هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وغالبا ما تتعرض الكائنات الحية لبيئات متقلبة والتغيرات في التوازن داخل الخلايا، والتي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على البروتيوم وعلم وظائف الأعضاء. وهكذا، تطورت الكائنات الحية استجابات محددة ومحددة للإجهاد مخصصة لإصلاح الأضرار والحفاظ على التوازن. وتشمل هذه الآليات استجابة البروتين تكشفت من التبائص التليسفي (UPRER),استجابة البروتين تكشفت من الميتوكوندريا (الاستعراض الدوري الشاملMT),استجابة الصدمة الحرارية (HSR), واستجابة الإجهاد التأكسدي (OxSR). البروتوكولات المعروضة هنا تصف طرق الكشف عن وتوصيف تفعيل هذه المسارات وعواقبها الفسيولوجية في النيماتودا، C. elegans. أولاً، يتم وصف استخدام المراسلين الفلورسنتالنسخي ينفين على المسارات الخاصة بتوصيف خلوي سريع، أو فحص المخدرات، أو الفحص الجيني على نطاق واسع (على سبيل المثال، المكتبات RNAi أو المتحولة). بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف المقالات الفسيولوجية التكميلية والقوية ، والتي يمكن استخدامها لتقييم حساسية الحيوانات مباشرة لإجهادات محددة ، وتعمل كتحقق وظيفي من المراسلين النسخة. معا، تسمح هذه الأساليب لتوصيف سريع للآثار الخلوية والفسيولوجية من اضطرابات البروتيوات السمية الداخلية والخارجية.
المقدمة
إن قدرة الكائن الحي على الاستجابة للتغيرات في البيئة داخل الخلايا وداخلها أمر بالغ الأهمية لبقائه والتكيف معه. ويتم ذلك على المستوى الخلوي من خلال العديد من المسارات الوقائية التي تضمن سلامة الخلية. في حين أن العديد من المكونات الخلوية تخضع للضرر المرتبط بالإجهاد ، فإن إحدى المشاركات الرئيسية لاستجابات الإجهاد الخلوي هي إصلاح وحماية التوازن في البروتيوم الخلوي. ومع ذلك ، فإن تقسيم البروتينات إلى هياكل خاصة ، تسمى العضيات ، يشكل تحديًا للخلية ، حيث لا يمكنها الاعتماد على شكل مركزي واحد من مراقبة جودة البروتين لضمان طي جميع البروتينات داخل الخلية بشكل صحيح ووظيفية. لذلك ، للتعامل مع الاضطرابات في بروتيناتها ، طورت العضيات آليات مخصصة لمراقبة الجودة ، والتي يمكن أن تشعر ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ظروف النمو القياسية لدرجات الحرارة وOP50 مقابل HT115
- النمو القياسي والتوسع
- تنمو ثقافة OP50 في LB(الجدول 1)أو ما يعادلها وسائل الإعلام المفضلة ل24-48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة (~ 22-25 درجة مئوية). تنمو البكتيريا في درجة حرارة الغرفة كما OP50 هو auxotroph uracil وهناك ارتفاع معدل عودة (على سبيل المثال، المسوخ المكبوت) عندما تزرع في 37 درجة مئوية. لا ينصح بتخزين ثقافات OP50 على المدى الطويل (بحد أقصى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية).
- البذور حجم ~ 100-200 ميكرولتر من ثقافة OP50 المشبعة على لوحة NGM 60 ملم(الجدول 1)لصيانة الديدان و 1 مل من ثقافة OP50 المشبعة على لوحة 100 ملم لتوسيع الحيوانات للتجريب. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام المراسلين النصوص لقياس تفعيل استجابات الإجهاد
هنا، يتم استخدام المراسلين النسخ الفلورية، والتي بمثابة أدوات قوية لقياس تفعيل معظم استجابات الإجهاد في C. elegans. يتم دفع تعبير GFP تحت مروج الأهداف الكنسية للمنظمين الأساسيين النسخ المشاركين في الاستجابة للضغوط الخاصة بالمقصورة. تتوفر قائمة شاملة بالمراسلين النسخيين الشائعة الاستخدام في الجدول 3.
اضطراب التأكسد ER عبر البروتينا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، يتم وصف طرق استجواب استجابات الإجهاد الخلوي في C. elegans، وذلك باستخدام المراسلين النسخ الفلوري ومقالات البقاء على قيد الحياة الإجهاد الفسيولوجي. يستخدم جميع المراسلين تعبير GFP مدفوعًا تحت مروج هدف النسخ التنازلي لعوامل النسخ المشاركة في استجابات الإجهاد الخلوي المتصاعدة. استخدام hsp-4p::GFP التضمين بواسطة XBP-1s بوساطة الاستعراض الدوري الشاملER, hsp-6p::GFP التي تسيطر عليها ATFS-1 بوساطة الاستعراض الدوري الشاملMT, gst-4p::GFP تحت SKN-1 بوساطة OxSR, وh.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
R.BZ، R.BZ، مدعومة من قبل زمالة EMBO على المدى الطويل ومؤسسة لاري إل هيلبلوم. يتم دعم R.H.S من خلال منحة 5F32AG032023-02 من خلال المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ومؤسسة جلين للبحوث الطبية زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم A.F. من قبل منحة F32AG051355 من خلال NIA. يتم دعم H.K.G. من خلال منحة DGE1752814 من خلال برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم. يتم دعم M.G.M. من قبل 1F31AG060660-01 من خلال NIA. يتم دعم A.D. من قبل مؤسسة توماس وستايسي سيبل، ومعهد هوارد هيوز الطبي، و4R01AG042679-04 و 5R01AG055891-02 من NIA، و 5R01ES021667-09 من NIEHS. نشكر لاري جو، ميليسا سانشيز، نامكيت، وأنيل إسكيفل على المساعدة التقنية الكبيرة. نشكر مختبر موريموتو وCGC (بتمويل من مكتب ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | لإجهاد الميتوكوندريا |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118072 | لألواح NGM BD |
| Difco المحبب أجار | VWR | 90000-782 | لألواح NGM ثنائي |
| هيدرات كلوريد الكالسيوم | VWR | 97061-904 | لألواح NGM |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | ل RNAi |
| الكوليسترول | سيجما-ألدريتش | 57-88-5 | لألواح NGM |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | مجهزة بمصدر ضوء 488 نانومتر. |
| COPAS Cleaning | Solution Union Biometrica | 300-5072-000 | للاستخدام مع COPAS |
| COPAS غمد المحلول | الاتحاد Biometrica | 300-5070-100 | للاستخدام مع |
| COPAS | DMSO | Sigma-Aldrich | للأدوية |
| IPTG ديوكسان خال | من Denville | Scientific CI8280-4 | ل RNAi |
| LB Broth Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | للسكوب المجسم LB |
| M205FA | Leica | 10450040 | مجهزة بكاميرا CCD أحادية اللون Leica DFC3000G ، ومرشح Leica GFP القياسي (ex 395-455 ، EM 480 LP) ، وبرنامج LAS X |
| كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات | VWR | EM-MX0070-3 | لألواح NGM ، M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | لإجهاد الأكسدة / الميتوكوندريا |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر | P217-500 | لمحلول التبييض |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | VWR | EM-PX1570-2 | لألواح NGM |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | VWR | EM-PX1565-5 | ل M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | مجهزة بعدسة موضوعية Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 ، مرشح Olympus FITC القياسي (ex 470/40 ؛ em 525/50 ؛ DM 560) ، وجهاز iPad Pro للكاميرا وتشغيل برنامج ECHO |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 71289-50G | لتصوير |
| كلوريد الصوديوم | EMD Millipore | SX0420-5 | لألواح NGM ، M9 |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | VWR | 71003-472 | ل M9 |
| Tert-butyl hydroperoxide | Sigma-Aldrich | 458139 | للإجهاد |
| التأكسديالتتراسيكلين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | T7660-5G | ل RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | لإجهاد ER |
المراجع
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
