الكشف عن البروتين S-Acylation باستخدام Acyl-الراتنج بمساعدة التقاط

S-acylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة التي تنطوي على إضافة سلسلة أسيل الدهنية إلى بقايا السيستين الداخلية على البروتين المستهدف عن طريق السندات ثيويستر labile¹. تم الإبلاغ لأول مرة عن تعديل البروتينات مع البالميتات ، وهو حمض دهني مشبع بـ 16 كربونًا²، وبالتالي غالبًا ما يشار إلى هذا التعديل باسم S-palmitoylation. بالإضافة إلى البالميتات ، يمكن تعديل البروتينات بشكل عكسي من خلال مجموعة متنوعة من التشبع الأطول والأقصر (myristate و stearate) ، غير المشبعة (الأوليات) ومتعددة غير المشبعة (الأراكيدونات والإسيكوسابينتانات) الأحماض الدهنية^{3،4،5،6،7}. في الخلايا eukaryotic، هو تحفيز S-acylzation من قبل عائلة من الإنزيمات المعروفة باسم acyltransferases البروتين DHHC ورد الفعل العكسي من السيستين deacylation هو تحفيز من قبل thioesterases البروتين، ومعظمها لا تزال غامضة⁸.

قابلية رابطة ثيويستر يجعل هذا التعديل الدهون عكسها، مما يسمح لها لتنظيم حيوي تجمع البروتين، وتوطين غشاء البلازما، والاتجار داخل الخلايا، والتفاعلات البروتين البروتين واستقرار البروتين^9،10. وبالتالي، تم ربط S-acylation إلى العديد من الاضطرابات بما في ذلك مرض هنتنغتون، ومرض الزهايمر وعدة أنواع من السرطان (البروستاتا، المعدة، المثانة، الرئة، القولون والمستقيم)، مما يتطلب تطوير طرق موثوق بها للكشف عن هذا التعديل البروتين بعد الترجمة¹¹.

العلامات الأيضية مع المشعة^([3H]، [¹⁴C] أو^[125I]) palmitate كان واحدا من النهج الأولى المتقدمة لأساية البروتين S-acylation^12،13،14. ومع ذلك، الأساليب القائمة على العلامات الإشعاعية الحالية المخاوف الصحية، ليست حساسة جدا، وتستغرق وقتا طويلا، والكشف فقط عن الدهون من البروتينات وفيرة للغاية¹⁵. بديل أسرع وغير مشع لوضع العلامات الإشعاعية هو وضع العلامات الأيضية مع تحقيقات الأحماض الدهنية الحيوية، والتي تستخدم بشكل روتيني لتقويم ديناميات البروتين S-acylation¹⁶. في هذه الطريقة ، يتم دمج الأحماض الدهنية مع مراسل كيميائي (مجموعة الألكيين أو الأزيد) في البروتين S-acylated بواسطة acyltransferase البروتين. Azide-alkyne Huisgen cycloaddition التفاعل (انقر الكيمياء) يمكن استخدامها بعد ذلك لإرفاق مجموعة وظيفية، مثل الفلوروفور أو البيوتين، إلى الأحماض الدهنية المتكاملة مما يسمح للكشف عن البروتين S-acylated^17،18،19.

Acyl-biotin التبادل (ABE) هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية المستخدمة على نطاق واسع لالتقاط وتحديد البروتينات S-acylated التي تتجاوز بعض أوجه القصور في وضع العلامات الأيضية مثل عدم ملاءمة لعينات الأنسجة¹⁵. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل S-acylation في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الأنسجة وعينات الخلايا المجمدة^20،21. ويستند هذا الأسلوب على الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر بين مجموعة acyl وبقايا السيستين من الهيدروكسيلامين محايدة. ثم يتم التقاط مجموعات ثيول المحررة مع مشتق البيوتين القائم على التفاعل مع ثيول. ثم يتم تنقية البروتينات الحيوية المتولدة باستخدام العقديات وتحليلها بواسطة المناعي.

تم تقديم نهج بديل يسمى acyl-resin بمساعدة القبض (Acyl-RAC) في وقت لاحق لاستبدال خطوة biotinylation مع اقتران مباشر من السيستينات الحرة من قبل راتنج ثيول التفاعلي^22،23. هذه الطريقة لديها خطوات أقل بالمقارنة مع ABE وبالمثل يمكن استخدامها للكشف عن البروتين S-acylation في مجموعة واسعة من العينات¹.

Acyl-RAC يتكون من 4 خطوات رئيسية(الشكل 1)،
1. حظر مجموعات ثيول الحرة؛
2. الانقسام الانتقائي من السندات ثيويستر السيستين- أسيل مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السيستين ثيول;
3. التقاط السيستينات الدهنية مع الراتنج ثيول التفاعلي؛
4. الإثراء الانتقائي للبروتينات S-acylated بعد elution مع الحد من العازلة.

ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل البروتينات التي تم التقاطها عن طريق التنبولين المناعي أو إخضاعها لـ البروتيوميكس القائم على الكتلة (MS) لتقييم البروتيوم S-acylated في مجموعة متنوعة من الأنواع والأنسجة^22،24،25. يمكن أيضًا تحديد مواقع S-acylation الفردية عن طريق هضم التربسين للبروتينات الملتقطة وتحليل الببتيدات الناتجة بواسطة LC-MS/MS²². هنا، نوضح كيف يمكن استخدام acyl-RAC للكشف المتزامن عن S-acylation من بروتينات متعددة في كل من خط الخلية وعينة الأنسجة.

الفئران المستخدمة في هذا البروتوكول تم القتل الرحيم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة. وافقت لجنة رعاية الحيوان في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن على جميع الأعمال الحيوانية.

1. إعداد الخلايا الليكلسات

1. إعداد المخزن المؤقت lysis كما هو موضح في الجدول 1. إلى 10 مل من PBS، أضف 0.1 غرام من منظفات n-dodecyl α-D-maltoside (DDM) وقم بتدويرها للذوبان. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الفوسيفاتي2 وML211 (10 ميكرومتر) وPMSF (10 mM) وكوكتيل مثبط البروتياز (1x) وتبريد الحاجز على الجليد قبل الاستخدام.
2. نقل وسائل الإعلام المطلوبة التي تحتوي على خلايا من الحاضنة إلى 15 مل أو 50 مل أنابيب مخروطية وخلايا تدور في 350 × ز لمدة 5 دقيقة وينتشق للتخلص من أي حطام الخلية.
   ملاحظة: استخدمنا 1 × 10⁷ خلايا لكل رد فعل acyl-RAC ليتم تنفيذها.
3. اغسل البيليه عن طريق إعادة تعليقه في 5 مل من PBS والغزل في 350 × ز لمدة 5 دقيقة.
   ملاحظة: تنفيذ الخطوة 1.3 بسرعة لتجنب الانزل الخلوي بسبب الحضانة الموسعة في برنامج تلفزيوني.
4. إضافة 600 ميكرولتر من العازلة التحلل أعدت في الخطوة 1.1 إلى بيليه وlyse ذلك عن طريق اهتزاز في 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
5. الانحلال الواضح عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × ز عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لمواد المنظفات بيليه غير القابلة للذوبان. جمع مسح lysate في أنابيب microfuge 1.5 مل تبريد مسبق والاحتفاظ بها على الجليد.
6. إجراء برادفورد / BCA القول لتقدير تركيز البروتين. من الضروري ضمان نفس الكمية من البروتين عبر عينات مختلفة قبل إجراء التجربة. نوصي باستخدام ما لا يقل عن 500 ميكروغرام من البروتين لكل رد فعل.
   ملاحظة: في التجارب الموصوفة، استخدمنا الخلايا المستزرعة (Jurkat) والخلايا الأيضية الأولية من أنسجة الفئران. يمكن اعتماد طريقة التليس المذكورة أعلاه لأنواع الخلايا الأخرى أيضًا. متوسط تركيز البروتين الذي تم الحصول عليه لأنواع الخلايا المذكورة أعلاه هو حوالي 500 ميكروغرام لكل 1 × 10⁷ خلايا. تم الحفاظ على خلايا بيركات في RPMI-1640 متوسطة المعدلة لتحتوي على 2 mM L-الجلوتامين، 10 mM HEPES، 1 mm الصوديوم بيروفات، 4500 ملغ / لتر الجلوكوز، و 1500 ملغ / لتر بيكربونات الصوديوم تكملها 10٪ FBS في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. استخدمنا 1 × 10⁷ خلايا جوركات لكل رد فعل. تم عزل الخلايا الالطحالبية الأولية من أنسجة طحال الماوس كما هو موضح²⁶. لفترة وجيزة ، تم macerated أنسجة الطحال على الجليد ، تليها حل الخلايا الحمراء في محلول نقص التوتر والانفصال عن الخلايا الليمفاوية عن طريق الطرد المركزي. استخدمنا 1 × 10⁷ خلايا أساسية لكل رد فعل.

2. Acyl-RAC: حظر مجموعات ثيول الحرة

ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة (RT).

1. نقل lysate إلى أنبوب ميكروفوغ 1.5 مل جديدة وإجراء هطول الأمطار الكلوروفورم والميثانول (CM) على النحو المبين أدناه.
   1. إضافة الميثانول (MeOH) والكلوروفورم (CHCl₃₎إلى lysate في نسبة نهائية من lysate: MeOH: CHCl₃ من 2:2:1 ويهز بقوة لخلق تعليق متجانس.
   2. تدور عند 10,000 × ز لمدة 5 دقيقة لتشكيل بيليه ("فطيرة") في المرحلة البينية بين المرحلتين المائية والعضوية.
   3. إمالة الأنبوب وتستنشق أكبر قدر ممكن من المذيبات باستخدام إبرة أو تلميح تحميل هلام.
   4. الهواء تجفيف بيليه البروتين لبضع دقائق ويغسل بلطف عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من MeOH وخلط بلطف لتجنب كسر بيليه
   5. إزالة بعناية MeOH المتبقية وتجفيف بيليه البروتين على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق تقريبا.
   6. (اختياري) تنفيذ خطوة إضافية الطرد المركزي لتدور أسفل أي بيليه مكسورة بعد غسل MeOH لتجنب فقدان العينة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة بعد خطوة هطول الأمطار CM. بمجرد الحصول على بيليه، يمكن تخزينها في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع.
      1. حل بيليه البروتين في 200 ميكرولتر من العازلة 2SHB عن طريق الدوامة في 42 درجة مئوية / 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية حتى يذوب بيليه.
   7. (اختياري) احتضان لمدة 5-10 دقيقة إضافية في حمام مائي صوتي لإذابة بيليه.
      ملاحظة: يختلف طول صوتنة اعتمادا على ذوبان المواد. ومع ذلك، سونيكيشن لفترات طويلة يمكن أن يسبب تدهور البروتين.
2. إعداد 0.2٪ ميثيل ميثثيوسولفونات (V/v) في 2SHB بإضافة 2 ميكرولتر من MMTS إلى 998 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2SHB.
   ملاحظة: استخدم 0.2% MMTS معدة حديثًا لكل تجربة.
3. إضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ MMTS في 2SHB إلى كل أنبوب إلى تركيز نهائي من 0.1٪ MMTS. احتضان لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية مع اهتزاز في 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية.

3. Acyl-RAC: الهيدروكسيلامين (HAM) الانقسام والتقاط البروتينات S-acylated

1. كرر هطول الأمطار 3-4x CM كما هو موضح أعلاه لإزالة MMTS. يمكن تقدير إزالة MMTS من خلال عدم وجود رائحة متميزة من MMTS. بعد كل هطول للأمطار، حل بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة 2SHB عن طريق دوامة في 42 درجة مئوية/ 1500 دورة في الدقيقة في شاكر الحرارية حتى يذوب الكريات، ثم تمييع مع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
2. بعد هطول الأمطار النهائي، تذوب العينات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2SHB كما هو موضح أعلاه وتمييع مع 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت A.
3. في حالة مقارنة التغيرات في S-acylation استجابة لعدة ظروف العلاج، وقياس تركيز البروتين مرة أخرى والمضي قدما مع كمية متساوية من البروتين لكل حالة.
4. الاحتفاظ بـ 40 ميكرولتر من كل عينة كتحكم في الإدخال.
5. تقسيم العينات إلى جزأين متساويين من 200 ميكرولتر ووضع علامة على أنابيب "+ HAM" و "- HAM". أضف 50 ميكرولتر من محايدة أعدت حديثا 2 M HAM (درجة الحموضة 7.0-7.5) إلى تركيز نهائي من 400 mM إلى واحد من الأنابيب (+ HAM) و 50 ميكرولتر محايدة 2 M NaCl إلى الأنبوب الثاني (- HAM)، والتي سيتم استخدامها كتحكم سلبي. المضي قدما في إضافة من الخرز ثيوبروبيل سيفوروز (TS).
   ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة بعد أي من خطوات هطول الأمطار CM. بمجرد الحصول على بيليه، يمكن تخزينها في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع. درجة الحموضة محايدة من 2 M HAM يضمن انتقائيته لسندات ثيويستر acyl-cysteine وينبغي تعديلها بعناية. وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع العينات في المخزن المؤقت 2SHB لتجنب فقدان العينة بسبب الرغوة المفرطة. جميع الخطوات التالية متطابقة ل - HAM و + عينات HAM.
6. أضف 30 ميكرولتر من طلاط طُلح TS إلى كل أنبوب وقم بتدوير الأنابيب لمدة 1-2 ساعة في RT.
7. غسل حبات TS 4x مع 1٪ SDS في المخزن المؤقت A لإزالة لحم الخنزير المتبقية.
   1. تدور بلطف أسفل جميع عينات من السّغة باستخدام ميكروفوج لمدة 1 دقيقة وتستنشق بعناية supernatant.
   2. إعادة تعليق الخرز في 500 ميكرولتر من 1٪ SDS في المخزن المؤقت A.
   3. كرر الخطوة 3.7.1-3.7.2 ثلاث مرات.
      ملاحظة: يتم توفير تنشيط ثيوبروبيل-سيفورخ (TS) تجميد المجففة في وجود المواد المضافة التي يجب غسلها بعيدا في درجة الحموضة محايدة قبل اقتران. يوصى بالمياه المقطرة للتورم والغسيل. وزن 0.1 غرام من الخرز وإعادة تعليق في 1 مل من الماء المقطر والسماح لها بتضخم أثناء الدوران لمدة 30 دقيقة-1 ساعة في RT. غسل الخرز 1x مع المخزن المؤقت A وإعداد الطين مع المخزن المؤقت A، في نسبة 50٪ استقرت المتوسطة إلى 50٪ المخزن المؤقت. يمكن تخزين TS منتفخة في درجة الحموضة محايدة في وجود الإيثانول 20٪ في 4 درجة مئوية تصل إلى أسبوع. لا تستخدم أزيد الصوديوم كعامل بكتريوستاتيكي لأن أيون الأزيد تتفاعل مع مجموعات ثنائي الكبريتيد 2-pyridyl. لكفاءة أعلى، وإعداد الخرز الطازج. أثناء التعامل مع الخرز ، يمكن قطع طرف P200 pipette قليلاً لمنع أي ضرر.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة في أي مرحلة بعد هطول الأمطار CM. قد يتم تخزين بيليه في 500 ميكرولتر من MeOH في -20 درجة مئوية تصل إلى أسبوع.

4. Elution والكشف عن البروتينات S-acylated

1. بعد غسل الماضي، تدور بلطف أسفل الخرز كما هو موضح أعلاه وتستنشق أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج الخرز.
2. استعادة البروتينات من الخرز مع 4x SDS العازلة عينة مع DTT.
   1. إضافة 50 ميكرولتر من 4x SDS العازلة عينة إلى الخرز واحتضان في 80 درجة مئوية، 1500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في شاكر الحرارية. دع الأنابيب تبرد.
   2. طرد يحبات في 5000 x ز لمدة 3 دقيقة لبيليه تماما الخرز ونقل البروتينات eluted إلى أنبوب 1.5 مل جديدة باستخدام تلميح تحميل هلام.
3. تشغيل SDS-PAGE وتحليل S-acylation من البروتين (ق) من الفائدة من قبل النشاف الغربي.

بعد البروتوكول المذكور أعلاه، استخدمنا لأول مرة acyl-RAC للكشف في وقت واحد S-acylation من العديد من البروتينات في خلايا جوركات، وهو خط خلية تال خالدة المستمدة أصلا من الدم المحيطي من مريض سرطان الدم خلية تي27. تم اختيار بروتينات الخلايا T التنظيمية التي تم تحديدها سابقًا باسم S-acylated9،28،29 لإظهار فائدة هذه الطريقة. كما هو مبين في الشكل 2A، يمكن الكشف عن التيروسين كيناز ليك في تحلل تعامل مع محايدة 2 M هيدروكسيلامين لشكيس السندات الثيويستر بين مخلفات السيستين وحمض دهني moiety (+ حارة هام). العينة المعالجة بـ 2 M NaCl (- حارة HAM) تمثل عنصر تحكم سلبي مهم ، مما يشير إلى انتقائية التبرير للكشف عن روابط الثيويستر. يؤكد ممر الإدخال كذلك خصوصية الإشارة ويمكن أن يكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي إذا لم يكن بروتين الفائدة S-acylated. ثم تم تجريد الغشاء وإعادة التحقيق مع الأجسام المضادة ضد البروتينات Fyn و LAT لإثبات أن أسيل RAC يمكن استخدامها لتحليل S-acylation من البروتينات المتعددة في نفس الوقت(الشكل 2A).

لإثبات فائدة هذه الطريقة للكشف عن البروتين S-acylation في عينات الأنسجة، طبقنا بروتوكول acyl-RAC على طحال الماوس. كما هو مبين في الشكل 2B، يمكن اكتشاف S-acylation من Lck و Fyn و LAT بسهولة في الخلايا الجنبية الأولية للفأرة مما يشير إلى أن يتم الحفاظ على هذا التعديل بين نوعين.

الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة التمثيل التخطيطي لـ acyl-RAC. وتتألف الطريقة من 4 خطوات رئيسية: (1) منع مجموعات الثيول الحرة مع ميثيل ميثيوسولفونات (MMTS)، (2) انشقاق انتقائي من السندات ثيويستر السيستين-acyl مع الهيدروكسيلامين محايدة (HAM) لفضح مجموعات السشتاين ثيول، (3) التقاط البروتينات مع ثيول السيستين المكشوفة حديثا عن طريق الاقتران المباشر مع الراتنج ثيول التفاعلي و (4) استعادة البروتينات التي تم التقاطها باستخدام العازلة الإلوطية الحد، تليها المناعي أو تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الكشف عن البروتينات S-acylated. تم استخدام أساية acyl-RAC للكشف عن S-acylation من بروتينات إشارات الخلايا T في خلايا Jurkat T(A)وأنسجة الطحال المورين(B). المناعي مع Lck-, Fyn- و LAT الأجسام المضادة محددة يظهر S-acylation من هذه البروتينات في عينة المعالجة هيدروكسيلامين (+ حارة هام). العينة المعالجة بكلوريد الصوديوم (- حارة هام) بمثابة تحكم سلبي. وتظهر الانزلات غير المعالجة في حارة الإدخال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت للمخازن المؤقتة الشائعة الاستخدام المطلوبة في البروتوكول. 2SHB العازلة والمخزن المؤقت A يمكن إعدادها مقدما ولكن يجب التحقق من درجة الحموضة الخاصة بهم بانتظام. يجب إعداد الليسيس المؤقت وHAM في يوم التجربة.

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.