مقالة منهجية

باستخدام متعدد الطبقات Hydrogel Bioink في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لتوزيع الخلايا المتجانسة

DOI:

10.3791/60920

⸱

مايو 2, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, 3Center for Medical Research and Innovation, Shanghai Pudong Hospital, Fudan University Pudong Medical Center, 4Institutes of Biomedical Sciences and Department of Systems Biology for Medicine, Shanghai Medical College, Fudan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، وضعنا استراتيجية معدلة متعددة الطبقات جديدة للبيوين السائل الشبيه (الجيلاتين ميثاكريلويل مع لزوجة منخفضة) لمنع ترسب الخلايا المغلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال عملية البثق ثلاثي الأبعاد، يمكن للبيوينكات الشبيهة بالسائل ذات اللزوجة المنخفضة حماية الخلايا من تلف الغشاء الناجم عن إجهاد القص وتحسين بقاء الخلايا المغلفة. غير أن الترسيب السريع للخلايا التي تحركها الجاذبية في الخزان يمكن أن يؤدي إلى توزيع الخلايا غير المتجذّر في الهياكل المطبوعة بيولوجياً، وبالتالي يعوق تطبيق البيوين السائلة الشبيهة بالسائل. هنا، وضعنا استراتيجية معدلة متعددة الطبقات جديدة للبيوين السائل مثل (على سبيل المثال، الجيلاتين الميثاكريل مع اللزوجة المنخفضة) لمنع ترسب الخلايا المغلفة. تم التلاعب بالواجهات السائلة المتعددة في البيوفينك متعدد الطبقات لتوفير الاحتفاظ بين الوجهين. ونتيجة لذلك، فإن عمل ترسيب الخلايا الذي يمر عبر الطبقات المجاورة في النظام متعدد الطبقات كان متخلفاً في خزان بيوينك. ووجد أن الاحتفاظ بين الوجهين أعلى بكثير من السحب الرسوبي للخلايا، مما يدل على الدور الحاسم للاستبقاء بين الوجهين في منع ترسب الخلايا وتعزيز تشتت أكثر تجانساً للخلايا في البيوين المتعدد الطبقات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثلاثي الأبعاد (3D) الطباعة البيولوجية كانت طريقة واعدة لتصنيع النسخ المتماثلة المعمارية والوظيفية المعقدة من الأنسجة الأصلية في الطب الحيوي والتجدد1،2،3. الاستراتيجيات المشتركة للطباعة الحيوية ، بما في ذلك النافثة للحبر ، والبثق ، والطباعة stereolithography ، لديها إيجابيات وسلبيات من وجهات نظر مختلفة4. ومن بين هذه التقنيات، يتم استخدام إجراء البثق الأكثر شيوعًا بسبب فعاليته من حيث التكلفة. Bioink يلعب دورا رئيسيا في استقرار عملية البثق البيولوجية. وينبغي أن bioink الخلية محملة مثالية لا يكون فقط مواكبا بيولوجيا ولكن أيضا أن تكون مناسبة للخصائص الميكانيكية5. وعادة ما يتم تقديم Bioinks مع انخفاض اللزوجة على أنها حالة تشبه السائل. ويمكن أن تكون هذه bioinks بسهولة وبسرعة المودعة وتجنب تلف غشاء الخلية الناجمة عن ارتفاع الإجهاد القص أثناء البثق. ومع ذلك ، في الحالات المعقدة التي تتطلب فترات الطباعة الطويلة الأجل ، فإن انخفاض اللزوجة غالبا ما يؤدي إلى الترسيب الحتمي للخلايا المغلفة في خزان bioink ، والذي عادة ما تحركه الجاذبية ويؤدي إلى تشتت الخلايا غير المتهوّن في bioink6،7. وبالتالي، bioink مع تشتت الخلايا غير متجانسة يعوق في المختبر الحيوي بناء الأنسجة الوظيفية.

وقد أفادت عدة دراسات حديثة تركز على الأحياء الحيوية تعزيز التشتت المتجانس للخلايا المغلفة. وقد استخدم في البثق البيولوجي8من البثق البينات المعدلة على أساس الربط المتقاطع المزدوج. تم تعديل البوليمر alginate مع الببتيدات والبروتينات في هذه الدراسة. قدمت الخلايا توزيعًا أكثر تجانسًا في هذا الجينات المعدلة مما كانت عليه في الجينات الشائعة الاستخدام بسبب مواقع المرفقات التي توفرها الببتيدات والبروتينات. وبدلاً من ذلك، تم استخدام البيوينك المخلوطة لحل ترسبات الخلايا في بيوينك. تم استخدام بيوينك المخلوطة التي تحتوي على البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والجيلاتين أو الجيلاتين ميثاكريلوفيل (GelMA) مع تحسين متانة الميكانيكية في دراسة أخرى9. وقدمت الخلايا المغلفة توزيعا متجانسا أساسا لأن لزوجة بيونك المخلوطة قد تحسنت. بشكل عام ، هناك عدة عوامل تؤثر على تشتت الخلايا المغلفة في bioink ، مثل لزوجة بيوينك ، وجاذبية الخلايا ، وكثافة الخلايا ، ومدة فترة العمل. ومن بين هذه العوامل، تلعب جاذبية الخلايا دوراً حاسماً في تعزيز الترسيب. وقد تم التحقيق في الطفو والاحتكاك التي تقدمها bioink لزجة باعتبارها القوى الرئيسية ضد الجاذبية حتى الآن10.

هنا، وضعنا استراتيجية جديدة لتعزيز التشتت متجانسة للخلايا المغلفة في bioink عن طريق التلاعب واجهات سائلة متعددة في خزان بيوينك. هذه الواجهات السائلة التي تم إنشاؤها بواسطة التعديل متعدد الطبقات من bioink لا يمكن أن توفر فقط الاحتفاظ بين الوجهين ، مما يؤخر ترسب الخلايا ، ولكن أيضا الحفاظ على التوافق الحيوي والسلوك الريولوجي مناسب من bioink. في الممارسة العملية، قمنا بتعديل محلول GelMA مائي (5٪، ث / الخامس) مع الليفي الحرير (SF) بطريقة متعددة الطبقات لإنتاج طوليا أربعة واجهات، وتوفير التوترات بين الوجهين في bioink المخلوطة. ونتيجة لذلك، تم تعويض تحميل الجاذبية على الخلايا من خلال التوتر بين الوجهين من صنع الإنسان، وتم الحصول على تشتت متجانس تقريبا للخلايا المغلفة في بيوينك بسبب انخفاض الترسيب عبر الطبقات المجاورة من الخلايا. ولم يبلغ حتى الآن عن أي بروتوكول مماثل لإبطاء ترسب الخلايا المغلفة عن طريق التلاعب في الاحتفاظ بالتشوهات في البيوinkس السائلة. نقدم بروتوكولنا هنا لنوضح طريقة جديدة لحل ترسب الخلايا في الطباعة الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلية محملة SF-GelMA

  1. تعقيم جميع المواد باستخدام 0.22 وحدات تصفية حقنة μm. تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  2. دافئ 1X PBS إلى 50 درجة مئوية، ويذوب الجيلاتين في 1X PBS ساخنة مع اثارة. وينبغي أن يكون التركيز النهائي من الجيلاتين في برنامج تلفزيوني 10٪ (ث / الخامس).
  3. إضافة anhydride الميثاكريليك في الحل الجيلاتين (نسبة الوزن من أنهيدريد الميثاكريليك إلى الجيلاتين من 0.6 إلى 1) ببطء مع اثارة، وخلط المجمع لمدة 1 ساعة على الأقل (50 درجة مئوية). عادة, إعداد 200 مل من 10% حل الجيلاتين مع 12 غرام من أنهيدريد الميثاكريليك; يعتمد الحجم على احتياجات الدراسة.
  4. نقل الحل المختلط الذي يحتوي على الجيلاتين والميثاكريليك أنهيدريد إلى أنبوب معقم 50 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي الحل المختلط في 3500 x ز. وعادة ما يستغرق 3-5 دقيقة للحصول على طبقتين. جمع الطبقة العليا (GelMA) وتجاهل الطبقة السفلى (غير المكرر أنهيدريد methacrylic).
  6. تخفيف حل الطبقة العليا التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.5 مع مجلدين من المياه غير المؤينة (40-50 درجة مئوية).
  7. Dialyze الحل التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.6 مع 12-14 كيلو ادا الوزن الجزيئي قطع غشاء غسيل الكلى ضد المياه deionized لمدة 5-7 أيام (40-50 درجة مئوية). تغيير الماء مرتين كل يوم.
  8. جمع وتجميد الحل GelMA في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  9. Lyophilize حل GelMA لمدة 3-5 أيام في مجفف التجميد مع درجة الحرارة تعيين إلى -45 درجة مئوية والضغط تعيين إلى 0.2 mbar.
  10. حل جيلما المتحللة (درجة الاستبدال من حوالي 75٪) في 1x PBS تحتوي على 10٪ FBS (مصل البقر الجنينية، v/v)، 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulfonic acid)، وضوئي (0.5٪، ث/الخامس) للحصول على إعداد جيلما بيوينك.
    ملاحظة: يمكن حساب درجة استبدال جيلما عن طريق مقايسة ninhydrin3.
  11. مزيج الحل GelMA (10٪ ، ث / الخامس) مع أحجام مختلفة من حل SF الأولي (5 ٪ ، ث / الخامس) وأحجام مختلفة من 1x PBS للحصول على بيونكس SF - GelMA مع تركيزات مختلفة من SF. نسبة لكل 1 مل من GelMA و SF حل في bioinks مختلفة معروضة في الجدول 1.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع البيوink على تركيز نهائي بنسبة 5٪ (ث/ الخامس) GelMA ، ولكن تركيز SF يختلف: 0.5 ، 0.75 ، 1.0 ، 1.25 ، و 1.5 ٪ (ث / الخامس) في الكائنات الحيوية SF-GelMA المختلفة. استخدام SF-M-طبقات-جيلما على سبيل المدى Bioink GelMA المعدلة مع SF بطريقة طبقة من طبقة. استخدام SF-X-GelMA لمصطلح تلك GelMA المعدلة مع SF بطريقة متجانسة (على سبيل المثال، جيلما مع تعديل 1٪ SF كان يسمى SF-1-GelMA).
  12. سونيكات جميع bioinks لمدة 10-20 دقيقة.
  13. تنمو خلايا NIH3T3 باستخدام DMEM (Dulbecco معدلة النسر المتوسطة) التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستربتوميسين في حاضنة (37 درجة مئوية مع 5٪ CO2). مرور الخلايا بنسبة 1:3 عندما تصل الكثافة إلى 80٪.
  14. الطرد المركزي تعليق NIH3T3 الخلايا في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إزالة فائق مع شفط وإعادة بيليه الخلية مع محلول بيوينك الطازجة في أنبوب معقم 15 مل.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الخلايا المغلفة في بيوينك 1 × 106 خلايا/مل، ويجب حساب التركيز باستخدام مقياس الخلايا.
  15. استخدام 2 مل من مختلف البيوتين SF-GelMA لتعليق الكريات الخلية للحصول على مختلف bioinks محملة بالخلايا.

2. تحميل وإعادة تسخينها والطباعة الحيوية من SF-M-طبقات-جيلما

  1. تحميل 0.4 مل من الخلية محملة SF-0.5-جيلما في الطبقة السفلى من الحقنة.
    ملاحظة: استخدام حقنة 2 مل كما خزان بيوينك في هذه الدراسة. تحميل مختلف SF-GelMA bioinks في حقنة بطريقة طبقة على مستوى الطبقة.
  2. وضع الحقنة في حمام الماء المثلج (0 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق للتسبب في bioink الطبقة السفلية للتحول إلى حالة هلام.
  3. تحميل 0.4 مل من الخلية محملة SF-0.75-جيلما bioink فوق الطبقة السفلى.
  4. ضع الحقنة مع طبقتين من bioinks في حمام الماء المثلج (0 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لتتسبب في تحويل طبقتين من bioinks إلى حالة هلام.
  5. دورة خطوات التحميل والتبريد 3 مرات أخرى مع الأنواع المتبقية 3 من bioinks (SF-1-GelMA، SF-1.25-جيلما، SF-1.5-GelMA) للحصول على نظام بيوينك متعدد الطبقات مع تركيزات مختلفة من SF في طبقات مختلفة. يجب أن يكون حجم المستخدمة لتحميل جميع bioinks 0.4 مل.
  6. إعادة تسخين الحيوية متعددة الطبقات عن طريق وضع الحقنة في حاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة قبل الطباعة الحيوية.
  7. استخدام حقنة 2 مل كما خزان bioink مع فوهة الطباعة 27 ز. تعيين سرعة تدفق في 50 ميكرولتر / دقيقة، وسرعة الحركة من فوهة في 2 ملم / الثانية، وارتفاع فوهة في 1 ملم. تنفيذ إجراء الطباعة الحيوية في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية).
    1. طباعة بناء الأنسجة بطريقة البثق باستخدام الطابع الحيوي حسب الطلب تحت المعلمات تكييفها من دراساتنا السابقة11،12.
  8. استخدام الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 800 ميغاواط) لمدة 40 s ل crosslink بناء الأنسجة المطبوعة بيولوجيا.
  9. ثقافة بناء الأنسجة عبر الصلصال في DMEM (متوسطة النسر المعدلة في دولبيككو) التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستربتوميسين في حاضنة (37 درجة مئوية مع 5٪ CO2). تم تغيير الوسيلة كل 8 ساعات خلال أول 2 أيام وكل 2-3 أيام بعد ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويظهر في الشكل 1مخطط لإعداد bioinks محملة بالخلايا. بعد إعداد مختلف bioinks، تم تنفيذ التحميل، وإعادة التسخين والطباعة الحيوية (الشكل 2). لتقييم توزيع الخلايا المغلفة في خزان بيوينك، تم إجراء عملية الطباعة الحيوية باستخدام ثلاثة بيونكات مختلفة محملة بالخلايا في ثلاث لوحات 96-آبار(الشكل 3A). وقد استخدمت مجموعتين من التحكم (جيلما البكر وSF-1-GelMA bioinks) والمجموعة التجريبية (SF-M-Layered-GelMA bioink) للتحقيق في تشتت الخلايا المغلفة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استقرار النظام متعدد الطبقات هو نقطة رئيسية لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. قمنا نظرياً بحساب انتشار جزيئات SF في محلول GelMA بناءً على دراسة نعمان13. ووجد أن انتشار البروتينات في الحل يرتبط بوزنها الجزيئي. متوسط الوزن الجزيئي (MW) من الألبومين المصل البقري (BSA) هو 66.5 كيلو Da، ومعامل انتشاره هو 64-72 ميكرومتر2/s. ويبلغ متوسط الـ MW من الفيبرينوجين 339.7 كيلو Da، ويبلغ معامل انتشاره 23-34 ميكرومتر2/s. متوسط MW من جزيئات SF في دراستنا هو ما يقرب من 100 كيلو Da. استناداً إلى نتا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81771971، 81970442، 81703470 و81570422)، برنامج البحث والتطوير الوطني الرئيسي في الصين (2018YFC1005002)، لجنة العلوم والتكنولوجيا لبلدية شنغهاي (17 مشروع JC1400200، مشروع شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (منحة رقم 2017SHZZX01)، ولجنة التعليم البلدي في شنغهاي (برنامج الابتكار 2017-01-07 -00-07-E00027).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-هيدروكسي -4 & برايم ؛ - (2-هيدروكسي إيثوكسي) -2-ميثيل بروبيوفينون (PI2959) TCIM64BK-QD
4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES)جيبكو15630080
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط (DMEM)جيبكو10569044
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو10091
الجيلاتينسيجما ألدريتشV900863MSDS
أنهيدريد ميثاكريليك (MA)سيجما ألدريتش276685MSDS
البنسلين & ndash ؛ المضادات الحيوية الستربتومايسينجيبكو15140163
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو10010049
سيلك فيبروينمتقدم BioMatrix5154

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
  2. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510(2019).
  3. Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  4. Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
  5. Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  6. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
  7. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
  8. Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
  9. Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
  10. Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
  11. Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
  12. Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).
  13. Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة