في الكشف عن الموقع من التجمع مجمع Ribonucleoprotein في C. elegans Germline باستخدام القرب الربط اساي

ملخص

يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.

الملخص

إن فهم متى وأين تحدث التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPIs) أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة البروتين في الخلية وكيفية تأثر العمليات الأوسع مثل التنمية. إن خط كريات الإيجان اتّصال Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي رائع لدراسة مؤشرات أسعار الصفحات المرتبطة بتنظيم الخلايا الجذعية وداء الميوس والتنمية. هناك مجموعة متنوعة من التقنيات المتطورة التي تسمح بالموسومة البروتينات ذات الأهمية للاعتراف بها من قبل الأجسام المضادة القياسية ، مما يجعل هذا النظام مفيدًا لتفاعلات تقدير الربط القربي (PLA). ونتيجة لذلك، فإن جيش التحرير الشعبي قادر على إظهار أين تحدث مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بطريقة مكانية وزمنية في الخطوط الجرثومية على نحو أكثر فعالية من النهج البديلة. يوصف هنا هو بروتوكول لتطبيق وتقدير هذه التكنولوجيا للتحقيق PPIs في خط الجراثيم C. elegans.

المقدمة

ويقدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات لديها تفاعلات مع الجزيئات الأخرى¹، مما يؤكد على مدى أهمية PPIs لتنفيذ وظائف بيولوجية محددة في الخلية². تعمل بعض البروتينات كمحاور تسهل تجميع المجمعات الأكبر الضرورية لبقاء الخلية¹. هذه المحاور التوسط PPIs متعددة وتساعد على تنظيم البروتينات في شبكة تسهل وظائف محددة في الخلية³. كما يتأثر تكوين مجمعات البروتين بالسياق البيولوجي، مثل وجود أو عدم وجود شركاء محددين يتفاعلون^4،وأحداث إشارات الخلايا، ومرحلة نمو الخلية.

C. يستخدم الإيغانك ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك التنمية. يتكون التشريح البسيط لهذا الحيوان من عدة أعضاء ، بما في ذلك الغدد التناسلية والأمعاء وبشرة شفافة ، مما يسهل تحليل تطور الدودة. الخط الجرثومي المقيم في الغدد التناسلية هو أداة عظيمة لدراسة كيفية نضج الخلايا الجذعية الجرثومية إلى gametes⁵ التي تتطور إلى أجنة وفي نهاية المطاف الجيل القادم من ذرية. تحتوي منطقة الطرف المنفّر من الخط الجرثومي على مجموعة من الخلايا الجذعية المجددة ذاتيًا(الشكل 1). كما الخلايا الجذعية ترك مكانة، فإنها تتقدم إلى pachytene meiotic وتتطور في نهاية المطاف إلى البويضات في مرحلة الكبار الشباب(الشكل 1). يتم تنظيم هذا البرنامج من التنمية في خط الجراثيم بإحكام من خلال آليات مختلفة، بما في ذلك شبكة تنظيمية ما بعد النسخ التي تسهلها البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs)⁶. وتتسم مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بأهمية هذا النشاط التنظيمي، حيث ترتبط الممارسات التجارية التقييدية بعوامل مساعدة أخرى لممارسة وظائفها.

هناك العديد من النهج التي يمكن استخدامها للتحقيق في PPIs في الدودة ، ولكن كل منها له قيود فريدة من نوعها. في الامطار المناعية على الجسم الحي (IP) يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين البروتينمن مقتطفات دودة كاملة; ومع ذلك، لا يشير هذا الأسلوب إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين في الفيروس المتنقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يصعب استرداد مجمعات البروتين العابرة وتتشكل فقط خلال مرحلة محددة من التطور أو في عدد محدود من الخلايا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. وأخيرا، تحتاج تجارب الملكية الفكرية إلى معالجة مخاوف إعادة الفرز المعقدة البروتينية بعد الانزل والاحتفاظ غير محددة من البروتينات على مصفوفة تقارب.

النهج البديلة للكشف في الموقع من PPIs هي المناعة المشتركة، نقل الطاقة صدى Förster (FRET)، ومكملات الفلورسيان ثنائي الجزيئية (BiFC). يعتمد المناعي المشترك على الكشف المتزامن عن بروتينين مهتمين بأنسجة الديدان الثابتة وقياس مدى التوطين المشترك للإشارة. استخدام المجهر فائقة الدقة، والتي توفر تفاصيل أكبر من المجهر القياسي^7،ويساعد على اختبار أكثر صرامة توطين البروتين المشترك وراء حاجز حيود محدودة من 200-300 نانومتر⁸. ومع ذلك ، فإن المناعة المشتركة باستخدام كل من المجهر التقليدي وفائق الدقة يعمل بشكل أفضل للبروتينات ذات أنماط التعريب المحددة جيدًا. وعلى النقيض من ذلك، يصبح أقل إفادة بكثير بالنسبة للشركاء المتفاعلين الموزعين توزيعاً. قياس لتوطين مشترك للإشارات على أساس التداخل لا يوفر معلومات دقيقة حول ما إذا كانت البروتينات في معقدة مع بعضها البعض^9,10.

وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي المشترك والمناعة المشتركة لمجمعات البروتين البروتينليست كمية، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات كبيرة. FRET و BiFC كلاهما تقنيات تستند إلى الفلورسنت. تعتمد FRET على وضع علامات على البروتينات ذات الأهمية مع البروتينات الفلورية (FPs) التي تتداخل الطيفية التي يتم فيها نقل الطاقة من FP واحد (المانح) إلى FP آخر (مقبول)¹¹. وينتج عن هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة الفلورسية للFP المقبول التي يمكن اكتشافها عند الطول الموجي للانبعاثات. ويستند BiFC على إعادة تشكيل بروتين الفلورسنت في الجسم الحي. فإنه ينطوي على تقسيم GFP إلى اثنين من شظايا تكميلية، مثل الحلزون1-10 والحلزون 11^12،والتي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات ذات الفائدة. إذا تفاعل هذان البروتينان، تصبح الأجزاء التكميلية من GFP قريبة بما يكفي من القرب لطيها وتجميعها، مما يعيد تشكيل فلوروفور GFP. ثم يلاحظ GFP المعاد تشكيله مباشرة على أنه فلورسين ويشير إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين.

على هذا النحو ، يعتمد كل من FRET و BiFC على العلامات الفلورية الكبيرة التي يمكن أن تعطل وظيفة البروتين الموسوم. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب FRET و BiFC تعبيرًا وفيرًا وقابلًا للبروتينات الموسومة للحصول على بيانات دقيقة. قد لا تكون FRET مناسبة للتجارب حيث يكون أحد الشريكين أكثر من الآخر ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية^13. يجب أيضًا تجنب التعبير المفرط في تجارب BiFC ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تجميع غير محدد¹⁴ يؤدي إلى زيادة الخلفية. تتطلب كلتا التقنيتين تحسين ظروف التعبير والتصوير للبروتينات الموسومة ، والتي قد تطيل الوقت اللازم لإكمال التجارب.

إن فحص ربط القرب (PLA) هو نهج بديل يمكن أن يعالج قيود التقنيات المذكورة أعلاه. يستفيد جيش التحرير الشعبي من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على البروتينات ذات الأهمية (أو علاماتها). ثم يتم ربط هذه الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على تحقيقات oligonucleotide التي يمكن أن تهجين مع بعضها البعض عندما ضمن مسافة 40 نانومتر (أو أقصر)¹⁵. يتم تضخيم الحمض النووي الهجين الناتج عن ذلك من خلال تفاعل PCR ، والذي يتم اكتشافه بواسطة المسابير التي تكمل الحمض النووي. وهذا يؤدي إلى بؤر التي يتم تصورها بواسطة المجهر. يمكن لهذه التكنولوجيا الكشف عن PPIs في الموقع في الأنسجة المعقدة (أي الغدد التناسلية دودة)، والتي يتم تنظيمها كخط تجميع يحتوي على خلايا في مراحل مختلفة من التطور والتمايز. مع جيش التحرير الشعبي، يمكن تصور PPIs مباشرة في الغدد التناسلية دودة ثابتة، وهو أمر مفيد للتحقيق في ما إذا كان PPIs تحدث خلال مرحلة محددة من التنمية. يقدم جيش التحرير الشعبي دقة أكبر لمؤشرات أسعار التطبيقات مقارنة بالمقالات القائمة على التعريب المشترك ، وهو مثالي لإجراء قياسات دقيقة. إذا ما استخدمت، المجهري ة فائقة الدقة لديه القدرة على توفير تفاصيل أدق حول موقع بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى داخل الخلية. ميزة أخرى هي أن بؤر الناتجة عن ردود فعل جيش التحرير الشعبي يمكن أن تحسب من قبل سير عمل تحليل ImageJ المستندة إلى، مما يجعل هذه التقنية الكمية.

تم وصف عائلة LC8 من سلاسل الضوء الدينين لأول مرة بأنها وحدة فرعية لمجمع محركات dynein¹⁶ وافترض أنها بمثابة محول بضائع. منذ اكتشافه الأولي، تم العثور على LC8 في مجمعات البروتين متعددة بالإضافة إلى مجمع محركات الدينين^{17،18،19،20.} المسح الضوئي لتسلسل البروتين التي تحتوي على التفاعل LC8 عزر¹⁹ يشير إلى أن LC8 قد يكون لها العديد من التفاعلات مع مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة^17،18،^{,19،20،21،22}. ونتيجة لذلك، تعتبر الآن البروتينات العائلية LC8 المحاور التي تساعد على تعزيز تجميع مجمعات البروتين اتّفا ً^19،22، مثل تجميع البروتينات المفككة بشكل جوهري²¹.

واحد C. elegans LC8-الأسرة البروتين، dynein سلسلة الضوء-1 (DLC-1)، وأعرب على نطاق واسع عبر العديد من الأنسجة وليس المخصب في هياكل محددة تحت الخلوية^23،,24. وبالتالي، فإن تحديد الصلة بيولوجيا ً في الحياة العضوية في الشركاء في DLC-1 في C. elegans يشكل تحدياً لعدد من الأسباب: 1) عدم هطول المناعة المشتركة يشير إلى مصدر الأنسجة حيث يحدث التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه 2) التعبير المحدود عن شركاء معينين أو تفاعلات عابرة قد تعيق القدرة على الكشف عن التفاعل عن طريق الترسيب المناعي المشترك؛ و 3) توزيع منتشر من DLC-1 يؤدي إلى تداخل غير محدد مع البروتينات الشريك المحتملة عن طريق المناعة المشتركة. وبناء على هذه التحديات، جيش التحرير الشعبي هو نهج مثالي لاختبار في تفاعلات الجسم الحي مع DLC-1.

وقد أفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع ويعمل كعامل مساعد للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة²³ (RBPs) FBF-23 وGLD-1²⁵. يدعم عملنا نموذج DLC-1 الذي يعمل كبروتين محوري ويشير إلى أن DLC-1 يسهل شبكة التفاعل التي تمتد إلى ما بعد dynein^19،22. باستخدام تقسيم السحب GST, تم التعرف على RBP DLC-1 التفاعل الجديد اسمه OMA-1²⁶. OMA-1 مهم لنمو البويضات والنضج الميوطي²⁷ ويعمل بالتزامن مع عدد من المكبوتات والمنشطات المترجمة^28. في حين يتم التعبير عن FBF-2 و GLD-1 في الخلايا الجذعية ومناطق pachytene meiotic ، على التوالي ، يتم التعبير عن OMA-1 بشكل منتشر في الخط الجرثومي من pachytene meiotic من خلال البويضات²⁷ (الشكل 1). وهذا يشير إلى أن DLC-1 تشكل مجمعات مع RBPs في مناطق مختلفة من الغدد التناسلية. كما تبين أن التفاعل المباشر بين DLC-1 و OMA-1 الذي لوحظ في المختبر لا يتم استرداده بواسطة IP في الجسم الحي. وقد استخدم جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح كنهج بديل لمزيد من دراسة هذا التفاعل في خط الجراثيم C. elegans، وتشير النتائج إلى أنه يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للتحقيق في العديد من PPIs الأخرى في الدودة.

البروتوكول

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول سلالات C. elegans التي يتم فيها وضع علامات على كل من الشركاء التفاعل المحتملين. يوصى بشدة باستخدام سلالة تحكم سلبية ، حيث لا يتوقع أن يتفاعل بروتين واحد مع علامة مع شريك آخر للتفاعل المرشح الموسوم. هنا، تم استخدام GFP وحده كتحكم سلبي لتقييم الخلفية، حيث لا يتوقع أن يتفاعل DLC-1 مع GFP في الدودة. تم استخدام OMA-1 الموسوم ة بـ GFP كسلالة تجريبية ، حيث تشير البيانات الأولية إلى تفاعل مع DLC-1. ويشار إلى سلالات نيماتودا المشتركة في التعبير عن التحكم واختبار البروتينات مع 3xFLAG الموسومة DLC-1 في هذا النص باسم 3xFLAG::DLC-1; GFP و 3xFLAG: :DLC-1; OMA-1::GFP (السلالات المتاحة عند الطلب؛ مزيد من المعلومات في جدول المواد)،على التوالي. هنا، يتم استخدام علامات 3xFLAG و GFP; ومع ذلك، قد يتم استبدال علامات أخرى طالما أن أجسامها المضادة متوافقة مع كواشف مجموعة جيش التحرير الشعبي.

1- رعاية الحيوان

1. الحفاظ على الديدان على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات التي يتم زرعها مع سلالة OP50 من الإشريكية القولونية والحفاظ على 24 درجة مئوية للتعبير الأمثل عن GFP.
2. مرور الديدان البالغة كل 2-3 أيام لنشر الديدان والاحتفاظ بها تغذية جيدة.

2. إعداد الثقافة المتزامنة

1. مزامنة الديدان عن طريق تبييض لوحة من تغذية جيدة، hermaphrodites gravid. ويرد وصف لبروتوكول التبييض في بورتا دي لا ريفا وآخرون^29. السماح للأجنة يفقس بين عشية وضحاها في أنبوب الطرد المركزي في 24 درجة مئوية في حين تنتهي الدورية على نهاية في 10 مل من الوسائط الدنيا M9 (M9) العازلة. هذا سوف تنتج ثقافة اليرقات L1 القبض.
2. احتضان أنبوب اليرقات المرحلة L1 القبض على الجليد لمدة 10 دقيقة، ثم أعلى قبالة الأنبوب مع الجليد الباردة 1x M9.
3. استخدام جهاز طرد مركزي لبيليه اليرقات في 600 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. يستنشق بعناية supernatant بحيث فقط 1-2 مل من supernatant لا يزال.
4. إعادة تعليق بيليه اليرقات واستخدام ميكروبيبيت لنقل 2 ميكرولتر من ثقافة اليرقات المعلقة إلى شريحة زجاجية. عد عدد اليرقات الموجودة لتحديد كثافة زراعة اليرقات ، والتي ستساعد في توجيه بذر الديدان في الخطوة 2.5.
   ملاحظة: كثافة 10-15 يرقات L1/1 μL تعمل بشكل جيد للبذر.
5. استخدم ميكروبيبيت لنقل حجم زراعة اليرقات اللازمة لبذر يرقات مرحلة 100-120 L1 تقريبًا على لوحة OP50 مقاس 60 مم. على سبيل المثال، البذور 10 ميكرولتر من ثقافة اليرقات التي لديها كثافة 10 يرقات L1/1 μL من الثقافة.
   ملاحظة: لا تتجاوز حجم 40 ميكرولتر لبذر اليرقات، أو السائل الزائد سوف يعطل العشب OP50. إذا تجاوز حجم الثقافة 40 ميكرولتر ، كرر الخطوات 2.3-2.4 لزيادة تقليل الحجم وزيادة كثافة زراعة اليرقات.
6. زراعة الديدان عند 24 درجة مئوية. سجل الوقت الذي يتم فيه بذر L1s على لوحة وتحقق بشكل دوري من مرحلة التطوير لتحديد الوقت المثالي للتشريح.
   ملاحظة: في 52 ساعة بعد البذر من L1s، الديدان المستزرعة في 24 درجة مئوية وعادة ما تكون في مرحلة الكبار الشباب، والتي هي المرحلة المثالية للتشريح لجيش التحرير الشعبي بلا فناد المستهدفة. ومع ذلك ، فإن الوقت الفعلي الذي تصل فيه الديدان المتزامنة إلى مرحلة الشباب البالغين قد تختلف بين السلالات ودرجة حرارة الحضانة.

3. تشريح / قذف الغدد التناسلية

ملاحظة: تشريح لقذف الغدد التناسلية ضروري لجيش التحرير الشعبي الغدد التناسلية المستهدفة للعمل بنجاح. ويمكن لهذا النهج أيضا إطلاق الأجنة، والتي تعمل أيضا باستخدام هذا البروتوكول لجيش التحرير الشعبي (انظر المناقشة لمزيد من المعلومات). بعد تشريح، يتم إصلاح كل من التحكم السلبي والعينات التجريبية وعلاجها لجيش التحرير الشعبى الصينى معا بالتوازي. ويقترح أيضا أن يتم إعداد مجموعة إضافية من العينات لغرض الفلورسنت المناعة المشتركة²³ لإثبات أنماط التعبير من شركاء البروتين ذات الاهتمام.

1. اختيار الديدان البالغة 30-40 الشباب في طبق زجاجي ووتش تحتوي على 500 ميكرولتر من 1x M9 + levamisole (2.5 mM التركيز النهائي). بعد جمع الديدان، وإزالة بعناية والتخلص من معظم وسائل الإعلام لإزالة البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان.
2. إضافة في الطازجة 500 ميكرولتر من 1x M9 + levamisole واستخدام ماصة لرسم بلطف والاستغناء عن وسائل الإعلام لشطف الديدان. إزالة بعناية والتخلص من معظم وسائل الإعلام لمسح البكتيريا التي يتم نقلها جنبا إلى جنب مع الديدان.
   1. كرر هذه الخطوة 2x-3x حتى تتم إزالة جميع البكتيريا. بعد الانتهاء من النُهُز، اترك الديدان في حوالي 100 ميكرولتر من الوسائط للحفاظ على رطوبة.
      ملاحظة: لا تدع الديدان الجلوس في وسائل الإعلام لفترة أطول من 7 دقيقة، لأن هذا سوف يضعف قذف الغدد التناسلية أثناء تشريح. إجراء الغسل اتّجاه تشريح المجهر لمراقبة إزالة الوسائط حتى لا تضيع الديدان.
3. باستخدام ماصة الزجاج أو البولي ايثيلين، نقل الديدان إلى شريحة مجهر 25 ملم × 75 ملم المغلفة مع 0.001٪ بولي-L-ليسين (الشرائح المستخدمة في هذا الإجراء لديها محيط المغلفة الايبوكسي، وترك ثلاث مساحات عمل، 14 ملم × 14 ملم لكل منهما). إزالة الوسائط الزائدة بحيث يبقى ما يقرب من 10-15 ميكرولتر من الوسائط.
4. تحت مساعدة من المجهر تشريح واستخدام اثنين من 261/2 قياس الإبر، ووضع إبرة واحدة على الأخرى بحيث ينتهي شكل زوج من مقص. باستخدام الإبر الموجهة في هذا الشكل، وقطع الديدان وراء البلعوم للافراج عن germlines. تشريح جميع الديدان في غضون 5 دقائق.
   ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية إجراء عمليات التشريح في منشور سابق من قبل جيرفايز وآرور³⁰.
5. بعد تشريح جميع الديدان، ضع بلطف قسيمة تغطية 22 مم × 40 مم فوق الشريحة بحيث تكون عموديًا على الشريحة. يجب أن تتدلى نهايات قسيمة الغطاء من الشريحة.
6. تجميد الشرائح على كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا الحفاظ على الجليد الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل. وضع بلطف قلم رصاص المبردة على رأس coverslip لمنع coverslip من أن تصبح فضفاضة بسبب التوسع الجليد.

4. التثبيت / حظر

1. عندما تكون جاهزة للتثبيت، نفض الغبار قبالة coverslips مع قلم رصاص أو أداة أخرى حادة الحواف وتراجع على الفور الشريحة في جرة تحتوي على الميثانول الطازجة الباردة الجليد (مبردة إلى -20 درجة مئوية) لمدة 1 دقيقة.
2. امسح حواف الشريحة التي تحيط بالعينة برفق بحيث يتم الاحتفاظ بالكاشف التالي بواسطة التوتر السطحي حول العينة. تطبيق 150 ميكرولتر من المثبت (2٪ الفورمالديهايد في 100 mM KH₂PO_4، درجة الحموضة = 7.2) لمدة 5 دقيقة في RT.
   ملاحظة: لقد اختبرنا أيضا ً إجراء تثبيت الميثانول/الأسيتون^31،32 ووجدنا أنه متوافق مع رد فعل جيش التحرير الشعبي.
3. المس الشريحة إلى منشفة ورقية بزاوية 90 درجة متعامدة للسماح للمثبت بالجري من الشريحة وامتصاصه في منشفة ورقية. كتلة الشرائح 2x لمدة 15 دقيقة في RT في جرة كوبلين مع 50 مل من 1x PBS/1% تريتون X-100/1% ألبوم مصل البقري (PBT/BSA).
   ملاحظة: ينصح بجرار كوبلين أو أنواع أخرى من جرار تلطيخ لهذه الخطوة المحظورة وخطوات الغسيل أدناه في الأقسام 6-9. هذه توفر كميات كافية لتبادل كفاءة من حظر أو غسل المخزن المؤقت مع العينة.
4. كتلة الشرائح مع محلول PBT / BSA التي تحتوي على مصل الماعز العادي 10٪. امسح الحواف التي تحيط بالشريحة بلطف وطبق 100 ميكرولتر من المحلول على الشريحة. احتضان لمدة 1 ساعة في RT في غرفة رطبة.
   ملاحظة: ينصح بشدة هذه الخطوة للتلطيخ مع الأجسام المضادة الأساسية αFLAG. يتم بناء الغرفة الرطبة عن طريق تأمين الماصة الزجاجية مع الشريط في الدرج للشرائح لوضع على لأنها احتضان. يتم وضع مناديل المهام المبللة(جدول المواد)في الدرج لرفع الرطوبة الداخلية للصينية لمنع التبخر. يتم تغطية الغطاء والدرج في احباط لحماية العينات من الضوء خلال الخطوات الحساسة للضوء.
5. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لـ PBT/BSA/10% NGS بالحل في إيقاف الشريحة ومسح حواف الشريحة بلطف. استخدم كاشف الحظر(جدول المواد)لمنع الشرائح. تطبيق قطرة واحدة على مساحة 14 ملم × 14 ملم. الشرائح المحتضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.

5. الحضانة الأولية للأجسام المضادة

ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج جيش التحرير الشعبي والحد الأدنى من الخلفية، قد يتطلب عامل التخفيف من الأجسام المضادة الأولية التحسين (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تثار الأجسام المضادة الأولية في المضيفين المختلفة التي تتطابق مع خصوصية الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة لجيش التحرير الشعبي.

1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح بإزاحة كاشف الحجب عن الشريحة ومسح الحواف بلطف. استخدام الأجسام المضادة المخفف(جدول المواد)لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل مساحة 14 مم × 14 مم.
2. الانضلاق في غرفة رطبة بين عشية وضحاها في 4 °C.

6. جيش التحرير الشعبي التحقيق (الأجسام المضادة الثانوية) الحضانة

ملاحظة: بالنسبة للخطوات 6-9، استخدم مخازن الغسيل A و B في RT. إذا تم تخزين المخازن المؤقتة في 4 درجة مئوية، ثم السماح لهم الحارة إلى RT قبل استخدام.

1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A(جدول المواد)في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
2. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لغسل المخزن المؤقت تشغيل قبالة الشريحة ومسح حواف بلطف. إعداد محلول 40 ميكرولتر يحتوي على مسبارPLUS وناقص اليورانيوم (مخفف 1:5 مع الأجسام المضادة المخففة). تطبيق الحل على كل مساحة 14 ملم × 14 ملم.
3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

7- الربط

1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
2. تمييع المخزن المؤقت الربط(جدول المواد)1:5 مع المياه فائقة النقاء. استخدم هذا المخزن المؤقت لتخفيف الرباط(جدول المواد)1:40 لإعداد مخزون عمل من حل الربط.
   1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للعازل الغسيل بالخروج من الشريحة ومسح الحواف بلطف. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول الربط على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

8- التضخيم

ملاحظة: استخدام الكواشف الكشف مع الفلوروبورورس الأحمر(جدول المواد)يؤدي إلى أقل قدر من الخلفية في أنسجة Elegans C. elegans.

1. غسل الشرائح 2x لمدة 5 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت A في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
2. تمييع التضخيم الأحمر المخزن المؤقت(جدول المواد)1:5 مع المياه فائقة النقاء. استخدام هذا المخزن المؤقت لتخفيف البوليمرات(جدول المواد)1:80 لإعداد مخزون العمل من محلول التضخيم وحماية من الضوء.
   1. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح للعازل الغسيل بالخروج من الشريحة ومسح الحواف بلطف. تطبيق 40 ميكرولتر من محلول التضخيم على كل مساحة 14 مم × 14 مم.
3. الانضلاق في غرفة رطبة لمدة ساعة و40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من أن الغرفة الرطبة مغطاة بالرقائق لحماية العينات من الضوء.

9. السهو النهائي

1. غسل الشرائح 2x لمدة 10 دقيقة مع 50 مل من 1x غسل المخزن المؤقت B(جدول المواد)في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة.
2. غسل الشرائح 1x لمدة 1 دقيقة مع 50 مل من 0.01x غسل المخزن المؤقت B في RT في جرة كوبلين. تعيين جرة كوبلين على شاكر المداري تعيين إلى 60 دورة في الدقيقة. يتم إعداد هذا المخزن المؤقت عن طريق تخفيف العازلة غسل B بالماء الترانقية.

10. Coverslip تصاعد

1. اسمحوا الزائد غسل المخزن المؤقت تشغيل قبالة الشريحة على منشفة ورقية ومسح قبالة أي العازلة المتبقية المتبقية على محيط الايبوكسي المغلفة من الشريحة.
2. إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة(جدول المواد)لعينة ووضع بلطف غطاء على القمة، مما يسمح للوسط تصاعد لنشر.
3. الطلاء حول حافة coverslip مع طلاء الأظافر لختم coverslip والشريحة. كن لطيفًا مع تطبيق طلاء الأظافر لتجنب تحريك قسيمة الغطاء ، والتي ستلحق الضرر بالجراثيم. دع طلاء الأظافر يصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT ، في حين أن الشرائح محمية من الضوء ، قبل مشاهدته تحت المجهر.
4. تخزين الشرائح في حاوية داكنة أو حامل شريحة، كما عينات المسمى جيش التحرير الشعبي حساسة للضوء. تقترح الشركة المصنعة أنه يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو عند 4 درجات مئوية للتخزين على المدى القصير. ستستمر الشرائح المعدة باستخدام هذا البروتوكول لمدة شهرين على الأقل عند تخزينها عند 20 درجة مئوية.

11- الحصول على الصور

1. لغرض التحديد الكمي، استخدم مجهر ًا بؤريًا لالتقاط صور للجراثيم المقذوفة التي هي في عرض واضح، غير تالف، ودون عائق. التقط كومة z من الخط الجرثومي الذي يمتد عبر الخط الجرثومي بأكمله في المستوى z ويولد صورة إسقاط قصوى لاستخدامها للكمية.
   ملاحظة: المجهر المحوري مثالي للحصول على صور جيش التحرير الشعبي وقياسها بخلفية أقل مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر epifluorescent.
   1. إذا كان الخط الجرثومي لا يصلح في مجال واحد من الرؤية، والتقاط مجالات الرؤية المتداخلة حسب الضرورة لتصوير خط الجراثيم كله. ويمكن خياطة أقصى إسقاطات هذه الصور معا في فيجي.
2. تأكد من الحفاظ على ظروف التصوير نفسها بين عينات التحكم والعينات التجريبية لتحديد عتبة عادلة ومناسبة لتحديد بؤر أثناء تحليل الصورة.
   ملاحظة: سجل ما لا يقل عن 8-10 خطوط الجراثيم من كل عينة لكل تكرار لتسهيل التحليل الإحصائي للكمية PLA. ويوصى بما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية من التحديثات لكي تحصل جيش التحرير الشعبي على نتائج كمية موثوقة ومتسقة.

12 - تحليل الصور وتقديرها كميا باستخدام فيجي/إيماج

ملاحظة: يستند سير العمل التالي إلى الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هدف 40x على المجهر المحوري، حيث يتم حفظ الصور بتنسيق .czi. يمكن الوصول إلى هذه الصور .czi والبيانات الوصفية المصاحبة لها ، بما في ذلك الأبعاد ، وفتحها في فيجي / ImageJ لمزيد من التحليل. وينبغي التحقق مما إذا كانت فيجي تقبل تنسيق الملفات المحورية من مركز الاتصال المتاح للمستخدم المحدد. إذا لم يكن كذلك ، يمكن استخدام الصور بتنسيق .tiff بدلاً من ذلك للتحليل ، ولكن المستخدم سيحتاج إلى تعيين مقياس الصورة يدويًا في فيجي / ImageJ (تحليل | تعيين مقياس). من المستحسن أن يتم تحليل جميع صور التحكم السلبية معًا أولاً لتحديد مستوى الخلفية.

1. ابدأ سير عمل التحليل من خلال تحليل جميع صور التحكم السلبية أولاً، ثم انتقل إلى العينات التجريبية. فتح صورة الإسقاط الأقصى في فيجي / ImageJ لتحليل(الشكل 2A). في حالة استخدام ملف .czi، سيتم مطالبة مربع خيارات استيراد التنسيقات الحيوية.
   1. تضمين الخيارات التالية لفتح صورتك: عرض مكدس مع متصفح البيانات; وضع اللون = ملون. يجب فتح نافذة مع الصورة الآن مع شريط شرائح للتبديل بين القنوات المختلفة التي تم التقاطها بواسطة confocal (على سبيل المثال، DAPI أو PLA).
   2. إذا كانت الصور بحاجة إلى خياطة، فقم بإنشاء تكرارات لكل قناة من كل صورة عن طريق تحديد الصورة بالماوس وتحديد مكررة لفتح النافذة المكررة. حدد رقم القناة (c) الذي يتوافق مع قناة PLA أو DAPI (على سبيل المثال، 2)واإلغاء تحديد المربع لـ Duplicate Hyperstack.
   3. مع كل من الصور لتكون مخيط مفتوحة، حدد الإضافات | خياطة | مهمل | خياطة 2D. سيتم فتح نافذة خياطة الصور 2D. حدد الصور التي سيتم استخدامها لخياطة واستخدام المعلمات الافتراضية التي تم إعدادها مسبقا في الإطار، ثم حدد موافق. ستكون الصورة الناتجة صورة تدرج رمادي مجمعة.
      ملاحظة: إذا كانت الصور الفرعية لا محاذاة تماماً، ضبط المعلمات (أي زيادة عدد القمم التي سيتم فحصها من 5 إلى 500 أو تغيير طريقة الانصهار من المزج الخطي إلى الحد الأقصى. كثافة) قد تساعد على الحصول على الصورة المطلوبة. في حين تتوفر أدوات خياطة أخرى ، يحتفظ هذا النهج بأبعاد الصورة ، وهو أمر مهم للقياس الكمي.
2. افتح مدير عائد الاستثمار (منطقة الاهتمام) عن طريق الضغط على T على لوحة المفاتيح. سيتم فتح نافذة جديدة تسمى مدير عائد الاستثمار.
3. حدد أداة المضلع من مربع مجموعة أدوات فيجي. إسقاط النقاط حول خط الجراثيم لالخطوط العريضة وتوليد عائد الاستثمار(الشكل 2B). قم بتوصيل النقطة الأخيرة بالنقطة الأولى لإنشاء عائد استثمار كامل.
   ملاحظة: بالنسبة للصور الداكنة، من المفيد ضبط التباين لتحسين رؤية الخط الجرثومي (الذي يمكن عكسه) بحيث يمكن تحديده بدقة أكبر.
   1. مباشرة بعد الانتهاء من عائد الاستثمار، انتقل إلى مدير عائد الاستثمار وحدد إضافة [t] لتخزين عائد الاستثمار. من الضروري أن يتم تحديث أي تغييرات على عائد الاستثمار بما في ذلك إضافة / إزالة النقاط أو حركة عائد الاستثمار والنقاط (حدد تحديث من مدير عائد الاستثمار) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، أو سيتم فقدانها. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل بشأن التلاعب بـ ROIs ونقاطها في دليل مستخدمي فيجي/ImageJ.
4. بمجرد تعيين اتجاه عائد الاستثمار، يمكن حفظه للرجوع إليه لاحقًا عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار في مدير عائد الاستثمار متبوعاً بالمزيد | حفظ | (ملف الاسم وتحديد الوجهة لمكان الحفظ). يمكن فتح ROIs المحفوظة في مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد المزيد | مفتوح | (حدد الملف).
5. قم بقياس المنطقة داخل عائد الاستثمار عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار من مدير عائد الاستثمار، ثم تحديد زر القياس على مدير عائد الاستثمار. سيتم فتح نافذة النتائج بمعلومات حول عائد الاستثمار، بما في ذلك المنطقة التي تغطيها في الصورة (μM²⁾(مجموعة الشكل 2B). سجل هذه المعلومات في جدول بيانات للحسابات اللاحقة.
   ملاحظة: تأكد من تعيين مقياس الصورة بشكل صحيح بحيث يتم تجميع الأبعاد الصحيحة لعائد الاستثمار. يمكن تعديل أنواع القياسات التي تم الإبلاغ عنها في مربع النتائج عن طريق الانتقال إلى التحليل | تعيين القياسات...
6. افتح صورة مكررة لقناة PLA فقط عن طريق الاختيار الأيمن لصورة PLA واختيار مكررة (الشكل 2C). سيتم فتح إطار مكرر. حدد رقم القناة (c) الذي يتوافق مع قناة PLA (على سبيل المثال، 2) واإلغاء تحديد المربع لـ Duplicate Hyperstack. يوصى بازدواجية هذه الصورة بحيث لا يتم تعديل الصورة الأصلية.
   ملاحظة: ستظهر هذه الخيارات فقط عند عرض الصور التي تحتوي على قنوات متعددة على فيجي/ImageJ. نهج بديل هو تقسيم القنوات صورة | اللون | تقسيم القنوات، ولكن هذا سوف يعدل ملف الصورة الأصلي.
7. مع اختيار صورة قناة جيش التحرير الشعبي فقط ، انتقل إلى الصورة | ضبط | العتبة. سيتم فتح نافذة عتبة للصورة. حدد الافتراضي كأسلوب عتبة، أحمر كلون، وتحقق من مربع الخلفية الداكنة. باستخدام المسار العلوي على النافذة ، حرك الشريط نحو اليمين حتى يتم تمييز جميع بؤر PLA بوضوح في الصورة.
   1. سجل القيمة في المربع إلى يمين المسار العلوي ودوّن القيمة المستخدمة لتعيين العتبة. حدد تطبيق في إطار العتبة لإنهاء العتبة، وسيتم تحويل الصورة إلى خلفية بيضاء مع بؤر العتبة فقط مرئية كنقاط سوداء(الشكل 2D). اختبار عتبة على العديد من صور التحكم السلبية للتأكد من أنه من المناسب لالتقاط جميع بؤر جيش التحرير الشعبي من صورة إلى صورة قبل الكمية.
      ملاحظة: لعرض بؤر العتبة كنقاط سوداء على خلفية بيضاء، انتقل إلى عملية | ثنائي | خيارات... وإلغاء تحديد مربع الخلفية الأسود. قيمة عتبة بين 30-40 هو نقطة انطلاق جيدة لتحديد جيش التحرير الشعبى الصينى في خط الجراثيم; ومع ذلك، قد تختلف القيمة المثالية اعتماداً على الخلفية.
8. لتحديد بؤر PLA، قم بتطبيق عائد الاستثمار المتولد من الخطوات 12.3-12.3.1 على صورة العتبة عن طريق تحديد اسم عائد الاستثمار من نافذة مدير عائد الاستثمار. يجب أن يظهر مخطط عائد الاستثمار على الصورة في نفس الموقع كما كان من الصورة المصدر(الشكل 2E).
   1. انتقل إلى تحليل | تحليل الجسيمات. سيتم فتح نافذة تحليل الجسيمات وتحديد المعلمات التالية: الحجم (ميكرون^2) = 0-اللانهاية،التعميم = 0.00-1.00،إظهار = لا شيء. حدد مربع التلخيص.
   2. حدد موافق، وسوف تظهر جدول ملخص مع معلومات حول العائد على الاستثمار (أي العدد الإجمالي لبؤر جيش التحرير الشعبي ، والمساحة الإجمالية التي يشغلها بؤر جيش التحرير الشعبي داخل في عائد الاستثمار ، ومتوسط حجم بؤر جيش التحرير الشعبي ، والنسبة المئوية للمساحة التي يشغلها جيش التحرير الشعبي بؤر بالنسبة لحجم العائد على الاستثمار) (مجموعة من الشكل 2E). سجل هذه القياسات في جدول بيانات.
9. كرر الخطوات 12.1-12.8 للعديد من صور التحكم السلبية باستخدام نفس العتبة.
   1. بمجرد تحليل جميع صور التحكم السلبية ، كرر الخطوات 12.1-12.8 لجميع العينات التجريبية باستخدام نفس العتبة التي تم تحديدها من قبل التحكم السلبي لتحديد وقياس بؤر PLA.

النتائج

المناعة المشتركة لكل من 3xFLAG::DLC-1; GFP و 3xFLAG: :DLC-1; كشفت OMA-1::GFP germlines مع الأجسام المضادة العلم وGFP أنماط التعبير في خط الجراثيم(الشكل 3Aii-iii, 3Bii-iii). في حين تم التعبير عن GFP في جميع أنحاء خط الجراثيم(الشكل 3Aiii)، تم تقييد التعبير OMA-1::GFP إلى أواخر pachytene والبويضات(الشكل 3Biii)²⁷. FLAG immunostain...

المناقشة

عند دراسة PPIs في خط الجراثيم C. elegans ، فإن الدقة الأعلى التي يقدمها جيش التحرير الشعبي مقارنة بالاستمناة المشتركة تسمح بالتصور والتقدير الكمي للمواقع التي تحدث فيها التفاعلات في الخط الجرثومي. وأفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع OMA-1 باستخدام في المختبر ضريبة السلع والخدمات السحب من القول²⁶; ومع ذلك، لم يتم استرداد هذا التفاعل من قبل في السحب الحي. الفلورسنت المناعة المشتركة من 3xFLAG::DLC-1; تظهر خطوط الجراثيم OMA-1::GFP تداخلًا في أنماط التعبير لـ DLC-1 و OMA-1؛ ومع ذلك،...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
16 ٪ محلول بارافورمالدهايد	خدمات المجهر الإلكتروني	15710	تستخدم لصنع حل عمل 4
٪ 1M KH2< / sub>PO4< / sub>	Sigma	P0662	إعداد مخزون عمل
1 متر 1x M9	مختلف		محضر كمخزون 10x يستخدم في 1x ؛ انظر wormbook.org للبروتوكول
1x PBS	مختلف		انظر wormbook.org للبروتوكول
26.5 إبرة قياس	Exel International	26402	الإبر المستخدمة لتشريح
BSA	Lampire	7500802
أنابيب الطرد المركزي	الحرارية العلمية	05-529C	50 مل أنبوب الطرد المركزي من خشب البلوط المستخدم في التزامن
المجهر متحد البؤر	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Coverslip لتجميد عينة	Globe Scientific	1411-10	22x40mm ، رقم 1
Coverslip لختم الشريحة	Globe Scientific	1404-15	22x22mm ، رقم 1.5
DAPI Mounting Medium لناقل التألق المناعي		H-1200
Ligase	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligase ، يأتي كجزء من مجموعة كواشف الكشف عن الموضعي Duolink Red DUO92008
التضخيم الأحمر المخزن المؤقت	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplification Red buffer ، يأتي كجزء من مجموعة كواشف الكشف في الموقع Duolink Red DUO92008
Ligation Buffer	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x Ligation Buffer ، يأتي كجزء من مجموعة كواشف الكشف في الموقع Duolink Red DUO92008
مخفف الأجسام المضادة	Sigma-Aldrich	DUO82008	مخفف الأجسام المضادة Duolink ، يأتي مع DUO92004 و DUO92002 ، ملاحظة: يمكن أيضا استخدام محلول 1x PBS / 1٪ BSA كبديل لتخفيف الجسم المضاد.
حل الحجب	Sigma-Aldrich	DUO82007	حل حجب Duolink ، يأتي مع وسيط تركيب DUO92004 و DUO92002
لوسيط تركيب PLA	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink في الموقع مع مسبار DAPI
ناقص	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink في الموقع مسبار مضاد للماوس ناقص
PLUS مسبار	سيجما ألدريتش	DUO92002	مسبار Duolink في الموقع Anti-Rabbit PLUS
Wash Buffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ wash Buffer A
Wash Buffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ wash Buffer B
Polymerase	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymerase ، يأتي كجزء من مجموعة Duolink In Situ Detection Recode Red DUO92008
مجهر epifluorescent	Leica		كاميرا DFC300G ، مجهر DM5500B
الماعز المضاد للفأر Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	الاستخدام في الساعة 1:500
الماعز المضاد للأرانب Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	الاستخدام في 1: 200
برنامج معالجة الصور	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glass Pipette	Corning	7095B-5X
Levamisole	ACROS	العضوية 187870100	إعداد مخزون عمل 250 ملي متر
الميثانول	فيشر Scientific	A454
الفأر المضاد ل FLAG	Sigma	F1804	استخدم في الساعة 1: 1000 للتألق المناعي و PLA ، قبل الكتلة مع مصل الماعز العادي الموصى به
NailPolish	LA	CNP195
Growth Medium (NGM)	مختلف		انظر wormbook.org ل بروتوكول
مصل الماعز	العادي جاكسون إيمون	005-000-121
البولي إيثيلين باستور ماصة	الكرة الأرضية العلمية	135030
بولي إل ليسين	سيجما-ألدريتش	P1524	محضر كمحلول مخزون 0.1٪ في الماء ، مخزن في -20 درجة مئوية ، ومخفف 1: 100 في الماء لتغليف الشرائح أطباق
بتري	Tritech	PD7060	بقطر 60 مم
يستخدم Thermo	Fisher	G10362	عند 1: 200 للتألق المناعي ، 1: 4000 لشرائح PLA
	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	يتم طلب الشرائح القابلة للتعقيم بثلاثة مربعات مقاس 14 × 14 مم مع قضبان حسب الطلب من خلال Fisher Scientific. تمت إضافة Poly-L-Lysine إلى الشرائح في المختبر
محلول هيبوكلوريت الصوديوم	Fisher Scientific	SS290-1
مناديل مبللة	Kimtech	34120	4.4x8.4 بوصة صواني مناديل المهام
(242 × 241 × 20 مم)	يستخدم 240845 Thermo Fisher		لصنع غرفة رطبة
Triton X-100	ACROS Organics	327372500
ماء عالي النقاء	Milli-Q		المياه فائقة النقاء التي تم الحصول عليها من نظام تنقية المياه المتكامل Milli-Q
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
& deg; C الفريزر
-80 درجة ؛ C فريزر
رقائق
سلالة OP50 E. القولونية< / em>
شريط شاكر
المداري <سلالات قوية > الديدان الخيطية المستخدمة في هذه الدراسة (كلاهما متاح عند الطلب) < / قوي>
mntSi13[pME4.1] II; unc-119 (ed3) III ؛ teIs1 [pRL475] < / em>		UMT 376	dlc-1 حفلة موسيقية :: 3xFLAG: :d lc-1: :d lc-1 3'UTR ؛ oma-1 حفلة موسيقية :: oma-1 :: GFP< / em> ؛ المرجع 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 حفلة موسيقية::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 حفلة موسيقية ::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); المرجع: هذه الدراسة