo (CTG) مقايسة جدوى الخلايا المضيئةPromegaG7572المركزي لفحص الجدوى
5810 REppendorf
أنابيب مخروطية Falcon 50 ملDutscher352070
ملاقط منحنيةDutscher711200
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD2650
محلول ملحي مخزن للفوسفات من Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
EnVisionPerkinElmerيقيس اللمعان
مصل الأبقار الجنينية (FBS)للإضافة إلى وسائط الاستزراع
الأجسام المضادة للملصقات الفلوريةانظر الجدول 1
PestleDutscher198599
Hepes (1 M)Thermo Fisher15630056استخدم في
مولار لوحة الاستجابة البشرية لمكافحة الفيروساتBioLegend740390المقايسة المناعية القائمة على الخرزة
LymphoprepStemCell7801التدرج
الكثافة Mr. Frosty containerThermo Fisher5100-0001حاوية التجميد البطيئة
بيرس 16٪ الفورمالديهايد (وزن / حجم) ، خالي من الميثانولThermo Fisher28908
Resiquimod (R848)ناهض
InvivoGen tlrl-r848 TLR7 / 8RPMI-1640 طبقمتوسط Sigma-AldrichR8758
SPL ، 150 مم × 25 مم (SPL150)Dutscher330009
شفرة جراحية معقمة N & deg ؛ 23Dutscher132523
UltraComp eBeads تعويض الخرزThermo Fisher01-2222-41
UltraPure 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0ThermoFisher 15575020لعمل عازلة غسيل في PBS
جهاز الطرد Glass حاضنة 20 ملي متوسط ثقافة الخلايا

المراجع

  1. Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
  2. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  3. Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
  4. Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
  5. Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
  6. Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013(2018).
  7. Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687(2006).
  8. Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
  9. Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
  10. Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
  11. Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
  12. Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
  13. Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
  14. Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
  15. Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
  16. Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019(2019).
  17. Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678(2013).
  18. Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
  19. Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
  20. Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.