يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

القضاء على الخلايا العصبية السيروتونية عن طريق الحقن التجسيمي ل 5،7-ثنائي هيدروكسي تريبتامين في نوى راف الظهرية للفئران

3.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60968

⸱

مايو 1, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر الآفة بنواة راف الظهرية (DRN) (>معدل بقاء 90٪ في الفئران التجريبية) مع فقدان مستقر للخلايا العصبية السيروتونية الظهرية عن طريق الحقن التجسيمي ل 5،7-ثنائي هيدروكسي تريبتامين في DRN باستخدام نهج بزاوية لمنع إصابة الجيوب الأنفية السهمية العلوية.

الملخص

تم استخدام الحقن التجسيمي على نطاق واسع للتوصيل المباشر للمركبات أو الفيروسات إلى مناطق الدماغ المستهدفة في القوارض. يمكن أن يتسبب الاستهداف المباشر للخلايا العصبية السيروتونية في نواة الراف الظهرية (DRN) في حدوث نزيف مفرط وموت ، نظرا لموقعه أسفل الجيوب الأنفية السهمية العلوية (SSS). يصف هذا البروتوكول توليد نموذج فأر خلوي خلوي هرمون السيروتونين DRN (معدل بقاء >90٪) مع فقدان مستقر ل >70٪ من الخلايا الإيجابية 5-HT في DRN. يتم إحداث الآفة عن طريق الحقن التجسيمي لسم عصبي انتقائي من هرمون السيروتونين 5،7-ثنائي هيدروكسي تريبتامين (5،7-DHT) في DRN باستخدام نهج بزاوية (30 درجة في الاتجاه الأمامي / الخلفي) لتجنب إصابة SSS. تظهر الفئران المصابة بآفة الخلايا العصبية السيروتونية DRN تغيرات سلوكية مرتبطة بالقلق ، مما يساعد على تأكيد نجاح جراحة آفة DRN. تستخدم هذه الطريقة هنا لآفات DRN ، ولكن يمكن استخدامها أيضا للحقن التجسيمية الأخرى التي تتطلب الحقن الزاوي لتجنب هياكل خط الوسط. يوفر نموذج الفأر الآفة العصبية لهرمون السيروتونين DRN أداة قيمة لفهم دور الخلايا العصبية هرمون السيروتونين في التسبب في الاضطرابات النفسية ، مثل اضطراب القلق العام والاضطراب الاكتئابي الشديد.

المقدمة

السيروتونين ، أو 5-هيدروكسي تريبتامين (5-HT) ، هو ناقل عصبي مهم يتم إنتاجه بشكل رئيسي في الأمعاء والدماغ ويؤثر على مجموعة متنوعة من الوظائف النفسية. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، يلعب نظام هرمون السيروتونين دورا مركزيا في تنظيم الحالة المزاجية والسلوك الاجتماعي والنوم والاستيقاظ والشهية والذاكرة والرغبة الجنسية. في الجهاز العصبي المركزي ، يتم تصنيع السيروتونين بواسطة الخلايا العصبية هرمون السيروتونين ، والتي يمكن فصلها إلى المجموعتين التاليتين: المجموعة المنقارية ، التي لها نتوءات تصاعدية تعصيب الدماغ كله تقريبا. والمجموعة الذيلية ، والتي تصدر بشكل أساسي على النخاعالشوكي 1. تتكون المجموعة المنقارية ، التي تحتوي على حوالي 85٪ من الخلايا العصبية السيروتونية في الدماغ ، من النواة الخطية الذيلية ، ونواة الراف المتوسطة ، و DRN ، حيث يوجد أكبر عدد من الخلايا العصبية هرمون السيروتونين في الدماغ.

يعتقد عموما أن عدم تنظيم نظام هرمون السيروتونين مرتبط بالتسبب في اضطراب الاكتئاب الشديد (MDD) واضطرابات القلق العام (GAD)2. هذا يرجع إلى حقيقة أن مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية (SSRIs) هي علاج دوائي فعال لهذه الاضطرابات النفسية3،4. بالإضافة إلى ذلك ، تشير الأدلة التراكمية إلى أن الهوس5 والسلوك الانتحاري6 قد يرتبطان بمستويات أقل من أداء السيروتونين في DRN. كما تم الإبلاغ عن أن Pet1-Cre. تظهر الفئران Lmx1bflox / flox وفئران hTM-DTAiPet1 (نماذج الفئران الجينية التي تفتقر إلى معظم الخلايا العصبية السيروتونية المركزية من المرحلة الجنينيةالمتأخرة 7 والبلوغ8 ، على التوالي) ذاكرة خوف سياقية محسنة. ومع ذلك ، على الرغم من البحث المكثف ، لا يزال يتعين توضيح المشاركة الدقيقة للخلايا العصبية السيروتونية DRN في هذه الاضطرابات النفسية.

من أجل استكشاف الآليات التي تنظم بها الخلايا العصبية السيروتونية DRN التسبب في الاضطرابات النفسية المرتبطة بالسيروتونين ، تم إنشاء نماذج حيوانية. تم تطبيق أدوات البصريات الوراثية لتثبيط الخلايا العصبية السيروتونية في DRN للفئران ، وتظهر هذه سلوكيات شبيهة بالقلق9. ومع ذلك ، فإن علم البصريات الوراثي له قيود. على سبيل المثال ، يجب زرع جهاز توصيل الضوء في المنطقة المستهدفة في عمق الدماغ ، وقد تصاب الأنسجة المحيطة أثناء جراحة الزرع أو بسبب الحرارة المنبعثة من جهاز الضوء. حتى لو لم يتسبب تغيير درجة الحرارة في تلف أنسجة المخ يمكن اكتشافه ، فلا يزال بإمكانه إحداث تأثيرات فسيولوجية وسلوكيةملحوظة 10.

قد يكون التلاعب الدوائي نهجا أسهل لإنشاء نماذج حيوانية مصابة بآفات الخلايا العصبية السيروتونية DRN. وقد ولدت بعض المجموعات DRN السيروتونين الفئران الآفة الخلايا العصبية عن طريق الحقن المجهري التجسيمي للسموم العصبية السيروتونين 5,7-DHT في DRN. ومع ذلك ، تظهر نماذج الفئران هذه تغيرات سلوكية مختلفة ، مثل السلوك المزيلللقلق 11 ، وزيادة السلوك الشبيهبالقلق 12 ، وضعف ذاكرة الكائن13. على الرغم من العديد من الدراسات التي أجريت على الفئران ، فقد أجريت دراسات أقل حول تأثيرات 5،7-DHT على الفئران. أبلغت إحدى المجموعات عن وفيات مفرطة (>50٪) واستنفاد محدود للسيروتونين في الفئران التجريبية التي تلقت حقنا مجهريا تجسيميا بمقدار 5،7-DHT في DRN14. أفادت مجموعة أخرى أن الإجهاد الخفيف المزمن غير المتوقع (UCMS) يمكن أن يؤدي إلى تغيير كبير في زمن انتقال الهجوم في الفئران المصابة بآفة DRN الناجمة عن 5،7-DHT. ومع ذلك ، لم يتم تقديم أي نتائج نسيجية لتأكيد فقدان الخلايا العصبية السيروتونية الدقيقة في DRN15. قد يؤدي الحقن التجسيمي في DRN باستخدام الإجراءات القياسية إلى نزيف حاد وارتفاع معدل الوفيات للفئران ، نظرا لحقيقة أن الموقع التشريحي ل DRN أقل من SSS16.

يصف هذا البروتوكول بروتوكول إنشاء نموذج فأر خلوي خلوي هرمون هرمون DRN (>معدل بقاء 90٪ للفئران التجريبية) مع فقدان مستقر للخلايا العصبية السيروتونية DRN عن طريق الحقن التجسيمي ل 5،7-DHT. يستخدم الحقن في DRN نهجا بزاوية لمنع إصابة SSS. تسبب هذه الجراحة باستمرار فقدان >70٪ من الخلايا العصبية السيروتونية في DRN للفئران ، وتنتج تغيرات سلوكية مرتبطة بالقلق. البروتوكول المستخدم هنا هو لإحداث آفات DRN ، ولكنه يمكن أن يكون مفيدا أيضا للباحثين الذين يرغبون في إجراء الحقن التجسيمية في هياكل خط الوسط الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر نموذج الفأر الآفة العصبية لهرمون السيروتونين DRN أداة قيمة لفهم دور الخلايا العصبية السيروتونية في الاضطرابات النفسية (مثل MDD و GAD) وتقييم العوامل الواقية العصبية المحتملة أو الاستراتيجيات العلاجية لهذه الحالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التدخلات الجراحية وإجراءات رعاية من قبل لجنة في كلية علوم الحياة والتكنولوجيا ، جامعة تونغجي ، شنغهاي ، الصين.

1. إسكان

  1. حافظ على ذكور الفئران C57BL / 6NCrl (10 أسابيع ، 25 جم ، ن = 21) في الظروف القياسية (درجة حرارة 24 درجة مئوية ؛ رطوبة 55٪) تحت دورة ضوء / ظلام 12 ساعة / 12 ساعة.
  2. توفير الطعام والماء بشكل خاص.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام ثلاثة من الفئران لتأكيد مسار الإبرة.

2. تحضير الكواشف

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات تحضير الدواء في غطاء التدفق الصفحي لتجنب التلوث. يتم تخزين جميع المحاليل المحضرة في فريزر -80 درجة مئوية. يوصى باستخدام كمية واحدة في كل مرة ، وإذابة الثلج تماما ، وتخلط جيدا قبل الاستخدام ، والتخلص من بقايا الطعام في الأنبوب ، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر.

  1. قم بإذابة 0.25 جم من هيدروكلوريد ديسيبرامين في 100 مل من محلول ملحي 0.9٪ للحصول على محلول 2.5 مجم / مل. عقم المحلول باستخدام مرشح حقنة بغشاء PES محب للماء بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بنقل المحلول (1.8 مل / أنبوب) في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة (EP) سعة 2 مل. ضع الملصق والتاريخ واحفظه في فريزر -80 درجة مئوية على الفور. الجرعة الموصى بها للاستخدام الحيواني هي 25 مجم / كجم.
  2. قم بإذابة 5 ملغ من 5،7-DHT في 1.67 مل من محلول ملحي 0.9٪ يحتوي على 0.1٪ حمض الأسكوربيك لإنتاج محلول 3 ميكروغرام / ميكرولتر. دوامة برفق للخلط ، وتعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) ، ونقل المحلول (10 ميكرولتر / أنبوب) في أنابيب EP 0.5 مل. ضع الملصق والتاريخ وقم بالتجميد عند -80 درجة مئوية على الفور. الجرعة الموصى بها للاستخدام الحيواني هي 2 ميكرولتر / فأر.
  3. قم بإذابة الكيتوبروفين (مسكن للمسكين) باتباع الطريقة الموضحةسابقا 17. قم بإذابة 250 مجم من الكيتوبروفين في 15 مل من الماء و 1 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3 وقم بتكوين الحجم النهائي إلى 125 مل ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ 2 مجم / مل. قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر وقم بنقل المحلول (0.4 مل / أنبوب) في أنابيب EP سعة 1.5 مل. ضع الملصق والتاريخ وقم بالتجميد عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. الجرعة الموصى بها للاستخدام الحيواني هي 5 مجم / كجم.

3. تحضير الأدوات والفئران

  1. قم بإعداد عبوة جراحية (تحتوي على مشرط ، وزوج من ملقط الأنسجة ، ومقص ، وحامل إبرة ، و 3-0 خيوط ، وعلامات أذن ، وقضيب علامة الأذن) تم تعقيمها مسبقا في الأوتوكلاف بدرجة حرارة عالية. ضع 75٪ إيثانول ، بوفيدون - يود ، 3٪ بيروكسيد الهيدروجين ، محلول السيارة (0.1٪ حمض الأسكوربيك في محلول ملحي 0.9٪) ، مسحة قطن ، مرهم عين أوفلوكساسين ، وقفص استرداد الفأر فوق وسادة التدفئة ، باستخدام حقنة هاميلتون بإبرة 32 جم وحقنة 1 سم مكعب.
  2. ح قبل حقن 5,7-DHT, وزن وتسجيل أوزان الجسم للفئران, ثم تعرضهم داخل الصفاق (IP) حقن من ديسيبرامين (2.5 ملغ/مل, 10 ميكرولتر/غرام الوزن).
    ملاحظة: الغرض من إعطاء ديسيبرامين 1 ساعة قبل حقن 5،7-DHT هو منع فقدان الخلايا الكاتاكولامينرجيك18.
  3. تخدير الفئران باستخدام التخدير الاستنشاقي الأيزوفلوران (3٪ أثناء الحث ، 1.5٪ أثناء الصيانة ، معدل التدفق = 2 لتر / دقيقة). إدارة كيتوبروفين (2 ملغم/مل، 2.5 ميكرولتر/غرام الوزن) عن طريق الحقن تحت الجلد (SC). تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة لقرصة الذيل.

4. الحقن التجسيمي

  1. ضع الماوس المخدر على المنصة التجسيمية ، ثم ثبت رأسه بقضبان الأذن وشريط القاطع للجهاز التجسيمي.
  2. احلق رأس الفأر ، ثم نظف فروة الرأس المكشوفة بمقشر واحد من الإيثانول بنسبة 75٪ متبوعا بمقشر واحد من بوفيدون اليود.
  3. ضع مرهم الليدوكائين على فروة الرأس باستخدام قطعة قطن لتوفير تسكين موضعي. ضع مرهم العين على العينين لحماية القرنية.
  4. قم بعمل شق في فروة الرأس على طول خط الوسط باستخدام مشرط من 1 مم خلف العينين إلى خط الأذن.
  5. استخدم مسحة مبللة ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لإزالة السمحاق ، ثم جفف الجمجمة وفضح خيوط الجمجمة. حدد موقع البريجما واللامدا.
  6. اضبط موضع الرأس باستخدام شريط القاطع حتى يوضع البريجما واللامدا في نفس المستوى الأفقي. اضبط طرف الإبرة للمس بريجما أو لامدا ، وسجل الإحداثيات الإنسية / الجانبية (ML) والظهرية / البطنية (DV) ، واضبط شريط القواطع بحيث تكون إحداثيات DV و ML من bregma و lambda متساوية ، على التوالي.
  7. افتح زر تحديد المواقع العمودي وبرغي القفل ، ثم اضبط ذراع المناور (المحور z) على 30 درجة في الاتجاه الأمامي / الخلفي (AP) كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب. قفل الزر.
  8. ثبت حقنة هاميلتون مملوءة ب 2 ميكرولتر من 5,7-DHT (3 ميكروغرام / ميكرولتر) على الحامل (بالنسبة لمجموعة الوهم, يتم حقن الفئران مع 0.9٪ محلول ملحي يحتوي على 0.1٪ حمض الأسكوربيك). اضبط طرف الإبرة للمس معلم بريجما ، ثم قم بتصفير قيم ML و AP و DV باستخدام وحدة العرض الرقمي.
    ملاحظة: محلول 5,7-DHT هو سائل بني اللون, مما يجعل من السهل تحديد ما إذا كانت حقنة هاميلتون مملوءة بشكل صحيح. إذا لم يكن هناك وصول إلى وحدة عرض رقمية ، فقم بتسجيل الرقم المعروض على ثلاثة محاور عندما يلامس طرف الإبرة البريجما ، وتمثل الإحداثيات النهائية "الرقم المسجل بالإضافة إلى الإحداثيات المتوفرة في هذا البروتوكول". على سبيل المثال ، إذا كان الرقم المسجل على ذراع مناور المحور y (اتجاه A / P) هو "a" ، فيجب أن يكون الإحداثي النهائي في اتجاه A / P هو "a - 6.27".
  9. حرك ذراع المناور لضبط طرف الإبرة على موضع الحقن (APa = -6.27 ، ML = 0 ؛ صيغة حساب الإحداثيات النهائية مدرجة في الشكل 1 ب). حدد الموضع المستهدف باستخدام قلم علامة.
  10. قم بحفر ثقب الأزيز باستخدام مثقاب محمول عالي السرعة ، ثم حرك ذراع المناور لخفض طرف الإبرة إلى الهدف (DVa = -4.04). حقن 2 ميكرولتر من المحلول في الدماغ ببطء (0.5 ميكرولتر / 3 دقائق) ، مع الحفاظ على الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق إضافية لمنع تسرب المحلول. قم بإزالة الإبرة برفق بعد الحقن.
  11. ضع خيوطا متقطعة على الشق باستخدام 3-0 خيوط. لف الشق المخيط بقطعة قطن مبللة باليود لتجنب العدوى.
  12. نظف الأذن اليمنى بقطعة قطن بوفيدون يود ، ثم ضع علامة الأذن المعقمة على قاعدة الأذن للتعرف عليها.
  13. قم بإزالة الفئران التجريبية من الجهاز التجسيمي وضعها في قفص تعافي الفئران فوق وسادة التدفئة حتى يتم ملاحظة الشفاء التام من التخدير.

5. رعاية الفئران بعد الجراحة

  1. إخضاع الفئران لحقن الكيتوبروفين 1x / يوم حتى يومين بعد الجراحة.
  2. افحص الفئران يوميا حتى 7 أيام بعد الجراحة.

6. اختبار متاهة T المرتفع

ملاحظة: قم بإجراء الاختبار كما هو موضح سابقا19,20.

  1. تأكد من أن اختبار المتاهة T المرتفعة (ETM) يتكون من ذراعين مفتوحين (30 سم × 5 سم × 0.5 سم) عموديا على ذراعين مغلقين (30 سم × 5 سم × 16 سم × 0.5 سم) مع منصة مركزية (5.0 سم × 5.0 سم × 0.5 سم). يتم حظر أحد الأذرع المغلقة بواسطة لوح بلاستيكي غير شفاف لتشكيل شكل حرف T (الشكل 2 أ).
  2. قبل ثلاثة أيام من اختبار ETM ، اعتاد على عن طريق التعامل معها يوميا لمدة 5 دقائق.
  3. في اليوم 30 بعد الجراحة ، قم بإجراء اختبار ETM.
  4. في يوم الاختبار السلوكي ، قم بتعريض الفئران لأحد الأذرع المفتوحة لمدة 10 دقائق.
  5. لاختبار التجنب المثبط ، ضع كل فأر في الطرف البعيد من الذراع المغلق وسجل الوقت المستغرق لترك هذا الذراع بأربعة أقدام في ثلاث تجارب. التجربة الأولى هي التجنب الأساسي ، والتجربة الثانية هي التجنب 1 ، والتجربة الثالثة هي التجنب 2.
  6. احتفظ بالفئران في أقفاصها لمدة 30 ثانية بين المسارات وحدد وقتا نهائيا (هنا ، يتم استخدام 300 ثانية لكل تجربة).

7. التروية ، التثبيت ، تلطيخ الكيمياء المناعية ، والقياس الكمي

  1. في نهاية الدراسة (بعد 35 يوما من الجراحة ، بعد الاختبار السلوكي) ، قم بإجراء تروية الجسم بالكامل وتثبيته بمجرد أن يكون الفأر تحت التخدير العام.
    1. تخدير الماوس كما هو موضح في الخطوة 3.3. ضع الفأر المخدر بعمق في الاستلقاء الظهري.
    2. بلل الفراء بالكحول بنسبة 75٪ على المنطقة البطنية بأكملها.
    3. قم بعمل قطع أسفل القص متبوعا بشق على شكل حرف V في القفص الصدري. أمسك القفص الصدري باستخدام المشبك لكشف القلب.
    4. أدخل إبرة التسريب الوريدي في البطين الأيسر ، ثم اقطع الزائدة الأذينية على الفور بالمقص للسماح بتدفق الدم.
    5. قم بتشغيل المضخة التمعجية لضخ المحلول الملحي في الجسم كله من خلال الدورة الدموية. قم بالتبديل من محلول ملحي إلى 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عندما يصبح السائل الخارج من الأذين الأيمن واضحا وعندما يتغير لون الكبد من الأحمر إلى الأحمر الباهت. قم بنشر 5 مل أخرى من 4٪ PFA عندما يتحرك ذيل الفأر ، ويكون الجسم متيبسا.
      ملاحظة: تأرجح ذيل الفأر هو علامة على التروية الكافية.
  2. عزل الدماغ بعد التروية داخل القلب مع 4٪ PFA
    1. اقطع رأس الماوس باستخدام مقص كبير ، ثم اقطع الجلد لكشف الجمجمة.
    2. قم بعمل قطعتين في قاعدة الجمجمة (متصلة بالرقبة) ، وقم بعمل قطع واحد على طول الخط الذي يربط العينين ، ثم قم بقص الجمجمة على طول الخيط السهمي. أمسك وجمجمة كل نصف كرة كرة وتقشيرها للخارج لكشف الدماغ باستخدام الملقط.
      ملاحظة: يجب إجراء قطع الجمجمة على طول الخيط السهمي بعناية ، وإلا فقد يتلف الدماغ وينفصل إلى أجزاء.
    3. قم بإزالة الدماغ وضعه في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل لتثبيته بعد التثبيت ، ثم انقل الدماغ إلى 30٪ سكروز حتى يغرق في القاع.
      ملاحظة: الجفاف باستخدام 30٪ سكروز ليس ضروريا إذا تم قطع الأقسام بالاهتزاز.
  3. امتصاص أي سائل زائد حول المنديل باستخدام منشفة ورقية قبل التضمين. قم بتضمين أنسجة المخ في OCT مع الوجه المنقاري على الظرف.
    ملاحظة: اتجاه العينة مهم. يجب ربط الوجه المنقاري للدماغ بالظرف للتأكد من أن حافة القطع هي الجزء الذيلي.
  4. قم بقص قسم إكليلي من DRN (4.0-4.8 مم خلف من بريجما) بسماكة 30 ميكرومتر (فواصل من أربعة أقسام) باستخدام ناظم البرد وجمع الأقسام في PBS. يحفظ في محلول الحفظ بالتبريد لقسم الدماغ (SCS) عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تحديد DRN مهم جدا. تظهر الهياكل التشريحية المتتالية في الشكل 3 أ - ح. الهياكل المميزة هي كما يلي: العطلة الجانبية للبطين الرابع (LR4V ، خط اندفاعة أحمر في الشكل 3A ، E) ، البطين الرابع (4V ، مثلث اندفاعة أحمر في الشكل 3B ، F) ، الفصيص المخيخي الثاني (2Cb ، هيكل على شكل ماسي أحمر في الشكل 3C / G) ، والقناة (Aq ، ثقب اندفاعة أحمر في الشكل 3D ، H). ابدأ في جمع الأنسجة عند ملاحظة الهياكل كما هو موضح في الشكل 3D ، H ، ثم قم بتقطيعها إلى أقسام بسمك 30 ميكرومتر (فترات من أربعة أقسام) لإنتاج 24 قسما إكليليا إجماليا. يظهر تلطيخ H & E للأقسام في (الشكل 3E - H). سيتم اختيار القسم الرابع من كل قسم من الأقسام الأربعة لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي. يتم تخزين الأقسام المتبقية في SCS. إذا كان من الصعب التعرف على الهياكل ، فإن تركيب قطعة واحدة من الأقسام على الشريحة أمر مفيد.
  5. إجراء الفحص الكيميائي المناعي كما هو موضح سابقا21،22.
  6. احسب الخلايا الإيجابية ل 5-HT على مستويات قسم مختلفة عبر DRN بأكمله باستخدام ImageJ.

8. التحليل الإحصائي

  1. استخدم البرامج الإحصائية لتحليل البيانات. عبر عن النتائج كوسيلة ± التسويق عبر محرك البحث.
  2. قم بمعالجة قيم التحليل الإحصائي عن طريق ANOVA ثنائي الاتجاه أو اختبار t غير المزاوج واعتبر الاختلافات ذات دلالة عند ** p < 0.01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في القسم الإكليلي ، يكون موقع DRN أسفل SSS والقناة مباشرة (الشكل 1B ، C) ؛ وبالتالي ، فإن استهداف DRN باستخدام الإجراءات القياسية يمكن أن يؤدي إلى نزيف حاد وارتفاع معدل الوفيات في الفئران16. لذلك ، تم إجراء الحقن التجسيمي هنا باستخدام نهج بزاوية بدلا من النهج الرأسي القياسي لتجنب تلف SSS (الشكل 1أ ، ب). لتأكيد موقع دخول الإبرة إلى الدماغ ، تم التضحية بالفئران التي تلقت حقنا تجسيمية مباشرة بعد الجراحة ، وت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول بنجاح إنتاج نموذج فأر موثوق به للخلايا العصبية السيروتونية DRN مع قابلية عالية لتكاثر الآفات ومعدل وفيات منخفض. يعد استهداف DRN مهمة معقدة ، لأنه يمكن أن يتلف SSS الموجود فوق DRN16 مباشرة ويؤدي إلى نزيف مفرط وحتى الموت14. لذلك ، تم إجراء الحقن التجسيمي عن طريق ضبط ذراع التلاعب على 30 درجة في اتجاه AP لتجنب إصابة SSS (الشكل 1أ ، ب). يؤكد مسار الإبرة الموضح أسفل القناة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين [أرقام المنحة 2017YFA0104100] ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [أرقام المنح 31771644 و 81801331 و 31930068]؛ وصناديق البحث الأساسية للجامعات المركزية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 ميكرون مرشح حقنةMilliporeSLGPRB
3 ٪ بيروكسيد الهيدروجينCaoshanhu المحدودة ، جيانغشي ، الصين
5،7-DihydroxytryptamineSigma-AldrichSML20583ug / ul ، 2ul
آلة تخدير الصغيرة المدمجةRWD Life Science Co. ، Ltdسلسلة
CryostatLeica Biosystems ، Wetzlar ، ألمانياCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L) JacksonImmunoResearch705-165-0031: 2,000
dapiSigma-AldrichD8417
desipramine hydrochlorideSigma-AldrichPHR172325 مجم / كجم
أنبوب Eppendorfجودة البلاستيك العلمي509-GRD-Q
الماعز المضاد للجسم المضاد 5-HTAbcamab660471:800
GraphPad PrismGraphpad Software Inc ، CA ، US
Hamilton Microliter حقنةهاميلتون87943
KetoprofenSigma-AldrichK1751-1G5mg / kg
L-ascorbic acidBBI Life SciencesA610021-05000.10٪
مرهم ليدوكائينTsinghua Tongfang شركة الأدوية المحدودةH20063466
مرهم العين ofloxacinShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd ، الصينH10940177
مضخة التمعجيةHuxi Analytical Instrument Factory Co.، Ltd ، شنغهاي ، الصينHL-1D
جهاز تجسيميRWD Life Science Co.، Ltd68018
فريزر درجة حرارة منخفضة للغايةHaierDW-86L388
دوامةكيلين بيلفورتكس -5
R500

المراجع

  1. Goridis, C., Rohrer, H. Specification of catecholaminergic and serotonergic neurons. Nature Review Neurosciences. 3 (7), 531-541 (2002).
  2. Zmudzka, E., Salaciak, K., Sapa, J., Pytka, K. Serotonin receptors in depression and anxiety: Insights from animal studies. Life Science. 210, 106-124 (2018).
  3. Sanchez, C., Asin, K. E., Artigas, F. Vortioxetine, a novel antidepressant with multimodal activity: review of preclinical and clinical data. Pharmacology and Therapeutics. 145, 43-57 (2015).
  4. Pae, C. U., et al. Vortioxetine, a multimodal antidepressant for generalized anxiety disorder: a systematic review and meta-analysis. Journal of Psychiatric Research. 64, 88-98 (2015).
  5. Howerton, A. R., Roland, A. V., Bale, T. L. Dorsal raphe neuroinflammation promotes dramatic behavioral stress dysregulation. Journal of Neuroscience. 34 (21), 7113-7123 (2014).
  6. Matthews, P. R., Harrison, P. J. A morphometric, immunohistochemical, and in situ hybridization study of the dorsal raphe nucleus in major depression, bipolar disorder, schizophrenia, and suicide. Journal of Affective Disorders. 137 (1-3), 125-134 (2012).
  7. Dai, J. X., et al. Enhanced contextual fear memory in central serotonin-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (33), 11981-11986 (2008).
  8. Song, N. N., et al. Reducing central serotonin in adulthood promotes hippocampal neurogenesis. Science Reports. 6, 20338(2016).
  9. Nishitani, N., et al. Manipulation of dorsal raphe serotonergic neurons modulates active coping to inescapable stress and anxiety-related behaviors in mice and rats. Neuropsychopharmacology. 44 (4), 721-732 (2019).
  10. Long, M. A., Fee, M. S. Using temperature to analyse temporal dynamics in the songbird motor pathway. Nature. 456 (7219), 189-194 (2008).
  11. Sena, L. M., et al. The dorsal raphe nucleus exerts opposed control on generalized anxiety and panic-related defensive responses in rats. Behavioral Brain Research. 142 (1-2), 125-133 (2003).
  12. Hall, F. S., Devries, A. C., Fong, G. W., Huang, S., Pert, A. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine depletion of tissue serotonin levels on extracellular serotonin in the striatum assessed with in vivo microdialysis: relationship to behavior. Synapse. 33 (1), 16-25 (1999).
  13. Lieben, C. K., Steinbusch, H. W., Blokland, A. 5,7-DHT lesion of the dorsal raphe nuclei impairs object recognition but not affective behavior and corticosterone response to stressor in the rat. Behavioral Brain Research. 168 (2), 197-207 (2006).
  14. Martin, S., van den Buuse, M. Phencyclidine-induced locomotor hyperactivity is enhanced in mice after stereotaxic brain serotonin depletion. Behavioral Brain Research. 191 (2), 289-293 (2008).
  15. Yalcin, I., Coubard, S., Bodard, S., Chalon, S., Belzung, C. Effects of 5,7-dihydroxytryptamine lesion of the dorsal raphe nucleus on the antidepressant-like action of tramadol in the unpredictable chronic mild stress in mice. Psychopharmacology (Berlin). 200 (4), 497-507 (2008).
  16. Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).
  17. Spofford, C. M., et al. Ketoprofen produces modality-specific inhibition of pain behaviors in rats after plantar incision. Anesthesia and Analgesia. 109 (6), 1992-1999 (2009).
  18. Baumgarten, H. G., Klemm, H. P., Sievers, J., Schlossberger, H. G. Dihydroxytryptamines as tools to study the neurobiology of serotonin. Brain Research Bulletin. 9 (1-6), 131-150 (1982).
  19. Graeff, F. G., Netto, C. F., Zangrossi, H. The elevated T-maze as an experimental model of anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 23 (2), 237-246 (1998).
  20. Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology (Berlin). 92 (2), 180-185 (1987).
  21. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Reports. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  22. Cao, L., et al. Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Human Serotonergic Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 131(2017).
  23. Sinhababu, A. K., Borchardt, R. T. Molecular mechanism of biological action of the serotonergic neurotoxin 5,7-dihydroxytryptamine. Neurochemistry International. 12 (3), 273-284 (1988).
  24. Jia, Y. F., et al. Abnormal anxiety- and depression-like behaviors in mice lacking both central serotonergic neurons and pancreatic islet cells. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 325(2014).
  25. Marcinkiewcz, C. A., et al. Serotonin engages an anxiety and fear-promoting circuit in the extended amygdala. Nature. 537 (7618), 97-101 (2016).
  26. Ohmura, Y., Tanaka, K. F., Tsunematsu, T., Yamanaka, A., Yoshioka, M. Optogenetic activation of serotonergic neurons enhances anxiety-like behaviour in mice. International Journal of Neuropsychopharmacology. 17 (11), 1777-1783 (2014).
  27. Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. eLife. 6, (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.