يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

14.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61001

⸱

مايو 21, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.

الملخص

وغالبا ما تتعرض الكائنات الحية لبيئات متقلبة والتغيرات في التوازن داخل الخلايا، والتي يمكن أن يكون لها آثار ضارة على البروتيوم وعلم وظائف الأعضاء. وهكذا، تطورت الكائنات الحية استجابات محددة ومحددة للإجهاد مخصصة لإصلاح الأضرار والحفاظ على التوازن. وتشمل هذه الآليات استجابة البروتين تكشفت من التبائص التليسفي (UPRER),استجابة البروتين تكشفت من الميتوكوندريا (الاستعراض الدوري الشاملMT),استجابة الصدمة الحرارية (HSR), واستجابة الإجهاد التأكسدي (OxSR). البروتوكولات المعروضة هنا تصف طرق الكشف عن وتوصيف تفعيل هذه المسارات وعواقبها الفسيولوجية في النيماتودا، C. elegans. أولاً، يتم وصف استخدام المراسلين الفلورسنتالنسخي ينفين على المسارات الخاصة بتوصيف خلوي سريع، أو فحص المخدرات، أو الفحص الجيني على نطاق واسع (على سبيل المثال، المكتبات RNAi أو المتحولة). بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف المقالات الفسيولوجية التكميلية والقوية ، والتي يمكن استخدامها لتقييم حساسية الحيوانات مباشرة لإجهادات محددة ، وتعمل كتحقق وظيفي من المراسلين النسخة. معا، تسمح هذه الأساليب لتوصيف سريع للآثار الخلوية والفسيولوجية من اضطرابات البروتيوات السمية الداخلية والخارجية.

المقدمة

إن قدرة الكائن الحي على الاستجابة للتغيرات في البيئة داخل الخلايا وداخلها أمر بالغ الأهمية لبقائه والتكيف معه. ويتم ذلك على المستوى الخلوي من خلال العديد من المسارات الوقائية التي تضمن سلامة الخلية. في حين أن العديد من المكونات الخلوية تخضع للضرر المرتبط بالإجهاد ، فإن إحدى المشاركات الرئيسية لاستجابات الإجهاد الخلوي هي إصلاح وحماية التوازن في البروتيوم الخلوي. ومع ذلك ، فإن تقسيم البروتينات إلى هياكل خاصة ، تسمى العضيات ، يشكل تحديًا للخلية ، حيث لا يمكنها الاعتماد على شكل مركزي واحد من مراقبة جودة البروتين لضمان طي جميع البروتينات داخل الخلية بشكل صحيح ووظيفية. لذلك ، للتعامل مع الاضطرابات في بروتيناتها ، طورت العضيات آليات مخصصة لمراقبة الجودة ، والتي يمكن أن تشعر بالبروتينات المطوية وتنشط استجابة الإجهاد في محاولة لتخفيف التوتر داخل تلك المقصورة. على سبيل المثال، يعتمد السيتوسول على استجابة الصدمات الحرارية (HSR)، في حين يعتمد التتشني الإندوسليعلى الإندوبلازمي (ER) والميتوكوندريا على استجابات البروتين المتكشفة الخاصة بالمقصورة (UPR). يعمل OxSR على تخفيف الآثار السامة لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يتم تشغيل كل استجابة الإجهاد في وجود تحديات الخلوية والشتائم البيئية ويحفز استجابة النسخ مصممة خصيصا. وتشمل السمات المميزة لهذه الاستجابات توليف الجزيئات التي تعيد طي البروتينات المطوية (مثل المرافقين) التي تستهدف العضية المناسبة، أو بدلا ً من ذلك، إزالة البروتينات التالفة بسبب تدهور البروتين. الفشل في تنشيط هذه الاستجابات الإجهاد يؤدي إلى تراكم البروتينات التالفة، والخلل الخلوي نشرها إلى فشل الجهازية من الأنسجة، والموت في نهاية المطاف من الكائن الحي. يتم مراجعة وظيفة وتنظيم استجابات الإجهاد المختلفة في مكان آخر1.

وقد نسبت العديد من الأفكار المتعلقة بتنظيم ونشاط استجابات الإجهاد الخلوي إلى النيماتودا، Caenorhabditis elegans،وهو كائن حي نموذج متعدد الخلايا في البحوث الوراثية. الديدان الخيطية لا تسمح فقط دراسة تفعيل استجابات الإجهاد على المستوى الخلوي، ولكن أيضا على مستوى الكائن الحي. وقد استخدمت الديدان الخيطية لدراسة آثار الاضطرابات الوراثية أو التعرض للأدوية والملوثات على نموها وبقائها. فوقت الجيل السريع، والايزوجيني، والشفافية، وقابلية القابلية للاستبصاء الوراثي، وسهولة الاستخدام أثناء التجريب تجعلها مثالية لمثل هذه الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاستجابة الفسيولوجية السريعة نسبيًا للإجهاد (بين ساعات وبضعة أيام) والحفاظ التطوري على المسارات الخلوية تجعل الديدان الخيطية أداة بارزة في دراسة مقاومة الإجهاد.

هناك نوعان من سلالات القولونية شائعة الاستخدام المستخدمة كمصدر غذائي لزراعة C. elegans: OP50 القياسية ، وهي سلالة B التي تم تنفيذ معظم التجارب تاريخيا2 و HT115 ، سلالة K - 12 التي تستخدم تقريبا لجميع تجارب RNAI3،4. من المهم أن نلاحظ أن هناك اختلافات كبيرة بين OP50 وHT115 الوجبات الغذائية البكتيرية. وقد ثبت أن النمو على هذه المصادر البكتيرية المختلفة يسبب اختلافات كبيرة في التشكيل الجانبي الأيضي ، وعدد نسخة الحمض النووي الميتوكوندريا ، والعديد من الأنماط الظاهرية الرئيسية ، بما في ذلك عمر5. وتعزى بعض هذه الاختلافات إلى نقص فيتامين B12 المرتبطة بالنمو على بكتيريا OP50, التي يمكن أن تؤدي إلى عيوب في التوازن الميتوكوندريا وزيادة الحساسية لمسببات الأمراض والضغوط. وقد ثبت أن جميع هذه الأنماط الظاهرية خففت من النمو على البكتيريا HT115, التي لديها مستويات أعلى من فيتامين B126. لذلك ، يوصى بإجراء جميع التجارب على استجابات الإجهاد الفسيولوجي على بكتيريا HT115 ، بغض النظر عن ضرورة ظروف RNAi. ومع ذلك ، نظرا لسهولة الحفاظ على الحيوانات على OP50 ، يمكن إجراء جميع النمو القياسي (أي صيانة وتضخيم الحيوانات) على OP50 ، حيث لم يتم اكتشاف اختلافات كبيرة في النماذج التجريبية الموصوفة هنا في الديدان التي يتم الحفاظ عليها على OP50 طالما تم نقلها إلى مزامنة HT115 بعد (أي من فتحة ما بعد التبييض مع أو بدون L1 الاعتقال) حتى التجريب.

هنا ، وصف توصيف نشاط استجابات الإجهاد الخلوي باستخدام طريقتين وظيفيتين. تجدر الإشارة إلى أن البروتوكولات المعروضة تركز في المقام الأول على استجابات الإجهاد الخلوي وتأثيرها على التوازن البروتيني. أولاً، يتم استخدام المراسلين الفلوريين النسخي، والتي يتم تنظيمها من قبل مروجي الجينات الذاتية التي يتم تنشيطها على وجه التحديد استجابة لضغوط خلوية مختلفة. ويستند هؤلاء المراسلين النسخ الفلوري ة على الحث النسخي لجينات محددة التي هي في الأصل جزء من استجابة الإجهاد. على سبيل المثال، يتم تنشيط HSP-4، وهو بروتين صدمة حرارية تقويم العظام إلى hSPA5/BiP المرافق البشري، على ER-stress وlocalizes إلى ER لتخفيف التوتر. في ظروف الإجهاد ER (على سبيل المثال، التعرض لتونيمايسين)، يتم تصنيع بروتين فلورسنت أخضر (GFP)، وضعت تحت تنظيم المروج hsp-4، في مستويات عالية كما يمكن تقييمها عن طريق المجهر الفلورسنت أو قياسها كميا باستخدام قياس خلايا تدفق الجسيمات الكبيرة من النيماتودا7. وبالمثل، يستخدم المروج للمرافق الميتوكوندريا، hsp-6 (orthologous لالثدييات HSPA9)، لرصد تفعيلMT8الاستعراض الدوري الشامل ، ويستخدم المروج للsperone ssp-16.2 (orthologous لجينات ألفا البلورية البشرية) لتقييم نشاط HSR9. ويسمح هؤلاء المراسلون بتوصيف سريع للمسارات التي يتم تفعيلها استجابة لمختلف الاضطرابات.

في كثير من الأحيان ، يتم تصوير المراسلين المعروضين هنا باستخدام المجهر ، والذي يوفر إخراجًا نوعيًا لتفعيل استجابات الإجهاد. ومع ذلك، في حين توفر تقنيات التصوير معلومات عن كثافة المراسلين المذكورين أعلاه وموقع نسيجهم، فإن قياسها الكمي ليس دائماً دقيقاً أو قوياً. في حين أنه من الممكن قياس تنشيط الفلورسنت باستخدام أدوات تحليل التصوير ، فإن هذه الطرق منخفضة الإنتاجية نسبيًا وحجم العينة صغير ، نظرًا للعدد المنخفض نسبيًا من الحيوانات المصوّرة. سهولة والقدرة على الحصول على كميات كبيرة من الحيوانات بسرعة جعل C. elegans نظام نموذج مثالي لقياس تفعيل المراسلين الإجهاد الفلورسنت من خلال استخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة. مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة قادر على التسجيل والتحليل والفرز استنادًا إلى الحجم والفلورسال من العديد من الحيوانات الحية. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن الحصول على كثافة الفلورسنت ، وحجمها ، وكذلك المعلومات المكانية (2D) لآلاف الديدان. يتم التحكم في النظام باستخدام FlowPilot ، والذي يسمح بالحصول على البيانات في الوقت الحقيقي وتحليل المعلمات المقاسة. هنا ، يتم تقديم طرق لكل من التصوير المجهري والتحليل الكمي باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة كطرق لقياس تنشيط استجابات الإجهاد.

أبعد من تحليل المراسل ، يمكن قياس حساسية أو مقاومة الحيوانات للإجهاد باستخدام مقيس الإجهاد الفسيولوجي. ويتحقق ذلك من خلال تعريض الحيوانات لبيئات مجهدة تنشط مسارات إجهاد خلوي محددة. هنا ، يتم توفير العديد من الطرق لقياس حساسية الحيوانات بأكملها لأنواع محددة من الضغوطات.

يتم تطبيق الإجهاد ER إلى C. elegans باستخدام العامل الكيميائي, tunicamycin, الذي يمنع N المرتبطة glycosylation, مما تسبب في تراكم البروتينات أضعاف في ER10. في C. elegans, النمو عند التعرض لتونيماشين النتائج في اضطرابات كبيرة في وظيفة الطوارئ, وانخفاض كبير في عمر11. من خلال قياس بقاء الحيوانات على لوحات تحتوي على تونياميسين ، يمكن قياس حساسية الإجهاد ER للحيوانات. على سبيل المثال، الحيوانات مع الحث UPRER خارج الرحم، وبالتالي زيادة المقاومة للبروتين الإجهاد misfolding في ER لديها زيادة البقاء على قيد الحياة على التعرض تونيماشين مقارنة مع الحيوانات البرية من النوع12.

يتم تطبيق الإجهاد التأكسدي والميتوكوندريا على C. elegans عن طريق تعريض الحيوانات للعامل الكيميائي، الباراكوات. الباراكوات هو مبيد أعشاب شائع الاستخدام ، والذي يسبب تكوين أكسيد فائق على وجه التحديد في الميتوكوندريا13. نظرًا للتوطين المحدد لأنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الميتوكوندريا (ROS) ، غالبًا ما تستخدم المقالات الباراكوات كقياس الإجهاد "الميتوكوندريا". ومع ذلك، يتم تحويل أكسيد فائق بسرعة إلى بيروكسيد الهيدروجين بواسطة ديزموتاس سوبر أكسيد الميتوكوندريا (SODs)14. يمكن أن ينتشر بيروكسيد الهيدروجين لاحقًا من الميتوكوندريا ويسبب الإجهاد التأكسدي في مقصورات أخرى من الخلية. لذلك ، فإننا نصف المقالات البقاء على قيد الحياة الباراكوات وقياس الحساسية لكل من الميتوكوندريا والأكسدة (يمكن العثور على غيرها من المؤكسدات المؤكسدة الكم15).

يتم تنفيذ المقالات الحرارية في C. elegans عن طريق وضع الحيوانات في درجات حرارة مرتفعة. درجات الحرارة المحيطة للنيماتودا ~ 15-20 درجة مئوية ويتم حث الإجهاد الحراري في درجات حرارة أعلى من 25 درجة مئوية16،17. يتم تنفيذ المقالات الحرارية عموما في درجات حرارة تتراوح بين 30-37 درجة مئوية، كما تظهر الحيوانات العيوب الخلوية الرئيسية في هذه الحرارة، ويتم الانتهاء من المقالات البقاء على قيد الحياة في غضون 24 ساعة16،,18. هنا، يتم توفير طريقتين بديلتين لأداء المقالات الحرارية: النمو عند 34 درجة مئوية والنمو عند 37 درجة مئوية. معا، يمكن استخدام البروتوكولات المعروضة هنا لأداء شاشات واسعة النطاق عند دمجها مع الجينات القياسية بالضربة القاضية باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي أو مكتبات الأدوية الكيميائية.

ويمكن تقسيم البروتوكول إلى 4 إجراءات واسعة - نمو C. elegans والتحضير للتصوير (القسمين 1 و 2)، وتصوير المراسلين النسخباستخدام المجهر الفلوري (الأقسام 3-5)، والقياسات الكمية للمراسلين الذين يستخدمون مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة (القسم 6)، والمقاييس الفسيولوجية لقياس حساسية الإجهاد في C. elegans (القسم 7).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ظروف النمو القياسية لدرجات الحرارة وOP50 مقابل HT115

  1. النمو القياسي والتوسع
    1. تنمو ثقافة OP50 في LB(الجدول 1)أو ما يعادلها وسائل الإعلام المفضلة ل24-48 ساعة في درجة الحرارة المحيطة (~ 22-25 درجة مئوية). تنمو البكتيريا في درجة حرارة الغرفة كما OP50 هو auxotroph uracil وهناك ارتفاع معدل عودة (على سبيل المثال، المسوخ المكبوت) عندما تزرع في 37 درجة مئوية. لا ينصح بتخزين ثقافات OP50 على المدى الطويل (بحد أقصى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية).
    2. البذور حجم ~ 100-200 ميكرولتر من ثقافة OP50 المشبعة على لوحة NGM 60 ملم(الجدول 1)لصيانة الديدان و 1 مل من ثقافة OP50 المشبعة على لوحة 100 ملم لتوسيع الحيوانات للتجريب.
    3. اسمحوا لوحات الجافة بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء.
      ملاحظة: قد تحتاج لوحات 100 مم إلى مزيد من الوقت لتجف، خاصة إذا كان استخدام لوحات غير تنفيس. تخزين جميع لوحات C. elegans في حاويات ضيقة الهواء المخزنة في 4 درجات مئوية. لا تستخدم لوحات الماضي 6 أشهر من العمر كما سوف يحدث جفاف لوحات، والتي سوف تغير فسيولوجيا الحيوان على لوحات بسبب الضغط التنازوي مختلفة وتصلب لوحات.
    4. للصيانة القياسية، قم بنقل 10-15 من الحيوانات الصغيرة (البيض أو L1 أو L2) على لوحة 60 مم، على الرغم من أنه يمكن نقل المزيد إذا كان التعامل مع المسوخ أو الحيوانات المعدلة وراثياً مع انخفاض البراز. بالنسبة للحيوانات التي بها عيوب في النمو أو البراز ، قم بقطع مجموعة أكثر متغيرة من الحيوانات لمنع فقدان المخزون. إذا تم الاحتفاظ بها عند 15 درجة مئوية ، فانتقل الحيوانات كل أسبوع ؛ لمدة 20 درجة مئوية، نقل الحيوانات كل 3-4 أيام.
    5. إجراء ذوبان جديد للحيوانات كل 25-30 ممرًا (~ 6 أشهر إذا تم نقل الحيوانات مرة واحدة في الأسبوع والاحتفاظ بها عند 15 درجة مئوية).
    6. للتوسع، اقطع لوحة كاملة من 60 مم على لوحات 100 مم للتوسع. كإطار مرجعي ، يمكن أن يكون للحيوانات ذات البراز البرية لوحة كاملة 60 مم مقطعة إلى 4ths-6ths ويتم تقطيعها على لوحة كبيرة في 20 درجة مئوية لمدة يومين أو 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام لإنشاء لوحة كاملة 100 مم دون الوصول إلى المجاعة.

2. التدريج / تزامن الديدان باستخدام التبييض

  1. بروتوكول التبييض لمزامنة الديدان
    1. غسل الديدان الغرفية (الكبار الكامل للبيض) قبالة لوحات أجار باستخدام M9(الجدول 1). تبدأ من مجموعة غير متزامنة من الديدان (أي الديدان المنقطعة من الخطوة 1.1.6) إلى التبييض للتجارب ، حيث قد يحدث انجراف وراثي كبير في جولات متتالية من التزامن عبر التبييض.
    2. نقل خليط دودة / M9 في أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة زجاجية؛ يمكن جمع العديد من لوحات الديدان في أنبوب مخروطي واحد 15 مل.
    3. تدور الحيوانات إلى أسفل لمدة 30 s في 1000 × ز. يستنشق M9 supernatant. ليس من الضروري غسل البكتيريا المتبقية ما لم يكن هناك كمية فظيعة من التلوث أو كتل كبيرة من البكتيريا. إذا كان هذا هو الحال، تنفيذ العديد من السُهب مع M9.
    4. إعداد مخزون جديد من محلول التبييض(الجدول 1). يمكن الاحتفاظ محلول التبييض لعدة أيام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية ، ولكن استخدام محلول التبييض الطازج لأن التبييض غير الفعال يمكن أن يؤدي إلى تبييض غير متساوٍ ، مما سيسبب تلفًا للبيض قبل القضاء على جميع جثث الديدان.
    5. إضافة 2-10 مل من محلول التبييض للحيوانات (~ 1 مل من محلول التبييض لكل ~ 0.1 مل من بيليه الحيوان). عكس خليط التبييض والديدان ل ~ 5 دقيقة (لا تتجاوز 10 دقيقة؛ لاحظ أن أوقات التبييض قد تختلف ويجب أن تُقيّم خصيصا لكل مختبر). يهز بقوة للمساعدة في حل جثث الديدان بشكل أسرع والحفاظ الأمثل على البيض. ننظر دوريا تحت المجهر تشريح أو وضع أنبوب مخروطي على ضوء لمراقبة عندما تكون جثث دودة الكبار قد ذابت تماما والبيض فقط لا تزال في الأنبوب.
    6. بيليه البيض عن طريق الغزل في 1000 × ز لمدة 30 ق ومن ثم تستنشق supernatant. يمكن طرد البيض بشكل أسرع من الديدان دون تعطيل سلامتها، لذلك إذا لم يكن متأكدًا من سرعة الطرد المركزي، يمكن نسج البيض عند ما يصل إلى 2500 × غرام دون التأثير على فسيولوجيا.
    7. إضافة M9 تصل إلى 15 مل وعكس الأنبوب لمسح التبييض قبالة البيض.
    8. كرر الخطوات 2.1.6-2.1.7 (عملية الغسيل / بيليه) 2-3 مرات أخرى لإزالة التبييض.
    9. البيض Pipet / M9 مزيج على لوحات وتنمو في 15-20 درجة مئوية للتجريب. للحصول على قياس لعدد الديدان التي يجب استخدامها، قم بإجراء عدد بيض تقريبي عن طريق الأنابيب 5 ميكرولتر من خليط البيض على لوحة أو شريحة أجار وتقسيم عدد البيض على 5 لتحديد عدد البيض لكل 1 ميكرولتر من الحجم. متوسط 3 التهم المستقلة قد يحسن الدقة. لتجنب المجاعة ، يتوفر جدول من أعداد البيض الموصى بها لكل لوحة في الجدول 2.
    10. إذا لزم الأمر، L1 اعتقال الحيوانات لمزامنة زمنية أكثر إحكاما عن طريق وضع البيض / M9 مزيج في دوار في 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. بالنسبة للحيوانات البرية، لم يتم اكتشاف أي عيوب في فسيولوجيا الحيوانات عند اعتقال L1 لمدة تصل إلى 48 ساعة. ومع ذلك ، المسوخ التي هي حساسة للمجاعة (على سبيل المثال ، المسوخ الليسوسوم أو autophagy) تفعل سيئة للغاية مع L1 اعتقال ، وبالتالي لا ينصح لأداء هذه الطريقة التزامن للمسوخ التي من المعروف أن تكون حساسة للمجاعة. إذا كان هناك حاجة إلى مزامنة أكثر إحكامًا للحيوانات التي لا يمكن القبض عليها L1، فاستخدم طريقة وضع البيض الموضحة في القسم 2.2.
  2. بروتوكول وضع البيض لمزامنة الديدان
    ملاحظة: كطريقة بديلة للتبييض، يمكن إجراء فحص وضع البيض. يتم استخدام وضع البيض عندما لا يوفر تبييض الحيوانات تزامنًا قريبًا بما فيه الكفاية ، حيث يمكن أن يكون البيض داخل كيس البيض للحيوانات البالغة مختلفًا مثل 8-12 ساعة. بالنسبة للنماذج التجريبية حيث من الأهمية بمكان أن تكون الحيوانات على مقربة قدر الإمكان ، ولكن حيث لا يمكن اعتقال L1 (على سبيل المثال ، في المسوخ التجويع) ، يوصى بكتابة البيض. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه بسبب العمالة المشاركة في بروتوكول وضع البيض ، فمن غير المجدي إجراء تجارب عالية النطاق.
    1. ضع 4-12 من البالغين الغراميد (انظر ملاحظة بعد الخطوة 2.2.2) على لوحة NGM OP50 القياسية أو HT115 -seed (انظر القسم 1 أعلاه للحصول على توصيات بشأن السلالات البكتيرية). اعتمادا على حجم التجارب، يمكن استخدام لوحات متعددة. تأكد من توثيق بعناية كم عدد الحيوانات على كل لوحة للخطوة 2.2.
    2. وضع الحيوانات في درجة الحرارة المطلوبة للتجارب (15-20 درجة مئوية) لمدة 4-8 ساعة.
      ملاحظة: عدد الساعات التي تترك الحيوانات على لوحة ستحدد مدى تزامن البيضة الأولى وضعت وبيضة وضعت الماضي سيكون، لذلك يمكن تعديل التوقيت حسب الحاجة. وبما أن أوقات الحضانة الأقصر ستعني أن كل الحيوان لديه وقت أقل لوضع البيض ، يجب وضع المزيد من الحيوانات على لوحات لضمان وضع ما يكفي من البيض. في حين أن معدل زرع البيض الفعلي لم يتم تطبيعه بالكامل بسبب ميل الحيوانات إلى المرور برشقات قصيرة من وضع البيض بدلاً من معدل طبيعي لوضع البيض ، يمكن تقدير متوسط معدل البيض المزروع لكل الحيوان بـ ~ 5 بيض / ساعة للحيوانات التي تظهر برازية من النوع البري19. عند محاولة زراعة الحيوانات إلى مرحلة الكبار اليوم 1، والوقت البيض وضع أن يكون < 100 بيضة لكل لوحة لتجنب المجاعة (راجع الجدول 2 لمزيد من التفاصيل حول الحيوانات الموصى بها لكل لوحة).
    3. إزالة الحيوانات البالغة من لوحات. تأكد من إزالة جميع الحيوانات البالغة من الأطباق ، حيث ستستمر الحيوانات في وضع البيض وتؤدي إلى عدم تزامن السكان و / أو تجويع اللوحة.

3. ظروف نمو الديدان لتصوير المراسلين النسخ

  1. نمو الديدان
    1. الثقافة البكتيرية Inoculate HT115 إيواء pL4440 RNAi plasmid (EV) و / أو تحمل كاسيت RNAI ضد الجينات المستهدفة المطلوبة (ق) في وسائل الإعلام LB تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل carbenicillin و 20 ميكروغرام / مل التتراسيكلين.
    2. تنمو الثقافة بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) إلى التشبع في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية.
    3. بقعة 60 ملم NGM RNAI لوحات مع 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المشبعة و100 ملم NGM RNAI لوحات مع 1000 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية المشبعة. اسمحوا الجافة في درجة الحرارة المحيطة (~ 22 درجة مئوية) بين عشية وضحاها في الظلام (مغطاة بشكل فضفاض مع رقائق الألومنيوم).
    4. ضع مجموعة متزامنة من الديدان المعدلة وراثيا ً التي تحمل مراسلين فلوريين (انظر الجدول 3 للحصول على قائمة كاملة) على لوحات NGM RNAi المصنفة بالبكتيريا المفضلة.
    5. تنمو في 15-20 درجة مئوية إلى المراحل المطلوبة لمراسلين محددين على النحو المبين أدناه.
  2. اعتبارات التدريج من الديدان للتجارب
    1. إجراء تجارب للمراسلين النسخ ية في اليوم الأول من مرحلة البلوغ، باستثناء المقالات التي تتطلب الحيوانات L4. وفقا لWormAtlas ، يتم الحصول على الحيوانات L4 ما يقرب من 2.5 أيام (~ 56 ساعة) من النمو في 20 درجة مئوية من مرحلة البيض(www.wormatlas.org).
    2. بالنسبة لـ "اليوم 1 البالغين"، استخدم الحيوانات في حوالي 3-4 أيام (~ 65-96 ساعة) من النمو عند 20 درجة مئوية بعد طلاء البيض.
      ملاحظة: يتم شرح هذه المجموعة الواسعة على النحو التالي: ~ 65 ساعة في 20 درجة مئوية هو عندما تصل الحيوانات إلى "زرع البيض"، وهي حالة "البلوغ" الحقيقية. 96 ساعة هو عندما تدخل الحيوانات ما يصفه WormAtlas بأنه "أقصى حد للبيض"، وهو عندما يكون الشخص البالغ شخصًا بالغًا مرغوبًا فيه ولديه كيس بيض كامل. هذا هو عندما توصف الحيوانات بأنها أقدم من اليوم 1 ويمكن أن تبدأ في عرض الاختلافات، وبالتالي ينصح جميع البروتوكولات المذكورة هنا للبدء في هذه المرحلة "اليوم 1" بدءا من أقرب إلى 65 ساعة وأواخر 96 ساعة. بالنسبة للمقالات الموصوفة هنا ، لم يتم ملاحظة اختلافات كبيرة عند استخدام الحيوانات في هذه النافذة ~ 65-96 ساعة.
    3. لتكرار تجربة واحدة، استخدم نقطة زمنية مماثلة للاستنساخ أكثر قوة (على سبيل المثال، تنفيذ جميع التجارب في ~ 65 ساعة أو ~ 96 ساعة بعد طلاء البيض).
      ملاحظة: بعض الحيوانات المعدلة وراثيا والمسوخ عرض معدلات النمو تباطأ. ولهذا الغرض، توجد توصيتان. 1) استخدام التزامن متداخلة، حيث يمكن تبييض الحيوانات في أوقات مختلفة من أجل التجريب ليتم إجراؤها في نفس الوقت. ويوصى بذلك عندما يكون التغير التقني في المنزى أكبر من التقلبات التقنية التي قد تنشأ عن التزامن (على سبيل المثال، قد تعاني من المدد المناجزة للبقاء على قيد الحياة، والتي تستمر لفترات طويلة إذا لم يتم تنفيذها في وقت واحد). 2) استخدام تحليل متداخلة، حيث يمكن تبييض الحيوانات في نفس الوقت، ولكن يتم إجراء الفحص نفسه في أوقات مختلفة. يوصى بذلك للمقالات البسيطة للغاية التي ليس لها تباين متأصل (على سبيل المثال ، تعريف الحمض النووي لاستجابات الإجهاد).

4- تحريض استجابات الإجهاد

  1. استخدام hsp-4p::GFP كقراءة لتفعيل الاستعراض الدوري الشاملER
    1. تحفيز الإجهاد ER باستخدام RNAI
      1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI استهداف الجينات ذات الفائدة على لوحات NGM RNAI(الجدول 1)كما هو الحال في القسم 3. استخدام EV كتحكم لمستوياتER الاستعراض الدوري الشامل القاعدية وضربة RNAi من العلامة-335 (إنزيم لglycosylation N المرتبطة من البروتينات المقيمة في ER; RNAi الضربة القاضية لها آثار مماثلة لعلاج تونيماشين) كتحكم إيجابي لتفعيل الاستعراض الدوري الشاملER تحت الإجهاد ER.
      2. مزامنة hsp-4p::GFP مراسل الحيوانات باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
      3. بيض اللوحة على لوحات RNAi باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 2.
      4. يُضن البيض على درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام تقريبًا (~ 65-96 ساعة) لإجراء التجارب في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. بالنسبة لتجارب الاستعراض الدوري الشاملER، هناك اختلافات في الفلورسال القاعدي لمراسل hsp-4::GFP عندما يزرع في درجات حرارة مختلفة. لذلك، قم بإجراء كافة التجارب عند 20 درجة مئوية.
    2. حث إجهاد ER باستخدام عامل كيميائي
      1. مزامنة hsp-4p::GFP مراسل الحيوانات باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2 وتنمو في 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة L4. نقل الحيوانات إلى أنبوب M9. السماح للديدان لتسوية (~ 2-3 دقيقة عن طريق الجاذبية أو تدور 30 ق في 1000 × ز)،ومن ثم إزالة M9.
      2. تمييع tunicamycin إلى 25 نانوغرام / مل في M9 (1:40 تخفيف من 1 ملغ / مل الأسهم). كعنصر تحكم، كما تمييع حجم مكافئ من DMSO في M9.
      3. إضافة 25 نانوغرام / مل tunicamycin /M9 أو التحكم في حل DMSO / M9 للديدان (استخدام 400-500 مل لأنبوب 1.5 مل أو 2 مل لأنبوب مخروطي 15 مل). احتضان في 20 درجة مئوية على منصة دوارة لمدة 3-4 ساعات.
        ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تخفيف تونيماشين مباشرة في مزيج دودة / M9.
      4. السماح للديدان لتسوية، وإزالة محلول M9/TM، وغسل مع 1 مل من M9.
      5. نقل الحيوانات إلى لوحات NGM أو لوحات NGM RNAI والسماح لاستعادة بين عشية وضحاها (أو ~ 15-20 ساعة) والوصول إلى اليوم 1 من مرحلة البلوغ في 20 درجة مئوية قبل إجراء المجهر الفلورسنت (القسم 5). يتم إجراء الانتعاش بين عشية وضحاها للسماح لمستوى يمكن الكشف عنها من GFP تتراكم.
      6. بدلا من ذلك، حث hsp-4p::GFP عن طريق نقل الحيوانات L4 إلى لوحات أغار تحتوي على 25 نانوغرام/ ميكرولتر tunicamycin لمدة 16-24 ساعة. هذا لديه تحريض أقوى بكثير من hsp-4p::GFP بسبب المدة الأطول من الإجهاد، وبالتالي فإن النطاق الديناميكي أقل بكثير من الإشباع المذكور أعلاه.
  2. استخدام hsp-6p::GFP كقراءة لتنشيطMT UPR
    1. تحفيز الإجهاد الميتوكوندريا باستخدام RNAI
      1. تنشيط UPRMT باتباع نفس البروتوكول كما القسم 4.1.1، باستثناء استخدام الضربة القاضية RNAI من الجينات الميتوكوندريا، مثل cox-5b/cco-1 (سيتوكروم c oxidase وحدة فرعية 5B؛ الضربة القاضية يمنع نشاط سلسلة نقل الإلكترون). لتنشيطMT UPR من خلال الاضطرابات في وظيفة سلسلة نقل الإلكترون، RNAi الضربة القاضية تحتاج إلى القيام بها خلال التنمية المبكرة20. لذلك، تنفيذ RNAi من فتحة لهذه التجارب.
    2. تحفيز الإجهاد الميتوكوندريا باستخدام عامل كيميائي
      1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI تستهدف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115 حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر القسم 1). تأكد من أن كلا من لوحات NGM RNAi (أو NGM RNAi + DMSO0.2) وNGM RNAi + لوحات antimycin A(الجدول 1)كلاهما على استعداد للخطوة 4.2.2.5.
      2. مزامنة hsp-6p::GFP أو hsp-60p::GFP مراسل الحيوانات باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
      3. بيض الصفيحة على لوحات مبذرة من اختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 2. منذ حل antimycin A في DMSO، تنمو الحيوانات على NGM RNAi + لوحات DMSO0.2 من فتحة.
      4. يُضن البيض على درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة يومين (~ 56 ساعة) إلى مرحلة L4. بدلا من ذلك، تنمو الحيوانات في 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام (~ 75 ساعة) بدلا من ذلك.
      5. نقل الديدان من NGM RNAi + لوحات DMSO0.2 إلى NGM RNAi + لوحات أنتيميسين A أو NGM RNAi + لوحات DMSO0.2 كجهاز تحكم. يمكن نقل الديدان يدويًا مع اختيار للتجارب الصغيرة النطاق ، ولكن للتجارب واسعة النطاق ، نوصي بغسل الحيوانات باستخدام M9 ، والاستقرار مع الطرد المركزي ، وaspirating M9 ، ثم الطلاء على NGM RNAi + لوحات antimycin A.
      6. الديدان الحاضنة ل ~ 20 ساعة إضافية والصورة في اليوم 1 الكبار (القسم 5).
  3. استخدام GST-4p::GFP كقراءة لاستجابة الإجهاد التأكسدي.
    1. تحفيز Oxsr باستخدام RNAI
      1. بدلا من ذلك، حث GST-4p::GFP باستخدام RNAi-knockdown من wdr-23 (فإنه ترميز المنظم السلبي من skn-1؛وبالتالي، فإن الضربة القاضية لها يحفز OxSR) باستخدام البروتوكول الموصوف في القسم 4.1.1.
    2. حث OxSR باستخدام التعرض للأكسدة الكيميائية تيرت بوتيل هيدروبيروكسيد (TBHP)
      1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI تستهدف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115 حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر القسم 1).
      2. مزامنة gst-4p::GFP مراسل الحيوانات باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
      3. بيض الصفيحة على لوحات مبذرة من اختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 2. تأكد من إعداد لوحات أكثر من اللازم لأن بروتوكول العلاج من المخدرات يؤدي إلى فقدان > 10-20٪ من الحيوانات. للتصوير، ابدأ بـ > 100 الحيوانات، وللفرز، ابدأ بـ (1000) الحيوانات.
      4. يحضن البيض في 20 درجة مئوية لمدة يومين (~ 56 ساعة) إلى مرحلة L4. بدلا من ذلك، تنمو الحيوانات في 15 درجة مئوية لمدة 3 أيام (~ 75 ساعة) بدلا من ذلك.
      5. غسل L4 الحيوانات قبالة لوحات وتقسيمها إلى اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل لكل شرط. حجم النُقاة إلى 1 مل على الأقل وإضافة حجم متساوٍ من 2 mM TBHP الطازجة. استخدام إجمالي حجم السائل إلى ما لا يقل عن 2 مل، كما يمكن أن يسبب انخفاض وحدات التخزين وفاة كبيرة من الديدان عند الغزل. لا تغسل قبل العلاج الدوائي ، حيث أن البكتيريا المتبقية من اللوحات ستساعد على ضمان عدم التجويع أثناء الحضانة.
      6. الديدان الحاضنة على الدوار لمدة 4 ساعة عند 20 درجة مئوية.
      7. غسل الديدان عن طريق الغزل في 1000 × ز، aspirating M9 + مزيج TBHP ، واستبدال مع 15 مل من M9. كرر لغسل الثانية.
      8. الديدان لوحة على EV RNAI لاسترداد بين عشية وضحاها (~ 16-24 ساعة) في 20 درجة مئوية. يمكن استرداد الديدان على مطابقة RNAI من الاختيار ، ولكن لم يتم رؤية اختلافات كبيرة عند استردادها على EV RNAI ، لذلك يمكن القيام بذلك لسهولة الإعداد التجريبي. التقاط صور للبالغين اليوم 1 بعد الانتعاش.
        ملاحظة: يتم إجراء استرداد بين عشية وضحاها للسماح لمستوى قابل للكشف من GFP للتراكم. وبدون هذا الانتعاش، لا توجد إشارة GFP قابلة للكشف. إذا كان الاسترداد على المدى القصير مرغوبًا فيه، فمن الممكن استخدام النسخة الموضحة في القسم 4.3.3.
    3. حث OxSR باستخدام التعرض للباراكات المؤكسد الكيميائي (PQ)
      1. كرر جميع الخطوات في القسم 4.2.2 للحصول على 2 دفعات من L4 GST-4p:: GFP الحيوانات في أنابيب مخروطية 15 مل لكل شرط.
      2. حجم النُقاة إلى 1 مل على الأقل وإضافة حجم متساوٍ من 100 ميكرومتر PQ الطازجة. على غرار 4.3.2.5 ، يوصى بحجم لا يقل عن 2 مل.
      3. الديدان الحاضنة على الدوار لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية.
      4. غسل الديدان عن طريق الغزل في 1000 × ز، aspirating M9 + مزيج PQ ، واستبدال مع 15 مل من M9. كرر لغسل الثانية.
      5. الديدان لوحة على EV RNAI لاسترداد لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية، ومن ثم التقاط الصور مباشرة بعد الانتعاش.
        ملاحظة: 2 ح من الانتعاش كان الحد الأدنى من الانتعاش المطلوبة لتصور التعريفي GFP.
  4. باستخدام hsp-16.2p::GFP و hsp-70p::GFP كقراءة لتنشيط HSR.
    1. تحفيز HSR باستخدام التعرض لدرجات حرارة مرتفعة
      1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI تستهدف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115، حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر مقدمة).
      2. مزامنة hsp-16.2p::GFP أو hsp-70p::GFP مراسل الحيوانات باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
      3. بيض الصفيحة على لوحات مبذرة من اختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 2. تأكد من إعداد 2x عدد اللوحات اللازمة لأن نصف العينة سيتعرض لدرجات حرارة مرتفعة لتحريض الصدمة الحرارية ، والنصف الآخر سيكون بمثابة عنصر تحكم غير مصدوم بالحرارة.
      4. يُضن البيض على درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام تقريبًا (~ 65-96 ساعة) لإجراء التجارب في اليوم الأول من مرحلة البلوغ. لا تنمو الديدان في 15 درجة مئوية لتجارب الصدمة الحرارية كما لا توجد سوى اختلافات طفيفة بين الحيوانات التي تعاني من صدمة الحرارة من أصل 15 درجة مئوية مقابل 20 درجة مئوية.
      5. نقل مجموعات تجريبية من الحيوانات إلى حاضنة 34 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. لوحات مكان في الحاضنة كطبقة واحدة (أي لا تراص من لوحات) لضمان التوزيع الأسرع والأكثر مساواة للحرارة عبر لوحات.
      6. نقل الحيوانات المصدومة بالحرارة إلى حاضنة 20 درجة مئوية للتعافي لمدة ساعتين ثم الصورة على الفور (انظر القسم 5). يمكن استرداد الحيوانات لفترة أطول إذا لزم الأمر لزيادة التعريفي GFP.
        ملاحظة: 2 ح من الانتعاش كان الحد الأدنى من الانتعاش المطلوبة لتصور التعريفي GFP.

5. التصوير باستخدام مجهر ستيريو أو منخفضة التكبير واسعة الميدان / المجهر المركب

  1. إعداد الديدان للميكروسكوبية الفلورية
    1. ماصة 5-10 ميكرولتر من 100 mM الصوديوم أزيد على رأس لوحة NGM القياسية (أي لا بكتيريا).
      ملاحظة: يمكن إسقاط تركيز أزيد الصوديوم إلى أسفل منخفضة إلى 10 mM، على الرغم من أن لوحظ تكاثف أقوى في 100 mm أزيد الصوديوم مع أي تأثير يمكن الكشف عنها على إشارة الفلورسنت.
    2. تحت المجهر تشريح، واختيار 10-20 الحيوانات من لوحات تجريبية، ونقل إلى بقعة من أزيد الصوديوم. يجب على الحيوانات التوقف عن الحركة بعد وقت قصير من هبوطها في أزيد الصوديوم ، وسوف يتبخر أزيد الصوديوم نفسه في غضون ثوان.
    3. بمجرد تبخر أزيد الصوديوم ، اصطف الحيوانات لإعداد التصوير المطلوب. نقل الحيوانات جنبا إلى جنب مع الجانبين الأمامي والخلفي في نفس التوجه لجميع الحيوانات. صورة الحيوانات على الفور.
      ملاحظة: لم تلاحظ أي تغييرات في إشارة المراسل لأي من المراسلين النسخي في الجدول 3 لمدة تصل إلى 15 دقيقة بعد الشلل في أزيد الصوديوم.
  2. الحصول على صورة باستخدام ستيريومغيرر
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم استخدام مجهر لايكا M205FA المجهز ة بكاميرا CCD أحادية اللون من لايكا DFC3000G، وفلتر لايكا GFP القياسي (395-455، EM 480 LP)، وبرنامج LAS X. يمكن العثور على الإعدادات الموصى بها لأوقات التعرض في الجدول 4.
    1. إطلاق برنامج LAS X.
    2. بدء مشروع جديد: افتح علامة التبويب الاستحواذ، وانقر على المشاريع المفتوحة وانقر فوق مجلد لفتح مشروع جديد. يمكن إعادة تسمية هذا المشروع بالنقر بزر الماوس الأيمن على المجلد والتمرير لأسفل إلى إعادة تسمية أو النقر فوق F2. في علامة التبويب الاستحواذ ، هناك أيضًا خيارات لضبط وقت التعرض والتكبير إلى الإعدادات المطلوبة.
    3. ضع عينة الدودة تحت هدف المجهر وحدد النقطة المحورية الصحيحة للديدان باستخدام إعداد الحقل الساطع لتقليل ابيضاض الفلورسنت. مركز العينة هو المكان الذي يكون فيه خط البيض مرئيًا بوضوح وليس غامضًا. قم بتعيين وقت التعرض والتكبير والتركيز والمكثفات ذات المجال الساطع إلى الإعدادات المطلوبة.
    4. الحصول على صورة باستخدام زر التقاط الصورة.
    5. حفظ الصورة في تنسيق .lif (لايكا ملف الصورة) لأن هذا يحفظ جميع الصور الخام والبيانات الوصفية. يمكن أيضًا تصدير TIFF عن طريق النقر على الصورة (أو المشروع) مباشرةً، وتحت خيار الحفظ كخيار، انقر فوق TIFF. سيؤدي ذلك إلى تخزين جميع القنوات (على سبيل المثال، المجال الساطع وGFP) مع أي تعديلات (على سبيل المثال، إذا تم تعديل التباين، سيتم حفظ هذا في TIFF).
  3. التحليل الكمي للصور الفلورية
    1. إذا كان سيتم إجراء تحليل كمي، فخذ صورًا ثلاثية الأبعاد. يتم تنفيذ ذلك بالنقر على خيار z-section المسمى بـ "z" في أعلى اليمين. ستكون المقاطع Z نشطة إذا كان هذا المربع أحمر.
    2. تحسين مقاطع z عن طريق تحديد سمك النطاق والشريحة في أسفل اليسار من الخيارات القابلة للتعديل. كلما كان ذلك ممكناً، استخدم الزر الأمثل للنظام للإعدادات المثلى.
    3. التقط الصورة واحفظ الصورة كما هو موضح أعلاه في القسم 5.2. اصطف الديدان مع مسافات بينهما لقياسات أسهل.
    4. استيراد صور TIFF إلى برنامج التصوير المفضل (على سبيل المثال، ImageJ).
    5. لImageJ، من القائمة تحليل، اختر تعيين القياسات. تحقق مما يلي: المنطقة، متوسط القيمة الرمادية، الكثافة المتكاملة، تسمية العرض.
    6. باستخدام أداة عائد الاستثمار (منطقة الاهتمام) ، رسم عائد الاستثمار. قياس كل دودة على حدة. من قائمة التحليل، اختر قياس أو اضغط على M. رسم عائد الاستثمار في الخلفية حيث لا توجد ديدان، ومن ثم قياس الخلفية بنفس الطريقة. نسخ أو حفظ القياسات التي تظهر في إطار النتائج.
    7. طرح الكثافة المتكاملة للخلفية من الكثافة المتكاملة لكل عائد استثمار مقاس. يتم تعريف كثافة الخلفية لعائد الاستثمار على أنها منتج متوسط القيمة الرمادية للخلفية ومساحة عائد الاستثمار المسحوب.
  4. الحصول على صورة باستخدام مركب / المجهر واسعة المجال
    ملاحظة: لتصوير المراسلين النسخ باستخدام المجهر مركب / حقل واسع، يستخدم هذا البروتوكول مجهر ECHO 4 تدور مجهزة أوليمبوس 4x خطة فلوريت NA 0.13 عدسة موضوعية، وهو مرشح أوليمبوس FITC القياسية (على سبيل السابقة 470/40؛ em 525/50؛ DM 560)، وتطلب الشركة برو للكاميرا ولقيادة برنامج ECHO. يمكن العثور على الإعدادات الموصى بها لأوقات التعرض في الجدول 4.
    1. استخدم لوحة اللمس لإطلاق برنامج التحكم. إنشاء ألبوم جديد واسم ملف جديد.
    2. لوحة الموقف تحت العدسة الهدف. تعيين وقت التعرض وشدة الفلورسين باستخدام خط الأساس (EV / علاج التحكم) والتحكم الإيجابي ، بحيث تكون الإشارة مرئية ولكنها غير مشبعة.
    3. حفظ صورة حقل مشرق وصورة GFP / FITC.

6- القياسات الكمية للمراسلين الذين يستخدمون مقياس الذائب ة الجسيمات الكبيرة

ملاحظة: يمكن لنمو وإعداد الديدان لتحليل مقياس مسيومتر التدفق الكبير للجسيمات اتباع نفس النماذج مثل الأقسام 1-5 لإعداد الديدان للتصوير الفلوري، باستثناء أن هناك حاجة إلى عدد أكبر من الحيوانات. استخدام > 500 الحيوانات في حالة، كما يتم فقدان بعض الحيوانات أثناء التلاعب، وليس كل الحيوانات تمرير معايير التصفية أثناء القياس الكمي، وبعض الحيوانات لا تقرأ بشكل صحيح من قبل مقياس التدفق الخلوي. غسل الحيوانات جاهزة لفرز لوحات في 5-10 مل من محلول M9 إلى أنابيب مخروطية 15 مل للفرز اللاحق على مقياس التدفق الخلوي.

  1. إعداد الفرز باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبير
    1. قبل تشغيل مقياس التدفق الخلوي
      1. تأكد من أن زجاجة السائل غمد ليست فارغة. إعداد سائل الغمد من المخزون 250x قبل ساعات قليلة على الأقل من استخدام الفرز ، حيث أن هناك كمية صغيرة من المنظفات في سائل الغمد ، والتي يمكن أن تسبب فقاعات يمكن أن تسبب القطع الأثرية أثناء الاستحواذ.
      2. تأكد من أن جميع حاويات النفايات غير ممتلئة.
    2. تشغيل مقياس التدفق الخلوي
      1. بدوره على ضاغط الهواء. تحويله إلى تلقائي. تحقق من مقياس الضغط - يجب أن يكون حوالي 30 psi.
      2. شغّل الآلة. استخدم مفتاح الطاقة المجاور لسلك الطاقة على يسار الجهاز.
      3. تشغيل الليزر. مصدر ضوء 488 نانومتر عادة ما يكون كافيا لمعظم التجارب، على الرغم من أن مصدر ضوء 561 نانومتر يحتاج إلى استخدامها إذا كان هناك حاجة إلى الإثارة أعلى للفلورسينس الأحمر.
      4. فتح برنامج FlowPilot؛ الصك يجب أن تجعل سلسلة من النقرات التبديل على الصمامات المختلفة.
      5. قم بتشغيل الليزر في نافذة البرنامج بالنقر فوق ابدأ. بدء الليزر في نافذة المنبثقة التحكم بالليزر Argon بالنقر فوق تشغيل. وهذا ينبغي أن يسبب الليزر لتشغيل والوصول إلى حوالي 12 mW. مستوى مصدر الضوء 488 سوف ترتفع إلى حوالي 12.
      6. انقر فوق القيام به لإغلاق النافذة.
    3. التحقق من البرامج قبل التقدم
      1. تحقق من مقاييس الضغط - انظر إلى قيم الضغط الأربعة المعروضة في الجزء السفلي من النافذة. يجب أن تكون القيم حول الإعداد الأصلي (غمد 5.5-5.7; عينة 5.7-6.0؛ الفرز 3.1-3.3؛ تنظيف 8.5-8.7). إذا كان يبدو مشابهًا ، حدد المربع بجوار Pressure OK.
      2. التحقق من fluidics - للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء والحطام عرقلة تدفق غمد / عينة من خلال خلية التدفق، انقر فوق تنظيف عدة مرات.
      3. التحقق من معدل تدفق غمد -لهذا، وجمع غمد لمدة 60 s. إيقاف الفرز،ثم التبديل على غمد في الضوابط اليدوية لبدء تدفق غمد. جمع في أنبوب 15 مل لمدة 60 s; يجب أن يكون معدل التدفق ~ 9-10 مل / دقيقة.
    4. التنظيف قبل استخدام مقياس التدفق الخلوي
      1. وضع ~ 3-5 مل من 10٪ محلول التبييض في جمع 'كوب' وانقر فوق الحصول على. السماح بتشغيل ل ~ 30 s، انقر فوق إحباط،وإزالة الزائدة مع فراغ.
      2. شطف جمع 'كوب' مع المياه اللامؤنة وإزالة مع فراغ. كرر 2x.
      3. وضع ~ 3-5 مل من محلول تنظيف COPAS في جمع 'كوب' وانقر فوق الحصول على. السماح بتشغيل ل ~ 30 s، انقر فوق إحباط،وإزالة فائض حل التنظيف مع فراغ.
      4. شطف جمع 'كوب' مع المياه اللامؤنة وإزالة مع فراغ. كرر 2x.
      5. وضع ~ 3-5 مل من حل M9 في جمع 'كأس' وانقر فوق الحصول على. السماح بتشغيل ل ~ 30 ق، انقر فوق إيقاف،وإزالة فائض حل M9 مع فراغ.
  2. تشغيل العينات على الفرز
    1. ضبط طاقة PMT الليزر وحجم gating على أساس الشرط الذي يسبب ألمع تفعيل المراسل النسخي من الفائدة. يمكن العثور على الإعدادات الموصى بها في الجدول 4.
    2. إضافة الديدان المعدة إلى 'كوب'. انقر فوق الحصول على. مشاهدة للتأكد من أن كل السائل لا يتم تناولها في الجهاز; وهذا سوف يسبب تدفق cytometer لاتخاذ في الهواء وخلق فقاعات في كاشف.
    3. انقر فوق إحباط عندما تكون العينة منخفضة و/أو تم جمع ما يكفي من الحيوانات.
    4. انقر فوق الإعداد | تخزين البيانات | مسور فقط. سيؤدي ذلك إلى حفظ البيانات فقط استنادًا إلى قيود الحجم. انقر فوق مخزن مسور وحفظ البيانات المبوبة. انقر فوق مسح لمسح البيانات.
    5. شطف جمع 'كوب' مع المياه اللامؤنة وإزالة مع فراغ. كرر 2x.
    6. كرر الخطوات 6.2.1-6.2.5 مع بقية العينات.
  3. المعايرة / مراقبة الجودة - إذا لزم الأمر
    ملاحظة: وهذا يتطلب تشغيل التحكم 42 ميكرومتر الجسيمات الفلورية الدوران المقدمة، لمعايرة الليزر 488.
    1. اضغط على الشفة المعدنية على الجزء العلوي من كوب العينة لإزالة أنبوب الهواء. فك الغطاء واستخدام حقنة لإزالة السائل من كوب العينة.
    2. تخلط زجاجة من جزيئات التحكم جيدا قبل الاستخدام وإضافة بضعة ملليلتر في كوب العينة. أغلق الغطاء وأعد الهواء عن طريق الضغط عليه حتى ينقر في مكانه.
    3. في البرنامج، انتقل إلى خيار الأدوات وانقر فوق تشغيل جزيئات التحكم.
    4. للتحكم في الجسيمات، إعادة تعيين قيم PMT إلى: الأخضر - 325; أصفر - 365؛ أحمر - 575.
    5. انقر فوق الحصول على. يجب تشغيل غمد تليها عينة. بمجرد أن تبدأ الخرز في الانتقال عبر خلية التدفق ، سيتم رؤية معدل التدفق في الجزء السفلي من الشاشة. على النحو الأمثل، يجب أن يكون معدل التدفق بين 5/s و 15/s. إذا كان معدل التدفق منخفضًا جدًا أو صفرًا، فقم بتشغيل صمام العينة فعليًا باتجاه عقارب الساعة لزيادة معدل التدفق. إذا كان معدل التدفق مرتفعًا جدًا، فحول صمام العينة فعليًا عكس عقارب الساعة لتقليل معدل التدفق.
      ملاحظة: عادة، تحت وضع التوقف حبة، يتم قراءة 500 الخرز قبل إيقاف. يمكن مسح البيانات وإعادة قراءة الخرز.
    6. بمجرد الانتهاء من القراءة، تحقق من وجود قمم واحدة نظيفة للمعلمات 5 بالإضافة إلى قيم السيرة الذاتية. يجب أن يكون معامل التباين (CV) <15%. أيضا، تأكد من قيم السيرة الذاتية للقنوات الفلورية الثلاث المختلفة قريبة من بعضها البعض.
    7. قم بإجراء سجل لشيك مراقبة الجودة: تحت علامة التبويب "ملف"، انقر فوق حفظ كصورة شاشة.
  4. التنظيف وإيقاف التشغيل
    1. استخدام فراغ لإزالة العينة من كوب العينة وتكرار القسم 4.1.4.
    2. وضع ~ 3-5 مل من المياه deionized في جمع 'كوب' وانقر فوق الحصول على، واسمحوا تشغيل ل ~ 30 ثانية ، ومن ثم انقر فوق إحباط. ترك بعض الماء المقطر وراء في كوب العينة.
    3. إفراغ كوب استرداد العينة وزجاجة النفايات.
    4. إيقاف تشغيل البرامج. ضمن علامة التبويب "ملف"، انقر فوق إنهاء. في القائمة المنبثقة، انقر فوق إيقاف التشغيل دون تطهير.
    5. إيقاف تشغيل الليزر، إيقاف تشغيل الصك، ومن ثم إيقاف ضاغط الهواء. أغلق الفتحة لتغطية الأداة.

7. المقالات الفسيولوجية لقياس حساسية الإجهاد في C. elegans

  1. قياس حساسية الإجهاد ER باستخدام التعرض للتونيماشين
    1. إعداد NGM RNAi لوحات DMSO رصدت مع بكتيريا RNAI استهداف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115 حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر القسم 1). تذكر أيضا أن البذور NGM RNAi TM لوحات (انظر الجدول 1). البذور كمية كافية من لوحات: خطة ل ~ 5-7 مجموعات من لوحات NGM RNAi DMSO و ~ 2-3 مجموعات من لوحات NGM RNAi TM.
    2. مزامنة الحيوانات المفضلة باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
    3. بيض اللوحة على NGM RNAi DMSO لوحات مبذرة من اختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 2. تأكد من إعداد 2x عدد اللوحات اللازمة كما سيتم نقل نصف العينة إلى لوحات NGM RNAi TM.
    4. يُضن البيض على درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام تقريبًا (~ 65-96 ساعة) إلى اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
    5. في اليوم الأول، قم بإعداد الأعمار عن طريق نقل الحيوانات إلى لوحات منفصلة. للحفاظ على لوحات (كما تكاليف TM مرتفعة)، واستخدام 8 لوحات من 15 الحيوانات في حالة، لما مجموعه 120 الحيوانات لكل حالة. وهذا يسمح لعدد يمكن التحكم فيه من الحيوانات لكل لوحة لتسجيل ويسمح لكمية كافية من الحيوانات للتحليلات الإحصائية، حتى مع بعض الرقابة.
    6. لأول 5-7 أيام، نقل الحيوانات البالغة بعيدا عن ذرية كل يوم على لوحة جديدة حتى ذرية لم تعد مرئية. خلال هذه المرحلة، فرض رقابة على الحيوانات التي هي معبأة، عرض نتوءات الفرج / الانفجارات، أو الزحف حتى جوانب لوحات، وهذه ليست الوفيات المرتبطة حساسية الإجهاد ER. لاحظ أن علاج TM يسبب الاعتقال في الحيوانات ، وبالتالي فقط 1-2 تحركات هذه الحيوانات كل 2-3 أيام كافية لتقليل التكاليف المرتبطة بإنتاج لوحات تحتوي على TM. الحيوانات البرية من النوع لديها متوسط البقاء على قيد الحياة ~ 15-17 يوما على DMSO و 12-14 يوما على tunicamcyin.
    7. بعد توقف الحيوانات عن إنتاج ذرية، يسجل عمر كل 1-2 أيام حتى يتم تسجيل جميع الحيوانات كميتة أو خاضعة للرقابة. TM علاج الحيوانات كل يوم خلال اليوم 6-14 من مرحلة البلوغ لدقة أعلى.
  2. قياس حساسية الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي باستخدام التعرض للباراكوات
    1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI تستهدف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115 حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر مقدمة).
    2. مزامنة الحيوانات المفضلة باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
    3. بيض الصفيحة على لوحات NGM RNAi المبذرة من الاختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 1. واستدعاء ازى ~ 60-100 الحيوانات في حالة، لذلك إعداد وفقا لذلك.
    4. يُضن البيض على درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام تقريبًا (~ 65-96 ساعة) إلى اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
    5. إعداد قارورة طازجة من الباراكوات 100 mM في محلول M9.
    6. Pipette 50-75 ميكرولتر من M9 + الباراكوات في العديد من الآبار من لوحة مسطحة القاع 96 جيدا كما هو مطلوب. فمن المستحسن عموما أن يكون ~ 8-10 الآبار لكل حالة تحتوي على ~ 8-10 الحيوانات في البئر. وهذا يسمح لعدد من الحيوانات مرئية بسهولة لكل بئر مع ~ 80 الحيوانات لكل سلالة.
    7. اختيار 8-10 الحيوانات في حالة ونقلها إلى كل بئر تحتوي على M9 + الباراكوات. استخدام اختيار لنقل الحيوانات إلى الآبار بدلا من الأنابيب لتجنب الاختلافات في الحجم والتغيرات غير المقصودة في تركيزات الباراكوات.
    8. كل 2 ساعة، يسجل لوفاة الحيوانات في كل بئر. اضغط على لوحات بلطف، والتي سوف تسبب الحيوانات الحية لسحق أو الانحناء. لاحظ أنه من الممكن أن تكون الحيوانات الحية مشلولة في بعض الأحيان لفترة كافية ليتم تسجيلها كميتة. لذلك ، إذا كان عدد الحيوانات الحية يتجاوز عدد الحيوانات الحية من نقطة زمنية سابقة ، فمن المرجح أن الحيوان كان على قيد الحياة ويجب عدم تسجيله (على سبيل المثال ، إذا تم تسجيل الحيوانات في الساعة 4 ، 2 /10 الحيوانات على أنها ميتة ، وفي الساعة 6 ، فقط 1 /10 الحيوانات ميتة ، الساعة 4 ينبغي إعادة تسجيلها كالحيوانات 1/10 ميتة).
  3. قياس حساسية الحرارة باستخدام التعرض لدرجات حرارة مرتفعة
    1. إعداد لوحات رصدت مع بكتيريا RNAI تستهدف الجينات ذات الاهتمام كما هو الحال في القسم 3. استخدام البكتيريا HT115 حتى في التجارب التي لا تنطوي على الضربة القاضية RNAI (انظر القسم 1).
    2. مزامنة الحيوانات المفضلة باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 2.
    3. بيض الصفيحة على لوحات مبذرة من اختيار باستخدام المعايير الموصى بها في الجدول 1. لديك 60-100 الحيوانات في حالة لالمقالات الحرارية. لمقاييس التسامح الحراري، استخدم L1 الاعتقال أو البيض وضع المقالات لأفضل مزامنة كما أن هناك تقلب كبير على أساس عمر الحيوانات في القول.
    4. احتضان الحيوانات في 20 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام تقريبا (~ 65-96 ساعة) لإجراء التجارب في اليوم 1 من مرحلة البلوغ. لا تنمو الديدان في 15 درجة مئوية لتجارب الصدمة الحرارية كما أن هناك فرقا طفيفا بين الحيوانات التي تعاني من صدمة الحرارة من أصل 15 درجة مئوية مقابل 20 درجة مئوية.
    5. في اليوم الأول، قم بإعداد الحيوانات عن طريق نقلها إلى لوحات منفصلة. فمن المستحسن عموما أن يكون ~ 10-15 الحيوانات لكل لوحة مع 4-6 لوحات، لما مجموعه 60 الحيوانات. وهذا يسمح لعدد يمكن التحكم فيه من الحيوانات لكل لوحة لتسجيل ويسمح بالحد الأدنى من الوقت للحيوانات ليتم سحبها من درجات الحرارة المرتفعة.
    6. وضع الحيوانات في حاضنة 37 درجة مئوية ويسجل كل 2 ساعة. بدء التسجيل لالحرارية في 37 درجة مئوية في الساعة 5، كما يحدث القليل من أي وفاة قبل 5 ساعات. يتم إنجاز متوسط التسامح الحراري في ~ 9 ساعات ، لذلك الساعة 7 و 9 و 11 هي نقاط زمنية حرجة ، على الرغم من أنه بسبب الحاضنة وتقلب المختبر إلى المختبر ، قد يحتاج ذلك إلى أن يتم تقييمه لكل مختبر. وعلاوة على ذلك، فإن أي طرق لتقليل التباين سوف تساعد (على سبيل المثال، عدم تكديس اللوحات، ووضع لوحات في نفس المنطقة داخل حاضنة واحدة، وتقليل الوقت الذي يتم فيه فتح الحاضنة أو إغلاقها، مع أخذ عدد قليل من اللوحات من الحاضنة في وقت واحد لتقليل الوقت الذي تقضيه الحيوانات خارج 37 درجة مئوية، إلخ. للحصول على دليل كامل، انظر21).
    7. كبديل للخطوة 7.3.6، ضع الحيوانات عند 34 درجة مئوية بدلاً من 37 درجة مئوية. متوسط التحمل الحراري عند 34 درجة مئوية هو في ما يزيد قليلا على 14 ساعة، لذلك النقاط الزمنية 12، 14، و 16 حاسمة ل34 درجة مئوية المقاييس التحمل الحراري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدام المراسلين النصوص لقياس تفعيل استجابات الإجهاد
هنا، يتم استخدام المراسلين النسخ الفلورية، والتي بمثابة أدوات قوية لقياس تفعيل معظم استجابات الإجهاد في C. elegans. يتم دفع تعبير GFP تحت مروج الأهداف الكنسية للمنظمين الأساسيين النسخ المشاركين في الاستجابة للضغوط الخاصة بالمقصورة. تتوفر قائمة شاملة بالمراسلين النسخيين الشائعة الاستخدام في الجدول 3.

اضطراب التأكسد ER عبر البروتينا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، يتم وصف طرق استجواب استجابات الإجهاد الخلوي في C. elegans، وذلك باستخدام المراسلين النسخ الفلوري ومقالات البقاء على قيد الحياة الإجهاد الفسيولوجي. يستخدم جميع المراسلين تعبير GFP مدفوعًا تحت مروج هدف النسخ التنازلي لعوامل النسخ المشاركة في استجابات الإجهاد الخلوي المتصاعدة. استخدام hsp-4p::GFP التضمين بواسطة XBP-1s بوساطة الاستعراض الدوري الشاملER, hsp-6p::GFP التي تسيطر عليها ATFS-1 بوساطة الاستعراض الدوري الشاملMT, gst-4p::GFP تحت SKN-1 بوساطة OxSR, وh...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

R.BZ، R.BZ، مدعومة من قبل زمالة EMBO على المدى الطويل ومؤسسة لاري إل هيلبلوم. يتم دعم R.H.S من خلال منحة 5F32AG032023-02 من خلال المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ومؤسسة جلين للبحوث الطبية زمالة ما بعد الدكتوراه. ويدعم A.F. من قبل منحة F32AG051355 من خلال NIA. يتم دعم H.K.G. من خلال منحة DGE1752814 من خلال برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم. يتم دعم M.G.M. من قبل 1F31AG060660-01 من خلال NIA. يتم دعم A.D. من قبل مؤسسة توماس وستايسي سيبل، ومعهد هوارد هيوز الطبي، و4R01AG042679-04 و 5R01AG055891-02 من NIA، و 5R01ES021667-09 من NIEHS. نشكر لاري جو، ميليسا سانشيز، نامكيت، وأنيل إسكيفل على المساعدة التقنية الكبيرة. نشكر مختبر موريموتو وCGC (بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرنامج البنية التحتية للبحوث P40 OD010440) على السلالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Antimycin ASigma-AldrichA8674لإجهاد الميتوكوندريا
Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118072لألواح NGM BD
Difco المحبب أجارVWR90000-782لألواح NGM ثنائي
هيدرات كلوريد الكالسيومVWR97061-904لألواح NGM
CarbenicillinBioPioneerC0051-25ل RNAi
الكوليسترولسيجما-ألدريتش57-88-5لألواح NGM
COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000مجهزة بمصدر ضوء 488 نانومتر.
COPAS CleaningSolution Union Biometrica300-5072-000للاستخدام مع COPAS
COPAS غمد المحلولالاتحاد Biometrica300-5070-100للاستخدام مع
COPASDMSOSigma-Aldrichللأدوية
IPTG ديوكسان خالمن DenvilleScientific CI8280-4ل RNAi
LB Broth MillerFisher ScientificBP1426500للسكوب المجسم LB
M205FALeica10450040مجهزة بكاميرا CCD أحادية اللون Leica DFC3000G ، ومرشح Leica GFP القياسي (ex 395-455 ، EM 480 LP) ، وبرنامج LAS X
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدراتVWREM-MX0070-3لألواح NGM ، M9
ParaquatSigma-Aldrich36541لإجهاد الأكسدة / الميتوكوندريا
كلوريد البوتاسيومفيشرP217-500لمحلول التبييض
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةVWREM-PX1570-2لألواح NGM
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةVWREM-PX1565-5ل M9
RevolveECHO75990-514مجهزة بعدسة موضوعية Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13 ، مرشح Olympus FITC القياسي (ex 470/40 ؛ em 525/50 ؛ DM 560) ، وجهاز iPad Pro للكاميرا وتشغيل برنامج ECHO
Sodium AzideSigma-Aldrich71289-50Gلتصوير
كلوريد الصوديومEMD MilliporeSX0420-5لألواح NGM ، M9
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةVWR71003-472ل M9
Tert-butyl hydroperoxideSigma-Aldrich458139للإجهاد
التأكسديالتتراسيكلين هيدروكلوريدسيجما ألدريتشT7660-5Gل RNAi
TunicamycinSigma-AldrichT7765-50MGلإجهاد ER
مذيب 472301

المراجع

  1. Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
  2. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  3. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  4. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  5. Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
  6. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), e1008011(2019).
  7. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  8. Yoneda, T., Benedetti, C., Urano, F., Clark, S. G., Harding, H. P., Ron, D. Compartment-specific perturbation of protein handling activates genes encoding mitochondrial chaperones. Journal of Cell Science. 117 (Pt 18), 4055-4066 (2004).
  9. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235-242 (1999).
  10. Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
  11. Struwe, W. B., Hughes, B. L., Osborn, D. W., Boudreau, E. D., Shaw, K. M. D., Warren, C. E. Modeling a congenital disorder of glycosylation type I in C. elegans: a genome-wide RNAi screen for N-glycosylation-dependent loci. Glycobiology. 19 (12), 1554-1562 (2009).
  12. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
  13. Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
  14. Oberley, L. W., Buettner, G. R. Role of Superoxide Dismutase in Cancer: A Review. Cancer Research. 39 (4), 1141-1149 (1979).
  15. Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring Oxidative Stress in Caenorhabditis elegans: Paraquat and Juglone Sensitivity Assays. Bio-protocol. 7 (1), (2017).
  16. Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), B270-B276 (1994).
  17. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The Biology of Proteostasis in Aging and Disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
  18. Park, H. E. H., Jung, Y., Lee, S. J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
  19. Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a Neuropeptide Gene on Behavioral States in Caenorhabditis elegans Egg-Laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
  20. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
  21. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological Considerations for Heat Shock of the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 68 (3), 450-457 (2014).
  22. Shen, X., Ellis, R. E., Sakaki, K., Kaufman, R. J. Genetic interactions due to constitutive and inducible gene regulation mediated by the unfolded protein response in C. elegans. PLoS genetics. 1 (3), e37(2005).
  23. Frakes, A. E., Dillin, A. The UPR(ER): Sensor and Coordinator of Organismal Homeostasis. Molecular Cell. 66 (6), 761-771 (2017).
  24. Martinus, R. D., et al. Selective induction of mitochondrial chaperones in response to loss of the mitochondrial genome. European Journal of Biochemistry. 240 (1), 98-103 (1996).
  25. Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation. Science (New York, N.Y). 337 (6094), 587-590 (2012).
  26. Baker, B. M., Haynes, C. M. Mitochondrial protein quality control during biogenesis and aging. Trends in Biochemical Sciences. 36 (5), 254-261 (2011).
  27. Shore, D. E., Carr, C. E., Ruvkun, G. Induction of Cytoprotective Pathways Is Central to the Extension of Lifespan Conferred by Multiple Longevity Pathways. PLOS Genetics. 8 (7), e1002792(2012).
  28. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  29. Chiang, S. M., Schellhorn, H. E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 525 (2), 161-169 (2012).
  30. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88 (Pt B), 290-301 (2015).
  31. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  32. Lo, J. Y., Spatola, B. N., Curran, S. P. WDR23 regulates NRF2 independently of KEAP1. PLOS Genetics. 13 (4), e1006762(2017).
  33. Link, C., Johnson, C. Reporter Transgenes for Study of Oxidant Stress in Caenorhabditis elegans. Methods in enzymology. 353, 497-505 (2002).
  34. Choe, K. P., Przybysz, A. J., Strange, K. The WD40 Repeat Protein WDR-23 Functions with the CUL4/DDB1 Ubiquitin Ligase To Regulate Nuclear Abundance and Activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2704-2715 (2009).
  35. Velazquez, J. M., Lindquist, S. hsp70: nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3), 655-662 (1984).
  36. Tissières, A., Mitchell, H. K., Tracy, U. M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. Journal of Molecular Biology. 84 (3), 389-398 (1974).
  37. Gomez-Pastor, R., Burchfiel, E. T., Thiele, D. J. Regulation of heat shock transcription factors and their roles in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
  38. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS genetics. 9 (4), e1003466(2013).
  39. Hentze, N., Le Breton, L., Wiesner, J., Kempf, G., Mayer, M. P. Molecular mechanism of thermosensory function of human heat shock transcription factor Hsf1. eLife. 5, (2016).
  40. Li, J., Labbadia, J., Morimoto, R. I. Rethinking HSF1 in Stress, Development, and Organismal Health. Trends in Cell Biology. , (2017).
  41. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  42. Senchuk, M. M., et al. Activation of DAF-16/FOXO by reactive oxygen species contributes to longevity in long-lived mitochondrial mutants in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 14 (3), (2018).
  43. Henderson, S. T., Bonafè, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  44. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  45. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  46. Shivers, R. P., Kooistra, T., Chu, S. W., Pagano, D. J., Kim, D. H. Tissue-specific activities of an immune signaling module regulate physiological responses to pathogenic and nutritional bacteria in C. elegans. Cell Host & Microbe. 6 (4), 321-330 (2009).
  47. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), (2018).
  48. Glover-Cutter, K. M., Lin, S., Blackwell, T. K. Integration of the Unfolded Protein and Oxidative Stress Responses through SKN-1/Nrf. PLOS Genetics. 9 (9), e1003701(2013).
  49. Liu, Y., Chang, A. Heat shock response relieves ER stress. The EMBO journal. 27 (7), 1049-1059 (2008).
  50. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The Caenorhabditis elegans Lifespan Machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
  51. Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of Oxidative Stress: Mitochondrial Function Using the Seahorse System. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1710, 285-293 (2018).
  52. Morton, E. A., Lamitina, T. Caenorhabditis elegans HSF-1 is an essential nuclear protein that forms stress granule-like structures following heat shock. Aging Cell. 12 (1), 112-120 (2013).
  53. Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13 (4), 467-480 (2007).
  54. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  55. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  56. Daniele, J. R., Esping, D. J., Garcia, G., Parsons, L. S., Arriaga, E. A., Dillin, A. High-Throughput Characterization of Region-Specific Mitochondrial Function and Morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
  57. Daniele, J. R., et al. A non-canonical arm of UPRER mediates longevity through ER remodeling and lipophagy. bioRxiv. , 471177(2018).
  58. Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
  59. Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science (New York, N.Y.). 346 (6207), 360-363 (2014).
  60. Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الاستجابة للإجهاد في C. elegansالاستجابة للصدمة الحراريةاستجابة البروتين غير المطويالاستجابة للإجهاد التأكسديالمراسل النسخي الفلوريتحليل قياس التدفق الخلويمقايسة الحساسية للباراكواتمقايسة البقاء على قيد الحياة لتحمل الحرارةتثبيط XBP-1تثبيط DAF-2
قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.