الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل انقسام الخلايا في الأنسجة السليمة عن طريق المجهر الخلية الحية والثابتة باستخدام الحيوانات المنوية الميواتية Drosophila. يوضح البروتوكول كيفية عزل الخصيتان الكاملة والسليمة من يرقات دروسوفيلا والخوخ المبكر ، وكيفية معالجتها وتركيبها للتنظير المجهري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التحليل التجريبي للخلايا التي تنقسم في الأنسجة والأعضاء الحية والسليمة أمر ضروري لفهمنا لكيفية تكامل انقسام الخلايا مع التطور وتناط الأنسجة وعمليات المرض. الخلايا المنوية Drosophila التي تخضع للmeiosis مثالية لهذا التحليل لأن (1) اختبارات Drosophila كاملة تحتوي على الخلايا المنوية من السهل نسبيا لإعداد للميكروسسكوبية، (2) حجم الحيوانات المنوية كبيرة يجعلها مناسبة تماما للتصوير عالية الدقة، و (3) أدوات قوية Drosophila الوراثية يمكن دمجها مع في تحليل الجسم الحي. هنا ، نقدم بروتوكولًا يسهل الوصول إليه لإعداد الخصيتين الكاملتين من يرقات الانستار الثالثة Drosophila والخوخ المبكر. نحن نصف كيفية تحديد الحيوانات المنوية meiotic في الخصيتين كله أعدت وكيفية تصويرها تعيش عن طريق المجهر الفاصل الزمني. كما يتم توفير بروتوكولات التثبيت والاختبارات الكاملة المناعية. استخدام الخصية اليرقات له العديد من المزايا على البروتوكولات المتاحة التي تستخدم الخصية الكبار لتحليل الحيوانات المنوية. الأهم من ذلك، الخصيتين اليرقات هي أصغر وأقل ازدحاما مع الخلايا من الخصيتين الكبار، وهذا يسهل إلى حد كبير التصوير عالية الدقة من الخلايا المنوية. لإثبات هذه المزايا وتطبيقات البروتوكولات، نقدم نتائج تبين إعادة توزيع التبهيل الإندوسلي في ما يتعلق بالميكروتوبولين المغزل أثناء انقسام الخلية في صورة واحدة من الحيوانات المنوية التي تم تصويرها بواسطة المجهر confocal الفاصل الزمني. يمكن الجمع بين البروتوكولات مع التعبير عن أي عدد من البروتينات الموسومة بفلوريأو علامات العضين ، وكذلك الطفرات الجينية وغيرها من الأدوات الوراثية ، مما يجعل هذا النهج قويًا بشكل خاص لتحليل آليات تقسيم الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة والأعضاء الكاملة.
المقدمة
وغالبا ما يدرس انقسام الخلية باستخدام خطوط الخلية نمت في الثقافة1. في حين أننا قد اكتسبت ثروة من البصيرة لا تقدر بثمن وفهم الآليات الأساسية من هذه الدراسات2، والخلايا التي تزرع في الثقافة لا يمكن تلخيصها تماما فيزيولوجيا انقسام الخلايا كما يحدث في سليمة ، والأنسجة الحية. على سبيل المثال ، في الأنسجة والأعضاء السليمة ، يجب تقسيم الخلايا في المكان المناسب وفي الوقت المناسب بحيث تكون الخلايا الذرية موجودة بشكل صحيح داخل الأنسجة ، بحيث يمكن أن تخضع للتمايز المناسب أو البرامج الوظيفية ، وحتى يتم تنسيق انتشار الخلايا بشكل صحيح مع نمو الأنسجة أو التوازن3. بالنسبة للخلايا التي تزرع في الثقافة من ناحية أخرى ، يتم تنظيم انقسام الخلايا بشكل عام من خلال عوامل النمو في الثقافة المتوسطة4، وبالتالي لا يمكننا أن نتعلم من هذه الخلايا كيف تؤثر العوامل البيئية في الجسم الحي مثل بنية الأنسجة أو إشارات النمو على عملية التقسيم. من المهم أيضًا ملاحظة أن العديد من خطوط الخلايا المستخدمة لدراسة انقسام الخلايا ، مثل خلايا HeLa و U2OS ، كانت مشتقة من الأورام النقيلية5. لذلك ، من المرجح أن يتم تغيير العديد من جوانب علم وظائف الأعضاء الأساسي لهذه الخلايا السرطانية ، مثل الآليات التنظيمية لدورة الخلية والاستقرار الكروموسومي ، مقارنة بالخلايا السليمة. الفهم الكامل لفسيولوجيا انقسام الخلية ، لذلك ، يعتمد على قدرتنا على دراسة تقسيم الخلايا في مواطنها ، في بيئات الجسم الحي التي تحافظ على الآليات التنظيمية الفسيولوجية وهندسة الأنسجة.
ويعوق التقدم في فهم كيفية عمل انقسام الخلية داخل الأنسجة والأعضاء سليمة من الصعوبات الكامنة في تحليل الجسم الحي أو الجسم الحي. أولاً، قد يكون من الصعب أو المستحيل الوصول إلى الخلايا المنقسمة للتحليل المجهري داخل الأعضاء الكبيرة أو الأنسجة السميكة. ثانياً، غالباً ما يكون من الصعب التنبؤ بالوقت الذي ستنقسم فيه الخلايا الفردية في الجسم الحي. ثالثا، قد تتدهور فسيولوجيا الأنسجة بسرعة خلال زراعة الجسم الحي السابق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف طرق يمكن الوصول إليها بسهولة لتحليل الحية والثابتة من الحيوانات المنوية drosophila melanogaster لأنها تخضع لانقسامات الخلايا meiotic داخل الخصيتين سليمة تماما. هذه الخلايا مثالية لتحليل الحية، على سبيل المثال على الجسم الحي لأنها يمكن الوصول إليها بسهولة مع الأساليب البصرية القياسية مثل المجهر الكونستبكي، فإنها تقسم في أوقات ومواقع يمكن التنبؤ بها، ويمكن الحفاظ على الخصيتين سليمة في ثقافة الجسم الحي على ما يصل إلى حوالي 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، فإن خلايا الحيوانات المنوية في دروسوفيلا هي خلايا مستديرة كبيرة (قطرها حوالي 20-30 ميكرون) لا تغير الشكل عند تقسيمها، مما يجعلها مثالية للدقة العالية والتصوير الفاصل الزمني للمكونات الخلوية مثل جهاز المغزل والعضيات السيتوبلازمية. على الرغم من أن هذه الخلايا تخضع للmeiosis بدلا من الانقسام ، فإن العديد من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية متشابهة للغاية بين هاتين الآليتين لانقسام الخلايا6. جعلت هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع أدوات قوية Drosophila الوراثية، Drosophila spermatocytes نموذج يستخدم على نطاق واسع لتحليل الجسم الحي من عمليات تقسيم الخلايا الأساسية بما في ذلك تشكيل المغزل والتنظيم، cytokinesis، وإعادة عرض organelle وتقسيم7،8،9،10،11.
الخلايا المنوية هي الخلايا التي هي في مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية. في دروسوفيلا، يبدأ تكوين الحيوانات المنوية بمجموعة من الخلايا الجذعية الجرثومية التي تقع في منطقة صغيرة أو "محور" في قطب واحد من الخصية12،13. تنقسم هذه الخلايا بسبب الانقسام غير المتماثل ، مما يؤدي إلى وجود نطاف واحد متمايز. الحيوانات المنوية ثم الخضوع لأربعة mitoses متزامن لإنتاج مجموعة من 16 الخلايا التي لا تزال مرتبطة ارتباطا وثيقا داخل كيس واحد. في هذه المرحلة، تنتقل الخلايا من دورة الخلايا الميطيّة إلى دورة الخلية الميّواتية ويشار إليها باسم الخلايا المنوية. الخلايا المنوية تنفق حوالي يومين إلى ثلاثة أيام في مرحلة G2 الموسعة من دورة الخلية، والتي تنمو بشكل كبير والخضوع لتغيرات الخلوي استعدادا للقسمين meiotic والحيوانات المنوية اللاحقة13،14. المجموعة بأكملها من 16 الخلايا المنوية داخل كيس واحد ثم أدخل الانقسام meiotic الأولى في نفس الوقت. وهكذا، يمكن أن يتم التصوير العديد من الحيوانات المنوية meiotic في وقت واحد لأنها تتحرك من خلال انقسام الخلية. يشرع القسم الميوتيكي الأول لمدة 1.5 ساعة تقريبًا ويتبعها على الفور تقريبًا القسم الميوطي الثاني ، مما ينتج عنه 64 من الحيوانات المنوية الإجمالية التي تستمر في التفريق إلى الحيوانات المنوية الناضجة.
ميزة فريدة من نوعها لاستخدام الخلايا المنوية لدراسة انقسام الخلايا في الأنسجة الحية وسليمة هي أن مجموعات أو الخراجات من الخلايا تتقدم باستمرار من خلال مراحل مختلفة من تكوين الحيوانات المنوية، والخلايا في جميع مراحل تكوين الحيوانات المنوية يمكن عادة تحديدها في أي الخصية معينة (انظر الشكل 3A). لذلك ، من السهل نسبيًا العثور على خلايا ميوتيكية في الخصيتين الكاملتين. نحن نركز بشكل عام تحليلاتنا على الأول بدلاً من meiosis الثاني لأن هذه الخلايا أكبر بكثير وأكثر قابلية للتصوير عالي الدقة ، ولكن العملية بأكملها التي تشمل كلا القسمين meiotic يمكن تصويرها بنجاح. تجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول العام لإعداد الخصية والثقافة يمكن استخدامها لتحليل العمليات الأخرى لتكوين الحيوانات المنوية كذلك، مثل الخلايا الجذعية mitotic في وقت سابق أو الانقسامات المنوية أو التغيرات الخلوية التي تحدث كما الحيوانات المنوية تنضج في الحيوانات المنوية15. يتم الحفاظ على العديد من هذه الجوانب من تكوين الحيوانات المنوية بشكل كبير بين دروسوفيلا والبشر16.
الخلايا المنوية Drosophila تبدأ في الوصول إلى مرحلة meiotic من تكوين الحيوانات المنوية خلال المرحلة الثالثة من اليرقات instar من تطوير Drosophila 13. لذلك ، يمكن استخدام الخصيتين المعزولات من مراحل دورة الحياة بدءًا من يرقات الإنستار الثالثة بما في ذلك الخوخ والبالغين لتحليل تقسيم الخلايا المنوية. تتوفر العديد من البروتوكولات الممتازة لاستخراج الخصيات من الذباب الذكور البالغين للتحليل الحي والثابت لتكوين الحيوانات المنوية17،18،19. قد تكون هذه البروتوكولات مفضلة لدراسة المراحل المتأخرة من تكوين الحيوانات المنوية أو إذا كان يجب استخدام العلامات الوراثية التي لا تظهر إلا لدى البالغين. يركز البروتوكول بدلاً من ذلك على إعداد الخصية من اليرقات والخوخ المبكر ، لأن الخصيتين في هذه المراحل لها العديد من المزايا التي ترتبط على وجه التحديد بتحليل انقسام الخلايا عن طريق التحليل الدقيق العالي والمجهر الفاصل زمنيًا. أولاً ، الخصيتان من اليرقات والخوخ أصغر من تلك التي من البالغين ، والخلايا داخل الجهاز أقل ازدحامًا. وبسبب هذا، يمكن في كثير من الأحيان تقسيم الخلايا المنوية يمكن أن تكون صورة بالقرب من السطح الخارجي للاختبارات اليرقات، دون الحاجة إلى اختراق من خلال طبقات متعددة من الأنسجة المتناثرة الضوء. ثانياً، تتحرك خصيّات البالغين بشكل إيقاعي بسبب تقلصات الأعضاء الملحقة، وهذه الحركات تجعل تصوير الخلايا الفردية ينطوي على ضيق زمني. وثالثاً، تكون اختبارات اليرقات مفيدة عند دراسة الطفرات الجينية التي تسبب الفتك الجروية أو البالغة. تم تحسين أساليبنا لثقافة طويلة الأجل من الخصيتين على مرحلة المجهر ، مما يسمح بتصوير جولات متعددة من انقسام الخلايا أو تطور الخلايا الفردية من خلال مراحل متعددة من تكوين الحيوانات المنوية في نفس الإعداد. كما أننا نصف بروتوكول لتثبيت ومناعة الخصيتين بأكملها. وعموما، بروتوكولاتنا مفيدة بشكل خاص لأولئك المهتمين في دراسة انقسام الخلايا في الأنسجة سليمة، والقدرة على الجمع بين تحليل الحيوانات المنوية مع أدوات الحمض العضلي ة القابلة للاستغناء عن الأدوات الوراثية دروسوفيلا يجعل هذا النهج قوية خاصة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الحيوانات والأدوات ووسائل الإعلام للتشريح
- عبر الذباب الذكور والإناث للحصول على ذرية من النمط الجيني المطلوب. علامات معدلة مفيدة لتحديد والتدريج من الحيوانات المنوية meiotic تشمل GFP-tubulin لتسمية المغزل meiotic وRFP-histone 2A لتسمية الكروموس8. استخدم خمس إلى عشر إناث لكل صليب وحافظ على الصلبان على طعام الذباب القياسي في قوارير في حاضنة 25 درجة مئوية حتى تبدأ يرقات الإنستار الثالثة في الزحف على جانبي القارورة (4-5 أيام). سيبدأ الخوخ الأبيض المبكر في التشكل بعد يوم واحد.
- الحصول على اثنين من أزواج من ملقط على التوالي مع نصائح غرامة. تأكد من أن النصائح حادة ، حتى في الطول ، ومستقيمة(الشكل 1A). استخدام هذه الملقط فقط للتشريح، والغطاء مع نصائح ماصة 10 ميكرولتر عندما لا تكون في الاستخدام.
-
إعداد أداة مشرط.
- أدخل النهاية الحادة لدبوس حشرة فولاذية سوداء في حامل دبوس ، ولف المسمار الخاص بالحامل لتأمين الدبوس في مكانه. باستخدام زوج من الملقط وتحت المجهر تشريح، فهم دبوس الحشرة في الوسط وثنيه لتشكيل زاوية داخلية من 135 درجة(الشكل 1B). النهاية الحادة هي لقطع الأنسجة ، في حين يتم استخدام الحافة لنقل الخصيتين بين قطرات من الوسائط.
- غطاء مع 1000 μL تلميح ماصة عندما لا تكون في الاستخدام.
- العمل في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وإعداد 5 مل aliquots من وسائل الإعلام شنايدر وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام. عندما تكون جاهزة لبدء تشريح، دافئة واحدة 5 مل وسائل الإعلام aliquot إلى درجة حرارة الغرفة. ثم نقل وسائل الإعلام تشريح دافئ إلى حقنة 10 مل وإرفاق مرشح حقنة 0.22 ميكرون.
2. تشريح الخصية من اليرقات والخوخ المبكر
- استخدم حقنة التصفية المملوءة بالوسائط لطرد ثلاث قطرات من الوسائط (50 ميكرولتر لكل منها) في الجزء العلوي والأوسط والسفلي من الشريحة الزجاجية.
- استخدم مسبار تشريح لنقل يرقات الانستار من خمسة إلى عشرة ثالث أو الخوخ المبكر (الخوخ الذي لا يزال أبيض أو أصفر) إلى أعلى قطرة. تهيّج اليرقات والخوخ بلطف في وسائل الإعلام مع مسبار التشريح لإزالة أي طعام أو حطام.
- تحت المجهر تشريح، بدوره اليرقة واحد أو الخوخ على جانبها مع التحقيق تشريح لتحديد الخصيتين الثنائية إذا كانت موجودة، والتي تظهر كهياكل شفافة بيضاوية الشكل في الثلث الخلفي من الجسم(الشكل 2A، B). الحيوانات التي تفتقر إلى الخصيتين هي أنثى وينبغي التخلص منها.
- عندما يتم العثور على يرقة ذكر أو الخوخ ونظيفة، نقله إلى قطرة الثانية من وسائل الإعلام. كرر حتى 3 أو 4 يرقات الذكور و / أو الخواق قد تم نقلها إلى قطرة الثانية من وسائل الإعلام.
- العمل في قطرة الثانية من وسائل الإعلام، فهم يرقة ذكر واحد أو الخوخ مع زوج من ملقط في منتصف المنطقة، فقط في وضع الأمام للخصيب. استخدام الزوج الثاني من ملقط لتمزيق بلطف الحيوان في النصف.
- عقد النهاية الخلفية لليرقة أو الخوخ أسفل على الشريحة الزجاجية مع زوج من ملقط. بدءا من جانب الملقط، ودفع أسفل على بشرة باستخدام حافة أداة مشرط وتحريك مشرط نحو نهاية قطع من الحيوان. وهذا سوف يطرد الأعضاء الداخلية للالحيوان، والتي تشمل الشجاعة والهيئات الدهنية، والخصيات.
- ندف بلطف بصرف النظر عن الخصيات من بقية الأجهزة. الخصيتين واضحة، والأعضاء البيضاوية الشكل جزءا لا يتجزأ من شرائط من الجسم الدهون(الشكل 2C).
- نقل الخصية واحد في وقت واحد إلى قطرة الثالثة من وسائل الإعلام. لتحقيق ذلك، أدخل حافة المشرط تحت الجسم الدهني، ورفع الأنسجة من وسائل الإعلام، وتحريكه بسرعة إلى قطرة الثالثة.
- بدلا من ذلك، إذا لم يكن هناك ما يكفي من الجسم الدهون لا تزال تعلق على الخصيتين لرفع الأنسجة بنجاح، ونقل بلطف الأنسجة باستخدام ماصة باستور الزجاج التي تم الرطب قبل مع وسائل الإعلام تشريح.
- استخدام نهاية حادة من أداة مشرط لشريحة بلطف بعيدا الدهون الزائدة الجسم من الخصيتان، وترك مجرد حافة صغيرة من الجسم الدهون حول حواف(الشكل 2C). ليس من الضروري إزالة جميع الجسم الدهون، ومحاولة القيام بذلك من المرجح أن يؤدي إلى إتلاف أو تمزق الخصيتين.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لجميع يرقات الذكور على الشريحة الزجاجية.
- المضي قدما إما إلى الخطوة 3 أو الخطوة 5.
3. تركيب الاختبارات للتصوير المجهري الحي
ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء المتصاعد من بروتوكول نشر مؤخرا لتصوير اليرقات اليرقات الخلايا العصبية في الدماغ drosophila20. يمكن العثور على تفاصيل إضافية في هذا المرجع.
- استخدم حقنة التصفية لإيداع قطرة واحدة من وسائط شنايدر (حوالي 30 ميكرولتر) في مركز طبق ثقافة نفاذ الغاز 50 مم.
- استخدم ماصة باستور مبللة مسبقًا لنقل الخصيتين المعدتين إلى القطرة على الطبق القابل للنفاذ بالغاز. سوف تطفو الخصية عموما على سطح القطرة.
- استخدم أداة المشرط لدفع الخصية بلطف إلى أسفل على الغشاء نفاذالغاز. الحرص على عدم تمزق الغشاء نفاذ الغاز مع نقطة حادة من مشرط. دفع جميع الخصيات إلى وسط قطرة.
- استخدام حقنة 1 مل مليئة زيت الهالوكربون لجعل أربع قطرات من النفط، حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما، على غشاء الغاز نفاذي. الفضاء قطرات من النفط حول قطرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين لتتوافق مع الزوايا الأربع من غطاء الزجاج 22 ملم.
- اصطف زوايا غطاء زجاجي 22 مم مع أربع قطرات من زيت الهالكربون وتخفض بلطف قسيمة الغطاء على وسائل الإعلام والنفط. السماح لغطاء لتسوية ولوسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين لتنتشر بين قطرات النفط.
- قم بإزالة الوسائط الزائدة للسماح لقسيمة الغطاء بالاستقرار على سطح الخصيات. أثناء مراقبة الخصيات تحت المجهر التشريحي ، أدخل زاوية مهمة حساسة مسح في وسائل الإعلام تحت غطاء لفتيل كمية صغيرة من السائل. ويك بعيدا ما يكفي من وسائل الإعلام حتى الغطاء الزجاجي يجعل مجرد اتصال مع سطح أكبر الخصية. من الأهمية بمكان عدم إزالة الكثير من الوسائط وخفض قسيمة الغطاء بعيدًا جدًا ، لأن هذا سيمارس الضغط على الخصيين ويسبب لهم التمزق (انظر الشكل 5).
4. التصوير الحي من الحيوانات المنوية Meiotic
ملاحظة: يمكن تصوير الخلايا المنوية باستخدام المسح الضوئي بالليزر أو تدوير المجهر البؤري للقرص. يجب أن يكون النظام سرعة كافية وحساسية لتجنب التبييض الضوئي للبروتينات الفلورية أو تلف ضوئي للأنسجة.
- ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الزجاج فوق الخصية. الوجه على الطبق ووضعه على مرحلة المجهر وتحريك الهدف المجهر (40x أو 60x) في النفط حتى يكون أقل من الخصية. استخدم الضوء المرسل للعثور على خصية واحدة وجعلها في بؤرة التركيز.
- أثناء التقاط صور سريعة مع بؤرة الاتصال، حرك الخصية لفحص تنظيم الخلايا. واحدة من نهاية الخصية سيكون لها العديد من الخلايا الصغيرة ومعبأة بكثافة. تحتوي هذه النهاية على الخلايا الجذعية الجرثومية والحيوانات المنوية. تتحرك نحو الطرف الآخر من الجهاز، وتحديد الخلايا أكبر تدريجيا نظمت في مجموعات منفصلة أو الخراجات. هذه الخلايا الكبيرة هي الخلايا المنوية(الشكل 3A).
- إذا كان التصوير GFP-tubulin، وتحديد الخلايا المنوية التي ستبدأ meiosis في غضون 30-60 دقيقة من خلال وجود اثنين من أستر microtubule مشرق (أي المركزية) الموجودة في قشرة الخلية(الشكل 3B، C).
- مرة واحدة تم تحديد كيس من الخلايا المنوية meiotic، إعداد معايير الاستحواذ لالتقاط z-أكوام من الصور مع مرور الوقت. عادة، اقتناء 15-20 صور متباعدة 1.5 ميكرومتر بعيدا في البعد z كافية لالتقاط الحجم الكامل لعدة خلايا الحيوانات المنوية داخل نفس الكيس.
- الحصول على كامل z-مداخن كل 2 دقيقة إذا كان التصوير تقسيم meiotic الأول بأكمله، الذي يستغرق حوالي 1.5 ساعة. من الممكن استخدام معدلات اقتناء أسرع ، خاصة إذا كان سيتم تحليل حدث معين من meiosis فقط. ومع ذلك، الحرص على عدم التسبب في التبييض الضوئي أو تلف ضوئي بسبب التعرض المتكرر للعينة لإثارة الليزر.
- استخدم نظام التحكم المستمر والتلقائي في التركيز لمنع الانجراف البؤري على مدار فترة طويلة من الاستحواذ. التحكم في درجة الحرارة من العينة على مرحلة المجهر عموما ليست ضرورية، على افتراض درجة حرارة الغرفة من حوالي 22-23 درجة مئوية. إذا كان التحكم في درجة الحرارة متاحًا، فحافظ على العينة عند 25 درجة مئوية على مرحلة المجهر.
- إذا لم يتم العثور على الخلايا المنوية meiotic، تخزين العينة لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها في حاضنة 25 درجة مئوية والصورة مرة أخرى.
5. التثبيت والمناعة
- من الخطوة 2.10 أعلاه، استخدم ماصة بستر زجاجية لنقل الخصيتين إلى بئر في طبق تشريح زجاج 9 بئر يحتوي على 0.5 مل من بارامايدهايد 8٪ في PBSTx (الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا مع 0.3٪ تريتون X-100). تأكد من أن الخصيتان تضعان على الجزء السفلي من الطبق.
ملاحظة: بارافورماديهايد سام ويجب التعامل معه بقفازات في غطاء الدخان. - إصلاح الخصيتين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الخصيتين إلى بئر يحتوي على 0.5 مل PBSTx. غسل لمدة 5 دقيقة مع الانفعالات لطيف. كرر خطوة غسل في آبار جديدة مع PBSTx الطازجة مرتين أكثر.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز المطلوب في 0.5 مل PBSTx تحتوي على 5٪ من الزل المصل البقري (BSA) في أنبوب ميكروالطرد المركزي 1.5 مل. نقل الخصيتين من 9 بئر الزجاج تشريح الطبق إلى أنبوب الأجسام المضادة الأولية المخففة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع هزاز لطيف أو الجوز.
- غسل الخصيتين في 0.5 مل من PBSTx لمدة 5 دقيقة في بئر من 9 بئر الزجاج تشريح الطبق. كرر خطوة غسل مع PBSTx الطازجة مرتين أكثر.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية في 250 ميكرولتر من PBSTx تحتوي على 5٪ BSA والاستغناء في بئر نظيفة من طبق تشريح الزجاج 9 بئر. إذا رغبت في ذلك، إضافة DAPI لوصمة عار الحمض النووي. نقل الخصيتين إلى البئر الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية، وتغطية مع غلاف بلاستيكي، واحتضان في الظلام مع الانفعالات لطيف لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- نقل الخصيتين إلى نظيفة مليئة جيدا مع 0.5 مل من PBSTx. غسل مع PBSTx الطازجة مرتين لمدة 5 دقيقة ولمرة ثالثة لمدة 30 دقيقة.
6. تركيب الخصيات الثابتة
- نقل الخصيات من غسل الماضي على شريحة المجهر الزجاج باستخدام ماصة باستور. إذا لزم الأمر، استخدم حافة أداة المشرط لدفع الخصية إلى أسفل على سطح الشريحة.
- استخدام زاوية مسح مهمة حساسة لفتيل بعيدا السائل الزائد من الخصيات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل.
- تطبيق قطرة 30-50 ميكرولتر من تركيب المجهر المتوسطة إلى الخصيات.
- ضع قسيمة تغطية 22 مم على قطرة متوسطة التركيب واسمح لقسيمة الغطاء بالاستقرار والوسائط المتصاعدة للانتشار تحت قسيمة الغطاء. تطبيق ضغط لطيف على coverslip إذا لزم الأمر للضغط على الزائدة تصاعد المتوسطة والسماح للغطاء للراحة على سطح الخصية.
- استخدام طلاء الأظافر لختم حواف الغطاء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، ستبقى الخصيتين سليمتين تمامًا للتصوير عن طريق المجهر المحوري أو طرق المجهر الفلورية الأخرى. كما رأينا في الشكل 3A، يتم الحفاظ على التنظيم الخلوي للخصيتين ، ويكون تطور تمايز الخلية من نهاية واحدة من الخصية إلى الطرف الآخر بما في ذلك الحيوانات المنوية ، والخلايا المنوية ، والحيوانات المنوية haploid مرئية. GFP-tubulin هو علامة مفيدة لتحديد تقسيم الخلايا المنوية والتصوير الحي لتطور الخلايا من خلال meiosis. كما هو مبين في الشكل 3B
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لقد وصفنا بروتوكولًا لإعداد اختبارات اليرقات أو الجرو المبكر ة Drosophila ، الأمثل للتصوير الحي على المدى الطويل لانقسام خلايا الحيوانات المنوية. هذا هو وسيلة قوية لتحليل انقسام الخلايا في السياق الفسيولوجي للأنسجة سليمة. يتم توسيع قوة هذه الطريقة عند دمجها مع الأدوات الوراثية Drosophila ، مثل الطفرات الجينية المحددة ، والقمع بوساطة RNAi الخاصة بالأنسجة ، والبروتين والعلامات المنزرعة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الصغير لليرقات والخصيتين الجراء ، والقدرة على تصوير الخلايا المنقسمة قريبة جدًا من الغطاء ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع بدء الأموال لJ.T.S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5 "تشريح مسبار | فيشر | 08-965-A | |
| 5.75" زجاج باستور بيبيت | فيشر | 13-678-20A | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) فيشر | BP9703-100 | ||
| دومون # 5 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-20 | تكريمات مستقيمة مع نصائح دقيقة |
| شرائح مجهر بلوري | فيشر | 12-544-2 | شرائح لتركيب الأنسجة الثابتة ، مع سطح الكتابة المتجمد |
| زيت الهالوكربون 700 | سيجما | H8898-100 مل | |
| طبق لوموكس 50 | Sarstedt | SAR946077410 | طبق ثقافة الأنسجة النفاذية للغاز |
| مجهر فيشر زجاجي | 12-541-B | 22 مم × 22 مم ، # 1.5 غطاء زجاجي | |
| دبابيس Minutien | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-15 | دبابيس الحشرات المستخدمة في صنع أداة مشرط |
| حامل دبوس مطلي بالنيكل | أدوات العلوم الدقيقة | 26018-17 | |
| محلول بارافورمالدهيد 32٪ ، | علوم الفحص المجهري الإلكتروني | 15714 | |
| خطة شرائح مجهر الحافة المشطوفة | فيشر | 12-549-5 | شرائح تستخدم للتشريح |
| لوحات بقعة PYREX | فيشر | 13-748B | طبق تشريح زجاجي |
| 9 آبارشنايدر <إم >ذبابة الفاكهة < / م > مرشح حقنة فيشر | 21720-024 | ||
| متوسط ، 0.22 وميكرو ؛ m | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | الفحص المجهري تركيب الوسط |
المراجع
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111(2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), Hoboken, N.J. 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456(2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8(2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, ÅH., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 218-227 (2014).
- Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460(2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058(2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868(2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
