تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي

ملخص

في هذا البروتوكول، نصف إجراءات التحليل النوعي والكمي للأنماط الظاهرية التنموية لدى الفئران المرتبطة بعيوب القلب الخلقية.

الملخص

عيوب القلب الخلقية (CHD) هي النوع الأكثر شيوعًا من العيوب الخلقية في البشر ، مما يؤثر على ما يصل إلى 1٪ من جميع المواليد الأحياء. ومع ذلك، لا تزال الأسباب الكامنة وراء CHD غير مفهومة بشكل جيد. الفأر النامية يشكل نموذجا قيما لدراسة CHD، وذلك لأن برامج النمو القلبي بين الفئران والبشر يتم الحفاظ عليها بدرجة عالية. يصف البروتوكول بالتفصيل كيفية إنتاج أجنة الفئران من مرحلة الحمل المطلوبة ، وأساليب لعزل والحفاظ على القلب للمعالجة النهائية ، والأساليب الكمية لتحديد الأنواع الشائعة من CHD حسب الأنسجة (على سبيل المثال ، الحاجز البطيني العيوب، وعيوب الحاجز الأذيني، وبراءة اختراع القناة الشريانية)، وطرق قياس الهيمتولوجيا الكمية لقياس الأنماط الظاهرية الشائعة للضغط العضلي. توضح هذه الأساليب جميع الخطوات التي ينطوي عليها إعداد العينات وجمعها وتحليلها ، مما يسمح للعلماء بقياس CHD بشكل صحيح ومستنسخ.

المقدمة

CHDs هي النوع الأكثر شيوعا من العيوب الخلقية في البشر وهي السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالعيوب الخلقية^1،2،3،4، 5^،6. على الرغم من أن حوالي 90٪ من الأطفال حديثي الولادة البقاء على قيد الحياة CHD، فإنه يرتبط في كثير من الأحيان مع المراضة كبيرة والتدخلات الطبية على مر السنين، وفرض عبء ثقيل على حياة المرضى ونظام الرعاية الصحية^7،8،9،10. خارج العوامل الوراثية البحتة ، وأسباب CHD غير مفهومة بشكل جيد^4. أسباب مجهولة تمثل ~ 56-66٪ من جميع الحالات CHD وفقا لجمعية القلب الأمريكية وغيرها من المصادر^2،3،4،11. وتشمل العوامل المعروفة الطفرات الوراثية، CNVs، دي نوفو المتغيرات النيوكليوتيدات واحد، وaneuploidy. ويشتبه في أن العوامل البيئية والغذائية هي أيضا مصادر هامة تساهم في CHD، كما اقترحت الدراسات الوبائية التي تربط بين نمط الحياة^{الأمومي2،12،}الحرمان الاقتصادي، والعرق^13،وعن طريق البحث في العوامل الغذائية مثل حمض الفوليك^11،14 وحمض الريتينويك الدهون النشطة بيولوجيا^15،16. التحقيق في آليات وأسباب CHD وغيرها من عيوب القلب والأوعية الدموية من المهم وضع استراتيجيات وقائية وخيارات علاجية جديدة^{1،4،17،18،19.}

الفأر النامية هو نموذج حجر الزاوية لدراسة CHD في الثدييات. ومع ذلك، فإن بعض الأساليب والتحليلات المستخدمة، مثل تشريح الحفاظ على مورفولوجيا القلب، وتحليل مراحل النمو، وتحديد العيوب المرتبطة بـ CHD، يمكن أن تكون شاقة للعلماء الجدد في تحليل قلوب المورين. والهدف من الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول هو تقديم مبادئ توجيهية نوعية وكمية لهذه العمليات. وهكذا ، في هذا البروتوكول نشرح كيفية إجراء التزاوج في الوقت المناسب لإنتاج أجنة من مرحلة الحمل المطلوبة ، وتشريح الإناث الحوامل لاستعادة القلب سليمة (بما في ذلك الأنسجة المرتبطة بها مثل القناة الخارج) ، وتثبيت القلب والاستعداد ل أقسام ة الكبوتورستات، وطرق الأنسجة الأساسية، والتحليلات الكمية لعيوب القلب الشائعة، والتحليل النوعي لضغط عضلة القلب، وهو النمط الظاهري السلائف الشائعة لبعض أنواع CHD.

البروتوكول

تم علاج جميع الحيوانات المستخدمة في التجارب المشار إليها في هذه الورقة باستخدام المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من جامعة ولاية ميشيغان لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية (IACUC).

1. التزاوج في الوقت المناسب من الفئران C57BL6/J لإنتاج الأجنة

1. بمجرد أن تصل الفئران إلى سن التكاثر (6-8 أسابيع) ، وضعها معا في شكل تربية حرام (أي أنثى اثنين لكل ذكر واحد). إعدادها للتكاثر في وقت ما في فترة ما بعد الظهر أو المساء.
   ملاحظة: الفئران غالبا ما تتكاثر في غضون 1 ساعة بعد إطفاء الأنوار داخل مرفق السكن الخاصة بهم. يجب أن تتقاعد الإناث من التربية في حوالي 6-8 أشهر ويجب استخدام الذكور في موعد لا يتجاوز 12 شهرًا من العمر.
2. إذا كان استخدام طريقة الوزن في لتحديد الإخصاب، تولد الفئران في مجموعات كبيرة، لأن طريقة الوزن في يسبب التزاوج توقيت المضي قدما بوتيرة أبطأ من الأساليب التي يتم رصد المقابس الجماع فقط.
3. في صباح اليوم التالي، تحقق من المقابس الجماع في وقت ما بين 8 صباحا-12 م. تأكد من أن يتم ذلك في الأوقات الصحيحة. إذا تم إجراء الفحص المكونات في وقت سابق من 8 صباحا، هناك خطر أن المكونات عميقة جدا في القناة المهبلية التي يمكن ملاحظتها. إذا تم تنفيذ مُقازة المكونات في وقت لاحق من الساعة 12 مساءً، فهناك خطر أن يسقط القابس.
   1. الاستيلاء على الأنثى من قاعدة الذيل والتحقيق في فتح القناة المهبلية مع استخدام تلميح ميكروبيبيت. سوف المكونات الجماع تبدو وكأنها حاجز الغشاء المخاطي(الشكل 1A)،والتي قد يكون من الصعب قليلا أن نرى في بعض الحالات. القشرة أيضا مؤشرا على أن المكونات الجماع هو أو كان موجودا. إذا لم يكن هناك حاجز مخاطي(الشكل 1B)فإن الأنثى على الأرجح لم تزاوج أو أن قابس الجماع قد سقط بالفعل.
   2. الرجوع إلى صباح الجماع كما e0.5.
      ملاحظة: مع الفئران C57BL6/J، يمكن أن يكون من الصعب تحديد المقابس الجماع. لذلك ، في بعض الأحيان تزاوج الفئران على الرغم من عدم ملاحظة أي قابس. لا يؤدي الجماع دائمًا إلى الحمل. هذا هو في كثير من الأحيان أكثر احتمالا في الفئران C57BL6/J. لذلك، راقب تطور الوزن لتأكيد الحمل (انظر الخطوة 1.4). يمكن أن تساعد المؤشرات في تحديد الإناث الحوامل والتأكد من أن المقابس أدت إلى الحمل. توخي الحذر عند التزاوج الإناث ليال متتالية. إذا لوحظ ذكر معين ليكون جيدا في إنتاج المكونات الجماع، يمكن الوثوق بهذا الذكر لرفيقة ليال متتالية مع نفس الأنثى.
   3. نضع في اعتبارنا أن فرص الحمل أعلى مع الفئران التي ثبت مربي، كما أنها قد ولدت بنجاح من قبل. لزيادة فرص وجود مربي ثبت، والذكور المستخدمة لا ينبغي أن تكون قديمة جدا.
4. بعد المكونات المكونات، تزن الإناث. وينبغي متابعة هذا الوزن بعد 7-10 أيام. إذا كان زيادة الوزن يتجاوز 1.73 ز، ثم الماوس هو على الأرجح حامل²⁰. إذا كانت زيادة الوزن أقل من 1.73 غرام، فمن المرجح أن لا علاقة لها بالحمل وينبغي إعادة إدخال الماوس إلى السكان تربية.
   ملاحظة: الفئران C57BL6/J تنتج القمامة الصغيرة (خمسة إلى ستة أجنة في المتوسط). الوزن في طرق لتحديد الحمل دقيقة بالنسبة للغالبية. باستخدام هذه الطريقة يوفر معدل إيجابي خاطئ 12.8٪ وسوف يستبعد 3٪ من الإناث التي هي في الواقع حامل²⁰. إذا كان الباحث قلقًا من أن وقت الحمل المطلوب هو وقت لاحق، فانتقل إلى الخطوة 1.5
5. اختياري: اليوم الذي سيحدث فيه التشريح، تأكد من تقدم الحمل عن طريق الفحص البدني. الاستيلاء على الأنثى من قاعدة الذيل وتمتد الجسم. هذا هو أسهل للقيام عن طريق وضع الماوس على المعصم وسحب بلطف قاعدة الذيل. إذا كانت الأنثى حاملا، ثم سيكون هناك من المرجح زيادة الوزن على وجه التحديد في الجذع السفلي، وسوف تظهر ككتل صغيرة.
   ملاحظة: يمكن أن يكون الحمل واضحًا في وقت مبكر من e12.5 وسيكون واضحًا بواسطة e14.5 في معظم الحالات. C57BL6/J الفئران لديها أحجام القمامة الصغيرة، وبالتالي قد تكون أنثى حاملا حتى لو لم تكن هناك علامات جسدية.

2. تشريح الإناث والأجنة لاستعادة القلب

1. قبل بدء التشريح، قم بإعداد الحلول التالية في درجة حرارة الغرفة.
   1. إذابة حمض الإيثيلينديامينتراستيك (EDTA) في الفوسفات المُلح المُلح (PBS) بتركيز 0.5 م. م.
      ملاحظة: بمجرد إعداده، من الأفضل الاحتفاظ بالحل على الجليد واستخدامه فقط عند 4 درجات مئوية. إذا كان التلوث مصدر قلق ، فيجب أن يكون اوتوكلاف قبل الاستخدام.
   2. حل paraformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني بتركيز 4٪.
      ملاحظة: بمجرد إعداده، من الأفضل الاحتفاظ بالحل على الجليد واستخدامه فقط عند 4 درجات مئوية. تخزينها في 4 درجة مئوية أو أكثر برودة للتخزين على المدى الطويل. تركيز محلول PFA يمكن أن تختلف تبعا للتطبيقات المصب من عينات الأنسجة. وتستخدم هذه النسبة المئوية لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين، والكيمياء المناعية، وتلطيخ الفلورسنت المناعي.
2. بمجرد وصول الأنثى إلى مرحلة الحمل المطلوبة ، يجب أن يكون الماوس في الوقت الصحيح من اليوم وفقًا للمبادئ التوجيهية المعتمدة لاستخدام الحيوان. إذا كان التوقيت في نصف اليوم (على سبيل المثال، e15.5) يجب التضحية به بالقرب من الساعة 12 مساءً. إذا كانت التوقيتات في أيام كاملة (على سبيل المثال، e15.0) فيجب التضحية بها بالقرب من الساعة 12 صباحًا.
   ملاحظة: يفترض أن يحدث الحمل بالقرب من منتصف الليل أثناء الليل يتم إقران الفئران. ومع ذلك ، فمن الصعب تحديد الوقت المحدد للحمل. ونتيجة لذلك، يتم تقدير التوقيت، وليس بالضبط.
3. بعد تثبيت الأطراف الأربعة لأسفل ، قم بعمل شق على شكل حرف I على طول الجذع ، بدءًا من جميع أنحاء مجرى البول حتى نحو القص.
4. من المرجح أن يكون الرحم موجودًا فوق منطقة الحوض مباشرةً. رحم الفأر على شكل حرف Y. لذلك ، من المرجح أن تكون طويلة جدا وملفوفة حول الجذع. إزالته عن طريق رفعه بلطف. القيام بذلك باستخدام الجانبين من ملقط غرامة في حركة السبق. يمكن أن يمسك الأنسجة السطحية من الرحم بعناية فائقة من قبل نصائح من ملقط غرامة عند سحب الرحم في البداية. استخدام مقص لقطع الرحم من الجسم.
   ملاحظة: مع الأخذ في الاعتبار على شكل حرف Y غير عادي من الرحم، تأكد من إزالة الرحم بأكمله.
5. نقع الرحم في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. دبوس واحد نهاية الرحم إلى أسفل وتمتد بها إلى خط واحد.
6. قطع الرحم إلى أقسام، كل قسم يحتوي على جنين منفصل. قشر بلطف خارج الجنين مع ملقط غرامة. هذا هو أسهل للقيام مع زوج من ملقط في كل يد. مرة واحدة إزالتها، ووضع الجنين على الفور في طبق بيتري جديدة مليئة محلول PBS-EDTA في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أيضًا استخدام محلول PBS العادي، ولكن EDTA يمنع التخثر في العينات.
7. مرحلة الأجنة باستخدام Theiler التدريج²¹. لأن التدريج يمكن أن تختلف بين الأجنة داخل القمامة واحدة، مرحلة كل جنين على حدة.
   ملاحظة: يمكن أن يوفر هذا أيضًا التبصر في عيوب القلب الخلقية المحتملة في الأجنة. عادة ، يمكن ملاحظة أعراض عيب القلب الخلقي في مورفولوجيا الجنينية. يمكن أن تكون هناك عيوب رئيسية أخرى غالبًا ما ترتبط بأمراض قلبية معينة.
8. يمكن إزالة القلب بطرق متنوعة اعتمادًا على عمر الجنين.
   ملاحظة: إذا كان من غير الواضح ما إذا كان مسار التدفق الخارجي سيبقى سليمًا أثناء الإزالة أم لا، فإما إزالة أنسجة أكثر من القلب فقط (الحفاظ على مسار التدفق الخارجي سليمًا وتقليل الاتصال المباشر بين القلب والملقط) أو تحليل الجنين بأكمله.
   1. باستخدام نطاق تشريح واثنين من أزواج من ملقط غرامة، ووضع الجنين على ظهره وتثبيت الوصول إلى الصدر. ويمكن القيام بذلك عن طريق تثبيت إما الأسلحة أسفل مع ملقط أو إزالة الأسلحة وعقد الجذع في الموقف.
   2. استخدام نقطة حادة من زوج ثان من ملقط غرامة لجعل شق على طول القص من الجنين وتمتد بين الترقوة إلى السرة. ابدأ بإجراء شقوق دقيقة وسطحية جدًا أثناء العمل تدريجيًا نحو داخل تجويف الصدر. القلب بالكاد يجب أن يصبح مرئياً لا تتصل به مع ملقط خلال هذه الشقوق السطحية.
   3. قشر القفص الصدري مفتوحة باستخدام أول زوج من ملقط للضغط بلطف على جذع الجنين، caudal قليلا إلى القفص الصدري. يجب أن يخرج القلب أو يصبح واضحًا. قد يتطلب القلب بعض الاقناع اللطيف للخروج. استخدام الجانب من ملقط، والتأكد من أن نقطة من ملقط أبدا يأتي في اتصال مع القلب. للحفاظ على مساحة العمل وملقط نظيفة، حافظ على مسح ة خالية من الوبر في مكان قريب.
   4. الاستيلاء بلطف الأوعية الدموية الرئوية مع الجانبين من ملقط، مع التأكد من عدم قطع الأنسجة، وسحب القلب من تجويف الصدر. ثم، تنظيف القلب.
      ملاحظة: بالنسبة للأجنة e13.5 والأصغر سنا يتم تغطية القلب من قبل التامور. يجب إزالة هذا من أجل الوصول إلى القلب.
9. باستخدام منظار مجسم، التقط صورة للقلب للرجوع إليها لاحقًا.
10. شطف القلوب في حل PBS-EDTA لمدة 1-2 دقيقة، ومن ثم وضعها في محلول PFA 4٪ لمدة 45-60 دقيقة تقريبا لإصلاحها. إذا كان من المرغوب فيه تحليل الجنين كله، نقع بين عشية وضحاها. يجب أن يكون حجم محلول PFA 5-6x حجم الأنسجة التي يتم إصلاحها.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة هذا وفقًا للدراسات اللاحقة. يستخدم وقت الحضانة هذا لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين، والكيمياء المناعية، وتلطيخ الفلورسنت المناعي.
11. غسل 5-10 دقيقة مع PBS-الجليسين 3x ووضع مرة أخرى في برنامج تلفزيوني. يمكن أيضًا إضافة أزيد الصوديوم أو البنسلين/الستريبتومسين لتقليل النمو البكتيري والحفاظ على الأنسجة السليمة. يمكن الآن تخزين القلوب على المدى القصير عند 4 درجات مئوية.

3. إعداد الأنسجة

ملاحظة: يمكن إعداد الأنسجة إما باستخدام OCT (درجة حرارة القطع المثلى) تضمين أو تضمين البارافين. هناك مزايا وعيوب لأي من الأسلوبين وينبغي النظر في هدف التحليل عند تحديد طريقة التضمين التي يجب استخدامها.

1. تضمين أكتوبر
   ملاحظة: قد تكون هذه الطريقة أفضل من تضمين الفورمالين/البارافين لأن أقسام التبريد تحافظ على تفاعل المستضد، ولا يزال من الممكن استخدامها لتلطيخ الهيماتوكسيلين والأوسين، وتنتج شرائح بشكل أسرع.
   1. إعداد محلول من السكروز المذاب في برنامج تلفزيوني بتركيز 30٪ (ث / v).
   2. نقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل أو 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على السكروز PBS-30٪. في البداية، سوف تطفو الأنسجة.
   3. وضعه على 4 درجة مئوية في الثلاجة. الأنسجة ستكون جاهزة لتضمين أكتوبر عندما تغرق إلى الجزء السفلي من الأنبوب، وعادة في 24-40 ساعة.
      ملاحظة: تعاني أنسجة العضلات بشكل كبير أثناء دورات التجميد/الذوبان وتفقد مورفولوجيا العضلات الأصلية. يتم امتصاص السكروز من قبل الأنسجة ويعمل كعامل الحفاظ على التبريد الذي يسمح بتحسين الحفاظ على مورفولوجيا. تأكد من وجود ما يكفي من الحلول في الأنبوب لتعويم الأنسجة ليتم مراقبتها بشكل كاف. يتم تلوث السكروز PBS بسهولة مع البكتيريا، لذلك تحقق من المحلول في كثير من الأحيان للغيوم، مما يشير إما فرط الفطرية أو البكتيرية. ولتقليل خطر التلوث إما البنسلين/الستربتوموسين أو يمكن إضافة أزيد الصوديوم إلى محلول PBS-sucrose.
   4. إزالة القلوب مع ماصة باستور، تأكد من فتح ماصة واسعة بما يكفي لعدم المسيل للدموع الأنسجة. قطع ماصة مع مقص إذا لزم الأمر. إذا كنت تعمل مع أجنة كاملة، استخدم الملقط لاسترداد العينة.
      ملاحظة: القيام بذلك بلطف. حتى لو كان فتح ماصة واسعة بما يكفي لاسترداد القلوب، حواف ماصة لا يزال المسيل للدموع الأنسجة. يمكن أن تُستخدم الخلايا الملقطة في عينات الأنسجة البادئة إذا تم استخدامها بقوة شديدة.
   5. السماح لفترة وجيزة للأنسجة لتجفيف الهواء على مسح خالية من الوبر. ضع العينة في قالب OCT في الموضع المطلوب للقطع (أي الترهل والعرضية والإكليلية). إضافة مركب OCT حتى يتم غمر العينة تماما، والتأكد من عدم وجود فقاعات في اتصال مع الأنسجة.
   6. وضع القالب في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو عدة أيام ومن ثم نقل القالب إلى -80 درجة مئوية. بعد 24 ساعة القالب جاهز للاستئصال. يمكن تخزين الأنسجة في هذا التنسيق على المدى الطويل.
2. تضمين البارافين
   1. باستخدام الإيثانول ، وتجفيف الأنسجة في هذا الخلافة: 50 ٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة ، 70 ٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة ، الإيثانول 80 ٪ لمدة 10 دقيقة ، 95 ٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة ، 100 ٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة (القيام بذلك 3x).
   2. نقع الأنسجة في سلسلة من حلول الإيثانول / xylene في هذه الخلافة: 2:1 الإيثانول / محلول xylene لمدة 10-15 دقيقة ، 1:1 محلول الإيثانول / xylene لمدة 10-15 دقيقة ، 1:2 محلول الإيثانول / xylene لمدة 10-15 دقيقة ، 100 ٪ xylene لمدة 10-15 دقيقة (افعل هذا 3x).
   3. لاستبدال الزيلين بالبارافين نقع الأنسجة في فرن فراغ (تعيين بين 54-58 درجة مئوية) في هذا الخلافة: 2:1 محلول xylene/paraffin لمدة 30 دقيقة، 1:1 محلول xylene/paraffin لمدة 30 دقيقة، 1:2 محلول xylene/paraffin لمدة 30 دقيقة، 100٪ البارافين لمدة 1-2 ساعة، 100٪ البارافين لمدة 1-2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: تسخين الأنسجة بعد 60 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن سوف يسبب البوليمرات البارافين إلى تتحلل والأنسجة لتصبح هشة.
   4. باستخدام البارافين الطازج، وتضمين الأنسجة في الموقف المطلوب.

4. أقسام Cryostat للأنسجة المضمنة OCT

1. في cryostat، ضع جميع العينات داخل لمدة لا تقل عن 1 ساعة إذا كانت العينات المخزنة سابقا في الثلاجة -80 درجة مئوية. وينبغي أن يبقوا هناك إلى أن يتم جمع جميع الأقسام.
2. تأكد من تعيين cryostat في إعدادات درجة الحرارة الصحيحة. يجب أن تكون درجة الحرارة البيئية داخل غرفة التبريد عند -20 درجة مئوية وينبغي أن تكون ذراع الكبوستات عند -24 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف درجة الحرارة هذه حسب كيفية استجابة الكتلة للتشريح. إذا كان التقطيع غير متناسقة مشكلة، يمكن تخفيض درجة حرارة البيئة.
3. إزالة كتلة أكتوبر من العفن عن طريق سحب على حواف الجانب المفتوح من القالب لتخفيف ذلك ومن ثم معسر كتلة في نهاية مغلقة، حيث يضيق القالب.
4. لتركيب كتلة أكتوبر، ضع درجة حرارة الغرفة أكتوبر على تشاك، بدءا من الوسط والعمل إلى الحافة. تشاك بأكمله لا يحتاج إلى تغطية.
5. ضع كتلة OCT (انظر الخطوة 3.1) على القالب. يجب أن تكون حافة الكتلة التي كانت ضد الجانب المغلق من القالب تواجه على تشاك. السماح للأكتوبر على تشاك لتجميد حتى يتم الأبيض مبهمة، حوالي 5-10 دقيقة.
6. وضع تشاك على الذراع لمدة 5-10 دقيقة أخرى للكتلة لتأتي إلى درجة حرارة الذراع. للحصول على شريحة متوازية، قم بضبط الذراع حتى تكون حافة الكتلة متوازية مع المرحلة وهناك مسافة متساوية بين المرحلة والحافة السفلية للكتلة هي نفس المرحلة والحافة العليا للكتلة.
7. أدخل النصل وضبط مسافة الكتلة من النصل لأخذ المقاطع.
8. تأخذ شرائح بسماكة 10 ميكرون. الحفاظ على تشريح حتى يتم التوصل إلى نقطة الفائدة إما يدويا أو باستخدام وظيفة تقليم.
9. لجمع الشرائح، استخدم فرشاة طلاء مسطحة صغيرة وفرشاة تفاصيل. عندما يبدأ القالب في القطع ، استخدم الفرشاة المسطحة لسحب الشريحة برفق ضد الوقوف. عند قطع العينة ، يجب أن تكون الحركة مستمرة وبدون توقف ، على الرغم من أن السرعة يمكن أن تعتمد على ثبات العينة.
10. أثناء التقطيع، استخدم الفرشاة المسطحة لتوجيه الشريحة برفق أثناء صنعها. شريحة لا تحتاج إلى أن تكون دافق مع المرحلة في هذه المرحلة، لذلك السماح لها ببلو لا يسبب الدموع أو تسحب وتؤثر على الأنسجة.
    ملاحظة: عند تقطيع الأجنة الكاملة، يمكن أن يكون هذا الجزء صعبًا بشكل خاص، خاصة عند تغيير أنواع الأنسجة. تأكد من أن يتم إجراء شرائح مع أي توقف والفرشاة لا تسحب على شرائح بقوة جدا. عندما تتغير أنواع الأنسجة، يمكن أن تنكسر الشريحة، لذا فإن الحفاظ على برودة درجة الحرارة هو المفتاح. إذا كان كسر هو قضية، وانخفاض درجة الحرارة أو زيادة سمك العينة.
11. وقفة حركة الكتلة مرة واحدة يتم قطع العينة تماما من خلال، ولكن شريحة ليست خالية من كتلة حتى الآن. دون تحريك الفرشاة المسطحة من الشريحة، استخدم فرشاة التفاصيل لربت الشريحة لأسفل لجعلها مسطحة وتجميد ضد المرحلة.
12. عقد شريحة هناك ل ~ 10 ق قبل إزالة فرشاة التفاصيل والانتهاء من شريحة. استخدام فرش الطلاء اثنين لتسطيح بلطف شريحة ضد المرحلة، ومنع أي المتداول، وعقد ضد المرحلة ل ~ 20-30 ق.
13. الوجه شريحة وتتسطح ضد المرحلة مرة أخرى. نقل شريحة مشحونة كهربائيا قريبة بما فيه الكفاية لشريحة ليتم جذبها والالتزام الشريحة دون الحاجة إلى لمس الشريحة إلى المرحلة. تسمية الشرائح بقلم رصاص.
14. تخزين الشرائح في مربع محكم لحماية الأنسجة من تراكم الجليد أثناء التخزين. للتخزين على المدى القصير، يجب تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية قبل تلطيخ. للتخزين على المدى الطويل الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية.

5. microtome المقطع للأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين

1. وضع كتل على الجليد قبل قسمة من أجل تهدئة العينات. عندما تبرد، شرائح البارافين بسهولة أكبر ويمكن أن تنتج شرائح أرق.
2. إعداد حمام الماء 40-45 درجة مئوية باستخدام المياه فائقة النقاء.
3. وضع شفرة في حامل داخل الميكروتومي. تأكد من أنها آمنة ومن ثم تعيين زاوية إزالة. تأكد من أن زاوية التخليص صحيحة. يمكن التحقق من ذلك باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
4. ضع كتلة البارافين في الميكروتومي. تأكد من أنها موجهة بشكل صحيح بحيث النصل سوف قطع مباشرة عبر الكتلة.
5. تأكد من توجيه شفرة بشكل صحيح مع كتلة من خلال جعل بضع شرائح. القيام بذلك بعناية بحيث يمكن إجراء تعديلات.
6. قم بتقليم الكتلة حتى يتم الوصول إلى نقطة الاهتمام.
7. جعل شرائح في سمك المطلوب. خذ في الاعتبار أنه من المحتمل أن يتم التخلص من الشرائح القليلة الأولى.
8. التقاط المقاطع ونقلها إلى حمام الماء باستخدام ملقط. هذا يجب أن يجعل المقاطع تتسطح. استخدام ملقط لضبطها حسب الحاجة.
9. نقل شريحة مشحونة كهربائيا قريبة بما فيه الكفاية لشريحة ليتم جذبها والالتزام الشريحة. تسمية الشرائح بقلم رصاص.
10. ضع جميع الشرائح التي تم جمعها في رف شرائح. السماح للشرائح لتجف بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

6. deparaffinization الأنسجة

1. غسل الشرائح في التسلسل التالي: 3 دقيقة في xylene (2x)، 3 دقيقة في 1:1 xylene/100٪ محلول الإيثانول، 3 دقيقة في الإيثانول 100٪ (2x)، 3 دقيقة في 95٪ الإيثانول، 3 دقيقة في الإيثانول 70٪، 3 دقيقة في الإيثانول 50٪.

7. هيماتوكسيلين وبقع الإيوسين

1. إعداد الشرائح لتلطيخ.
   1. إذا كان استخدام الأنسجة OCT أعدت، نقع في الماء المقطر ل ~ 4 دقيقة حتى يتم حل أكتوبر والسماح الجافة.
   2. إذا كان استخدام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين، يجب أن يكون deparaffinized. انظر الخطوة 6-1.
2. ضع الشريحة في الهيماتوكسيلين المصفى 0.1٪ لمدة 10 دقيقة. ضع الشريحة في الماء المقطر، وتغيير الماء 1x على الفور ثم مرة أخرى بعد 3 دقيقة.
3. ضع الشريحة في eosin 0.5٪ لمدة 10 s أو تراجع 12x. تراجع الشريحة في الماء المقطر حتى الاوسين لم يعد الشرائط، حوالي 2-3 الانخفاضات.
4. تجفيف الشريحة عن طريق نقع في 50٪ من الإيثانول لمدة 10 ث، 75٪ الإيثانول لمدة 10 ث، 95٪ الإيثانول لمدة 30 ث، و 100٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة. تراجع في زيلين حتى xylene يخرج على نحو سلس، ~ 5-7 الانخفاضات.
5. السماح للزيلين لتبخر وتركيب مع وسط تركيب التجفيف السريع الذي يحتوي على مؤشر الانكسار على مقربة من الزجاج.

8. التحليل النوعي لعيوب القلب الشائعة

1. التقاط صور لجميع العينات باستخدام المجهر المقلوب أو ستيريو والكاميرا الخاصة به. التقاط الصور العيانية والمجهرية، اعتمادا على أنواع العيوب التي يجري تحليلها. ويمكن التقاط الصور العيانية مع أي تكبير أقل من 10x. وينبغي أن تؤخذ الصور المجهرية في التكبير 40x أو أعلى. تم التقاط الصور التي تم التقاطها في هذه الورقة مع التكبير 5x باستخدام المجهر ستيريو وهدف الهواء 40x (عدسة N.A. من 0.55) باستخدام المجهر مقلوب.
   ملاحظة: الصور العيانية هي نقطة انطلاق جيدة لأنها توفر وجهة نظر للقلب بأكمله(الشكل 3). ومع تحديد الأنماط، يمكن التركيز على مجالات محددة ومواصلة التحقيق فيها.
2. اصطف كل من الصور جنبا إلى جنب على شاشة الكمبيوتر. لديك كل من الصور من عينات التحكم على جانب واحد من الشاشة وجميع الصور من العينات التجريبية على الجانب الآخر من الشاشة. من الأفضل تحليل مجموعة علاج واحدة في كل مرة.
3. ابحث عن الاختلافات في الأنماط الظاهرية بين مجموعات العلاج، بدءًا من المجالات الرئيسية التي تحدث فيها عيوب القلب الشائعة. وهذا سوف تختلف تبعا لما إذا كانت الصور هي العيانية، والتي تصور التشريح الإجمالي للقلب، أو المجهرية، التي تصور التشريح المجهري لأنسجة القلب.
4. البدء في البحث عن عيوب القلب العيانية الشائعة ، مثل عيوب الحاجز البطيني(الشكل 2A)، وعيوب الحاجز الأذيني(الشكل 2B)، وبراءة اختراع القناة الشريانية(الشكل 2C). وينظر إلى كل هذه العيوب بسهولة في وجهة نظر عرضية للقلب.
5. لتحديد عيوب الحاجز، فكر في النظر إلى شرائح متعددة، لأنها قد تكون ملحوظة في مستوى واحد من الأنسجة وليس آخر.
   ملاحظة: في بعض الأحيان عيب ليس عدم وجود الحاجز، ولكن ثقب في الحاجز. لذلك ، انتبه بعناية لعدم خطأ تمزق لعيب الحاجز. يمكن أن يؤكد البحث عن التناسق بين الشرائح القريبة في منطقة معينة ما إذا كان هذا في الواقع عيبًا أو تمزقًا من التقطيع.
6. لتحديد العيوب في القناة الخارجة، مثل الشريان الوريدي، استخدم شرائح متعددة لمتابعة الأوعية الدموية الرئيسية أثناء مغادرتها للقلب. خلق صورة للأوعية الدموية الرئيسية بالنسبة إلى بعضها البعض. يظهر مثال في الشكل 2C.
   ملاحظة: قد تكون بعض المخالفات بسبب مرحلة نمو الجنين (على سبيل المثال، يغلق الشريان الشبكي براءة اختراع بعد الولادة، بعد وقت قصير من الولادة؛ لا يغلق الحاجز البطيني تمامًا حتى ~ e14.5). بعض عيوب القلب العيانية الشائعة الأخرى التي لم يتم تضمينها في الأرقام تشمل truncus المستمر، والتي يمكن اكتشافها بسهولة أكبر في e16.5 وما بعدها. منفذ مزدوج البطين الأيمن (DORV), التي يمكن الكشف عنها في شرائح في القلب الذي يدخل القناة الخارج; وأورطا التجاوز²². عيب القلب المجهري المشترك يتضمن انخفاض ضغط العضلات(الشكل 4).

9. التحليل الكمي لضغط عضلة القلب باستخدام الأنسجة الملطخة هيماتوكسيلين وإيوسين

1. باستخدام الرؤية العيانية لعينات الأنسجة الملطخة(الشكل 4A)، حدد منطقة ذات أهمية للصورة في التكبير 40x(الشكل 4B). لهذه الورقة، تم استخدام جدار البطين الأيسر. حفظ الصورة في الشكل المطلوب. لهذه الورقة، تم حفظ الصور كملفات .tif.
2. افتح الصورة في برنامج ImageJ.
3. تعيين الصورة إلى 8 بت. وهذا يسمح للصورة للاستفادة من أداة عتبة في الخطوة التالية^23،24. للقيام بذلك، حدد "صورة | اكتب | 8 بت".
4. تعيين عتبة الصورة. الغرض من هذه الخطوة هو تحديد وحدات البكسل التي تمثل الخلفية فقط، باستثناء البيكسلات التي تمثل الأنسجة^23و24.
   ملاحظة: سيتم طرح هذه المساحة السطحية لاحقاً. سوف تحدد العتبة الصحيحة وحدات البكسل التي يريد الباحث استبعادها من مساحة سطح الأنسجة العضلية. لذلك، يجب أن تتضمن النتيجة المنتهية النسيج في تدرج رمادي وسيتم تحديد الخلفية.
   1. انقر على "ImageJ | صورة | ضبط | عتبة". نقل الشريط العلوي لإجراء تعديلات العتبة. إغلاق نافذة تعديلات العتبة دون إجراء أية تغييرات أخرى بمجرد تحديد المقاطع المطلوبة²¹.
5. استخدم أداة تحديدات المضلع لتحديد المساحة التي تشغلها الأنسجة. تأكد بعناية من أن الخطوط العريضة تتبع حدود الأنسجة ، لأن التتبع الفضفاض سيوفر قياسات خاطئة.
6. ضبط إعدادات القياس على ImageJ بحيث يقيس البرنامج فقط مساحة البيكسلات التي تم تحديدها باستخدام أداة العتبة في الخطوة 9.4²³. "ImageJ | تحليل | تعيين القياسات | المساحة والحد إلى العتبة". حدد المنطقة فقط والحد إلى العتبة.
7. قياس مساحة البيكسلات المميزة. "ImageJ | تحليل | قياس". تمثل هذه القيمة مساحة المساحة السالبة.
8. قياس مساحة المنطقة بأكملها ذات الاهتمام. هذه هي المنطقة التي تم تحديدها باستخدام أداة تحديدات المضلع. "صورة J | تحليل | تعيين القياسات | المنطقة". حدد المنطقة فقط وقمت بإلغاء تحديد الحد إلى العتبة. ثم قياس، واختيار "صورة J | تحليل | قياس".
9. حساب المنطقة التي تشغلها الأنسجة العضلية الفعلية داخل المنطقة ذات الاهتمام. طرح مساحة المساحة السلبية من منطقة المنطقة بأكملها ذات الاهتمام. هذه القيمة هي منطقة الأنسجة العضلية.
10. حساب مؤشر ضغط العضلات (MCI). تقسيم منطقة الأنسجة العضلية حسب منطقة المنطقة ذات الاهتمام.
    
    كلما كانت قيمة MCI أكبر ، كلما ضغطت العضلات أكثر. ويمكن بعد ذلك استخدام قيم MCI هذه للتحليل الإحصائي لاختبار التغيرات الهامة في ضغط العضلات بين مجموعات العلاج(الشكل 4C).

النتائج

تمت مقارنة مؤشر ضغط العضلات بين القلوب النامية تحت اثنين من بيئات مختلفة، والسيطرة ومجموعة تجريبية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتحليل الضغط من الأنسجة العضلية كميا، مما سمح التحليل الإحصائي. وقد تبين أن ضغط العضلات قد انخفض بشكل كبير في القلوب التجريبية نسبة إلى الأجنة التي تطورت في ظروف غير تجريبية.

يتم التخلص من الأجنة إذا كان توقيت المراقبة يبدو غير دقيق. على الرغم من أن توقف نمو الأجنة يمكن أن يكون نتيجة لعلاج التجربة ، وه...

المناقشة

يستكشف هذا البروتوكول التقنيات التي ينطوي عليها تحليل تطور القلب في القلوب الجنينية. بعض القيود المفروضة على هذه الطريقة هي البراعة البدنية المطلوبة للتقنيات التحضيرية ، والتي قد تتطلب الممارسة ، والمهارة مع التصوير المجهر. إذا كانت الشرائح التي تم الحصول عليها في cryostat فوضوية ، فإن تلطيخ الهيماتوكسيلين وإيوسين لن يكون واضحًا ، أو إذا كانت الصور التي تم التقاطها في المجهر تحتوي على إضاءة ضعيفة ، فإن الطريقة المستخدمة مع ImageJ لن تعمل. أحد قيود ميزة العتبة لبرنامج ImageJ هو أنه يحدد وحدات البكسل الموجودة على أحد طرفي ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
15 مل أنبوب (أنبوب) مخروطي الشكل	فيشر	العلمي # 1495970C
C57BL / 6J Mice	Jackson Labs	C57BL / 6J - مخزون 000664
برطمانات تلطيخ كوبلين (x6)	VWR Scientific	# 25457-006
أغطية 24X50MM # 1.5	VWR علمي	# 48393-241
Cryostat - Leica CM3050S	Leica	N / A
تشريح (أطباق) فيشر	العلمي	# 50930381
دومون # 5 - ملقط ناعم (x2)	أدوات العلوم	الدقيقة # 11254-20
Eosin Y Solution	Millipore Sigma	# HT110116-500ML
كحول إيثيلي (نقي ، 200 دليل) فيشر	العلمي	# BP2818-500
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	ميليبور سيجما	# E9884-100G
Eukitt	Millipore Sigma	# 03989-100ML
أدوات العلوم الدقيقة المقص		الدقيق # 14060-10
مجهر ستيريو الفلورسنت Leica M165 FC	Leica	N / A
Glycine	Millipore Sigma	# 410225-250G
Graefe ملقط	أدوات العلوم الدقيقة	# 11052-10
برنامج Graphpad Prism 8	برنامج Graphpad
ImageJ برنامج	ImageJ
Kimwipes	Fisher Scientific	# 06666A
محلول الهيماتوكسيلين من ماير	Millipore Sigma	# MHS16-500ML
طرف (أطراف) الماصة الدقيقة - p200	فيشر العلمي	# 02707448
برنامج	Microsoft Excelمايكروسوفت
OCT مركب	VWR Scientific	# 102094-106
Olympus CkX53 مجهر	طلاء أوليمبوس
(على الأقل 2)
Paraformaldehyde	VWR Scientific	# 0215014601	تحويلها إلى محلول 4٪ (مذاب في PBS)
ماصة باستور (ماصات)	فيشر العلمي	# 13-711-7M
البنسلين الستربتومايسين	ThermoFisher العلمي	# 15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ThermoFisher	Scientific	# 70011044	تمييع من 10x إلى 1x قبل استخدام
Scale	Mettler Toledo	# MS1602TS
Scale	Mettler Toledo	# مقبض مشرط MS105
# 3	VWR Scientific	# 10161-918
شفرات مشرط	VWR علمي	# 21909-612
قالب مربع	VWR علمي	# 100500-224	لقوالب OCT
السكروز	Millipore Sigma	# S9378-500G
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	# 1255015
العلوم الدقيقة	المقص الجراحي	# 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge شفرات ميكروتوم يمكن التخلص	VWR علمية	# 25608-964
مقياس السفر	Acculab	VIC 5101
Xylene	Millipore Sigma	214736-1L