Method Article

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

DOI:

10.3791/61031

⸱

May 9th, 2020

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف هنا هو بروتوكول لتحديد أربعة الأيضات التربتوفان مختلفة ولدت في مسار الكينارينين (الكينارينين، 3-هيدروكسيكينورين، حمض زانثيورينيك، 3-حمض هيدروكسيانثرانياليك) في الوسط الذي تم جمعه من الثقافات الخلايا السرطانية تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب واحد رباعية الطيف الكتلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تلقى مسار الكينيرينين والانتبولات التربتوفان دعا kynurenines زيادة الاهتمام لمشاركتها في تنظيم المناعة وبيولوجيا السرطان. وغالبا ما تستخدم في المختبر خلية الخلية المقايسة لمعرفة المزيد عن مساهمة مختلف نواتج التريبتوفان في آلية المرض ولاختبار الاستراتيجيات العلاجية. خلية ثقافة المتوسطة التي هي غنية في المستقلبات السرية وجزيئات الإشارات يعكس حالة الأيض التربتوفان وغيرها من الأحداث الخلوية. بروتوكولات جديدة لتحديد موثوق بها من الكينيرينينات متعددة في المتوسطة خلية معقدة ثقافة مطلوبة للسماح لتحليل موثوق وسريع من عينات متعددة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة بمنظار الطيف الكتلي. وتستخدم هذه التقنية القوية في العديد من المختبرات السريرية والبحثية من أجل القياس الكمي من المستقلبات ويمكن استخدامها لقياس الكينيرينينات.

هنا هو استخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب الطيف الطيفي كتلة رباعية واحدة (LC-SQ) لتحديد في وقت واحد من أربعة kynurenines، أي، الكيونرينين، 3-هيدروكسيكي نيورينرينين، 3-هيدروكسيانثرانليك، وحمض xanthurenic في المتوسطة التي تم جمعها من الخلايا السرطانية في المختبر. SQ كاشف بسيط للاستخدام وأقل تكلفة بالمقارنة مع مطياف كتلة أخرى. في تحليل SQ-MS، يتم إنشاء أيونات متعددة من العينة وفصلها وفقًا لنسبة الكتلة إلى الشحنة المحددة(m/z)، متبوعة بالكشف باستخدام وضع مراقبة الأيونات الواحدة (SIM).

وتسترعي هذه الورقة الانتباه إلى مزايا الطريقة المبلغ عنها وتشير إلى بعض نقاط الضعف. وهو يركز على العناصر الحاسمة لتحليل LC-SQ بما في ذلك إعداد العينة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي. كما تناقش مراقبة الجودة، وظروف معايرة الأسلوب، وقضايا تأثير المصفوفة. وصفنا تطبيق بسيط من 3-نيتروتروروسين كمعيار واحد التناظرية لجميع التحليلات المستهدفة. وكما أكدت التجارب التي أجريت على خلايا سرطان المبيض والثدي، فإن الطريقة المقترحة من LC-SQ تولد نتائج موثوقة ويمكن تطبيقها كذلك على النماذج الخلوية المختبرية الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسار الكينيرينين (KP) هو الطريق الرئيسي للتريبتوفان (Trp) تقويض في الخلايا البشرية. إندولام-2،3-ديوكسيجيناز (IDO-1) في الخلايا خارج الكبد هو أول والحد من إنزيم KP ويحول Trp إلى N-formylkynurenine1. خطوات أخرى داخل KP توليد الأيض الثانوية الأخرى, وهي الكينيرينين التي تحمل خصائص بيولوجية مختلفة. Kynurenine (Kyn) هو أول ثابت Trp مستقرة تظهر الخصائص السامة وتنظيم الأحداث الخلوية بعد ربط لمستقبلات الهيدروكربونات آرل (AhR)2. في وقت لاحق, يتم تحويل كين إلى عدة جزيئات إما تلقائيا أو في العمليات التي تتوسطها انزيم, توليد هذه الأيضات مثل 3-هيدروكسيكينرينين (3HKyn), حمض الجمرة الخبيثة (AA), 3-حمض هيدروكسيانثانليك (3-ها)، حمض الكيون....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد معيار 3NT، كين، 3HKyn، 3HAA، XA حلول الأسهم القياسية

  1. وزن الكواشف في قارورة بأعلى دقة (0.3 ملغ لكل من الزّين). للحصول على دقة أفضل، وتوسيع نطاق الكواشف، وضبط حجم المذيب وفقا للخطوة 1.2.
  2. تذوب الكواشف في 300 ميكرولتر من المذيبات للحصول على محلول مخزون من 1 g/L. 3NT في 1٪ (v/v) حمض الفشكل (FA) في الماء؛ Kyn, 3HAA, وXA في ثنائيات الدايميتيل السلفوكسيد (DMSO); 3HKyn في الماء حموضة إلى 2.5 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك (HCl).
    تنبيه: 3HAA يهيج العينين والأنف والحنجرة والرئتين. وهو ضار عند استنشاقه ، في اتصال مع الجلد ، وإذا ابتلع. ارتداء الحماية المناسبة، أي القفازات والقناع.
  3. إغلاق بإحكام القارورة ووضعها في حمام بالموجات فوق الصوت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LC-MS يقدم مزايا لا جدال فيها في القياس الكمي للجزيئات النشطة بيولوجيا، على الرغم من أن بعض مكونات العينات المعقدة تسبب ما يسمى آثار المصفوفة وتئينات حل وسط من التحليلات. وهو يؤدي إلى قمع الأيونات أو تعزيز أيون، وتناقص دقة بقوة، وتؤثر على حد من الكشف /الكم من LC-MS، والتي تعتبر نقطة ''ضعيفة' من الأسلوب. في بروتوكول لدينا، يتم إنشاء الأيونات عن طريق التأين الكهربائي (ESI) في الوضع الإيجابي، والتي كانت تستخدم أيضا في دراسات أخرى على تحديد الأيض Trp13. ESI، ومع ذلك، هو أكثر عرضة لآثار المصفوفة من ضغط.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الورقة يعرض بروتوكول مفصل LC-SQ للقياس الكمي المتزامن من أربعة الأيض Trp الرئيسية (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) التي تقاس في وسط من الخلايا السرطانية البشرية في المختبر. ويولى اهتمام خاص لإعداد العينات، وإجراء قياس الطيف الكروماتوغرافي/الكتلة، وتفسير البيانات، وأهم النقاط في التحليل.

بشكل عام، يتطلب تحليل LC-MS، بسبب الحساسية العالية، أعلى معايير صرامة البروتوكول ونقاء المواد المستخدمة. وهو يشير إلى تطبيق تنظيفها بدقة وغسلها بشكل صحيح الأواني الزجاجية، فضلا عن المواد الكيميائية عالية الج.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل الاتحاد الأوروبي من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية في إطار تطوير البرنامج التنفيذي لبولندا الشرقية 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00)، من قبل كلية التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيئية التابعة لجامعة جون بول الثانية الكاثوليكية في لوبلين (منحة العلماء الشباب لمنظمة إيلونا سادوك)، المركز البولندي الوطني للعلوم، OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 لماغدالينا ستانيسزسكا، المحقق الرئيسي).  يشكر المؤلفون البروفيسور Agnieszka Ścibior من مختبر الأكسدة ، ومركز البحوث متعددة التخصصات ، JPII CUL لتقاسم المعدات لاستزراع الخلايا والتكميم البروتيني.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-hydroksy-DL-kynureninaSigma-AldrichH1771
3-حمض هيدروكسي أنثرانيليكسيجما ألدريتش14877697٪
3-nitro-L-التيروزينسيجما-ألدريتشN7389
أسيتونيتريلسوبيلكو1.00029هايبرgrade ل LC-MS LiChrosolv
مسحوق الفحم المنشطSupelco05105
الميزان التحليليOhaus
العمود التحليليAgilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18 دقة سريعة HT (2.1 × 100 مم ، 1.8 وميكرو ؛ م)
مواد لمواد فورمات الأمونيومSupelco7022ل LC-MS و LiChropur و GE ؛ 99.0٪
ألبومين مصل البقرSigma1001887398
للقوارير الكروماتوغرافيةAgilent Technologies5185-5820أغطية لولبية زرقاء ، PTFE / أحمر سيل سيبا
طبق ثقافة الخليةعش704004البوليسترين ، غير بيروجينيك ، معقم
لوحة ثقافة الخليةBiologix07-601212 بئر ، غير بيروجيني ، غير سامة ، معقمة
حاضنة الخليةThermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
جهاز طرد مركزيEppendorfنموذج 5415R
أجهزة طرد مركزيEppendorfنموذج 5428
أنابيب الطرد المركزيBionovoB-2278نوع Eppendorf ، أنابيب طرد مركزي 1.5 مل
BionovoB-3693نوع Falcon ، 50 مل ، بيانات كروماتوغرافية PP
برنامج الاكتساب والتحليلAgilent TechnologiesLC / MSD ChemStation (B.04.03-S92)
قوارير إدراج كروماتوغرافيةAgilent Technologies9301-1387100 & L
قوارير كروماتوغرافيةAgilent Technologies5182-07142 مل ، زجاج شفاف
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSupelco1.02950Uvasol
Dubelcco ' s النسر المعدل s متوسطة (DMEM)PAN BiotechP04-41450
مقياس مزدوج الأس الهيدروجيني / الموصليةMettler ToledoSevenMulti
EvoratorGenevacموديل EZ-2.3 Elite
Fetal Fibro SerumSigma-AldrichF9665
حمض الفورميكSupelco5.33002ل LC-MS LiChropur
زجاجة زجاجية لتخزينالكواشفBionovoS-207050 مل ، زجاج
شفاف عمود الحمايةAgilent Technologies959757-902عمود الحماية ذو التجويف الضيق Zorbax Eclipse Plus-C18 (2.1 × 12.5 مم ، 5 & micro ؛ م)
حمض الهيدروكلوريكميرك1.00317.1000
L-kynurenineSigma-AldrichK8625& ge ؛ 98٪ (HPLC)
مغناطيسيWigoES 21 H
MicrobalanceMettler Toledoموديل XP6
نظام Milli-QMilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV مع مضخة
مطياف الكتلة رباعي الأقطابAgilent TechnologiesG1948Bموديل 6120
البنسلين ستربتومايسينسيجما أدريتش048M4874V
قارئ الألواحBio TekSynergy 2 الذي تديره Gen5
كلوريد البوتاسيومMerck1.04936.1000
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومMerck1.05108.0500
مركز كاشف صبغة فحص البروتينBioRad500-0006
أرجوحة المنشارستيوارتSSL4
عش3260015 مل ، بوليسترين ، غير بيروجيني ، معقم
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتش7647-14-5
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةميرك1.06346.1000
مرشح مدخل المذيباتAgilent Technologies5041-2168فلتر زجاجي ، 20 & mu ؛ حجم المسام
م خزان المذيبات (ل LC-MS)Agilent Technologies9301-65241 لتر ، زجاج شفاف
خزان مذيبات (ل LC-MS)Agilent Technologies9301-65261 لتر ، برنامج جداول بيانات زجاج العنبر
Microsoft OfficeMicrosoft Office
شريط التحريكBionovo6-2003مرشحات حقنة مطلية بالتفلون
للثقافة الترشيح المتوسطBionovo7-8803السليلوز المتجدد ، & Oslash ؛ 30 مم ، 0،45 & micro ؛ مرشحات
الحقنة م لترشيح مكونات المرحلة المتنقلةBionovo6-0018نايلون ، & Oslash ؛ 30 مم ، 0،22 وميكرو ؛ م
لوحات زراعة الأنسجةVWR10062-90096 بئر ، محلول تعقيم
Trypsin-EDTASigma-AldrihT4049-100 مل
نظام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداءAgilent TechnologiesG1367D ، G1379B ، G1312B ، G1316C1200 يتكون نظام Infinity من جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي (G1367D) ، مزيل الغازات (G1379B) ، المضخة الثنائية (G1312B) ، ترموستات العمود (G1316C)
حمام بالموجات فوق الصوتية104533بولسونيكموديل 6D
VortexBiosanموديل V-1 بالإضافة إلى
حمض الزانثورينيكسيجما ألدريتشD12080496٪
مادة مضافة أغطية محرك ماصة مصلية Excel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immun....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kynurenine QuantificationLiquid ChromatographyMass SpectrometryCancer Cell CultureSample PreparationCalibration CurveSingle Ion MonitoringProtein NormalizationQuality ControlInternal Standard

Related Articles