Method Article

توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفلورسينس مدى الحياة وشاشات التصوير، والقياس الكمي ويميز الميول التجميع من البروتينات في المعيشة، والشيخوخة، وشدد نماذج مرض C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط الفيبريات الأميلويد مع عدد من الأمراض العصبية مثل هنتنغتون, باركنسون, أو مرض الزهايمر. هذه الفيبريات اميلويد يمكن عزل البروتينات الذاتية ميتاستابل وكذلك مكونات شبكة البروتوستاس (PN) وبالتالي تفاقم البروتين misfolding في الخلية. هناك عدد محدود من الأدوات المتاحة لتقييم عملية تجميع البروتينات الأميلويد داخل الحيوان. نحن نقدم بروتوكولا للميكروسكوبية مدى الحياة الفلورية (FLIM) التي تسمح رصد وكذلك التحديد الكمي للفيبريلية اميلويد في خلايا محددة، مثل الخلايا العصبية، بطريقة غير الغازية ومع تطور الشيخوخة وعند اضطراب PN. FLIM مستقلة عن مستويات التعبير من الفلوروفور وتمكن من تحليل عملية التجميع دون أي مزيد من تلطيخ أو التبييض. يتم إخماد الفلورفور عندما تكون في محيط قريب من الهياكل الأميلويد، مما يؤدي إلى انخفاض عمر الفلورسينس. يرتبط الترويم بشكل مباشر بتجميع بروتين الأميلويد. FLIM هو تقنية متعددة الاستخدامات التي يمكن تطبيقها لمقارنة عملية الفيبريلة من البروتينات الأميلويد مختلفة، والمحفزات البيئية، أو الخلفيات الوراثية في الجسم الحي بطريقة غير الغازية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث تجميع البروتين في كل من الشيخوخة والمرض. من الصعب اتباع المسارات التي تؤدي إلى تكوين وترسب الأميلويدات الكبيرة أو التضمينات غير المتبلور وحركية لها هي بالمثل صعبة للكشف. البروتينات يمكن أن تسيء بسبب الطفرات الجوهرية داخل تسلسل الترميز الخاصة بهم، كما هو الحال في الأمراض الوراثية. البروتينات أيضا يخطئ لأن شبكة البروتوستاس (PN) التي تبقيها قابلة للذوبان ومطوية بشكل صحيح هو ضعف، كما يحدث أثناء الشيخوخة. تتضمن PN المرافقالجزيئية وآلات التحلل وهي مسؤولة عن النشأة الحيوية وللطي والاتجار وتدهور البروتينات1.

C. ظهرت elegans كنموذج لدراسة الشيخوخة والمرض بسبب عمرها القصير، والطبيعة التسببية، وسهولة التلاعب الجين....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تزامن C. elegans

  1. مزامنة C. elegans إما عن طريق معالجة محلول هيبوكلوريت القلوية أو عن طريق وضع البيض بسيطة لمدة 4 ساعة في 20 درجة مئوية8.
  2. تنمو والحفاظ على الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية على المتوسطة نمو النيماتودا (NGM) لوحات المصنفة مع OP50 E. القولونية وفقا للإجراءات القياسية9. عمر الديدان الخيطية حتى مرحلة النمو المطلوبة أو اليوم.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم صورة الشباب في اليوم 4 ويتم صورة الديدان الخيطية القديمة في اليوم 8 من الحياة.

2. RNAi بوساطة ضربة قاضية من آلات المرافق عن طريق التغذية

ملاحظة: تن....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول كيفية مراقبة تكوين الأنواع المجمعة بدقة في C. elegansالحية ، سواء أثناء شيخوختها الطبيعية أو عند تعرضها للإجهاد. اخترنا أربع سلالات مختلفة من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا التعبير عن بروتينات البولي غلوتامين إما 40Q، 44Q، أو يكرر 85Q. يتم تصنيع هذه البروتينات في أنسجة مختلفة وتم دمجها في الفلوروفوريات المختلفة. وسلالات C. elegans إما أعرب Q40-mRFP في عضلات جدار الجسم (mQ40-RFP), Q40-CFP في الجهاز العصبي (nQ40-CFP), وإما Q44-YFP أو Q85-YFP في الأمعاء (iQ4.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف البروتوكول المعروض هنا تقنية تعتمد على المجهر لتحديد الأنواع المجمعة في نظام نموذج C. elegans. FLIM يمكن أن تميز بدقة وجود كل من الأنواع المجمعة والقابلة للذوبان تنصهر على الفلوروفور عن طريق قياس تسوس العمر الفلوري. عندما يبدأ بروتين الانصهار لتجميع متوسط العمر المسجل سوف يتحول من أعلى إلى قيمة أقل16. ويمكن بعد ذلك استنتاج ميل التجميع من خلال انخفاض في العمر: كلما انخفض العمر ، كلما ارتفع وجود أنواع البروتين المجمعة في النظام. وبالتالي ، يصبح من الممكن اتباع آثار الشيخوخة ، والمرض ، .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سلالة العضلات Q40-mRFP التي تقدمها CGC، والتي يتم تمويلها من قبل مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). الخلايا العصبية-Q40-CFP كان هدية لطيفة من مختبر موريموتو. نحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK، زمالة دكتوراه NeuroCure من قبل مجموعة NeuroCure للتميز إلى MLP)، EMBO (زمالة قصيرة الأجل إلى MLP) وشركة علماء الأحياء (منح السفر إلى CG و MLP) للتمويل. كما نعترف بمرفق التصوير المجهري الخفيف المتقدم في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي، برلين، لتوفير الإعداد لتصوير بنيات YFP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar-Agar Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM مكون
مكتبة Ahringer hsp-1 siRNASource BioScience UK LimitedF26D10.3
AmpicillinCarl Roth GmbH + Co. KGK029.3Antibiotic
B & H DCS-120 SPC-150بيكر & أمبير برنامج Hickl GmbHFLIM Aquisition
B& H SPC830-SPC صورةبيكر & برنامج Hickl GmbHFLIM Aquisition
BD Bacto PeptoneBD-Bionsciences211677مكون NGM
C. elegans< / em> iQ44-YFPمركز علم الوراثة CAENORHABDITIS (CGC)OG412
C. elegans< em> iQ85-YFPهدية لطيفة من Morimoto Lab
C. elegans< / em> mQ40-RFPهدية طيبة من مختبر موريموتو
C. elegans< / em> nQ40-CFPهدية لطيفة من Morimoto Lab
Deckgl & auml ؛ ser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2زلات الغطاء
الأيزوبروبيل - بيتا ؛ - D-thiogalactopyranosid (IPTG) CarlRoth GmbH + Co. KG2316.4
Leica M165 FCLeica Camera AGتصاعد المجهر المجسم
Leica TCS SP5Leica Camera AGمجهر متحد البؤر
Levamisole HydrochlorideAppliChem GmbHA4341مخدر
OP50 الإشريكية القولونية< / em>CAENORHABDITIS لعلم الوراثة (CGC)OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM برنامج مسح المياه
الصوديوم أزيدكارل روث GmbH + Co. KGK305.1
كلوريد الصوديومCarl Roth GmbH + Co. KG3957.2مكون
NGMStandard-Objektträ جيركارل روث GmbH + Co. KG0656.1شرائح زجاجية
يونيفرسال أغاروزبيو & بيع GmbHBS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1Carl Zeiss AGمجهر متحد البؤر
Zeiss LSM510-Meta NLOCarl Zeiss AGمجهر متحد البؤر
مركز المخدر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingAmyloid FibrilizationC Elegans ModelProtein Aggregation AnalysisNoninvasive MonitoringFLIM AcquisitionLifetime MeasurementPhoton DetectionAgarose Pad PreparationNeurodegenerative Disease Study

Related Articles