مقالة منهجية

الفلورسنت المناعية من البروتينات و البكتينات أرابينغالات في جدار الخلية من الأنسجة النباتية

6.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61034

⸱

فبراير 27, 2021

 ,  , 
1Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2Laboratório Associado para a Química Verde, 3Dipartimento di Bioscienze, Universitá degli Studi di Milano

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إصلاح المواد النباتية لإضفاء الطابع المناعي على البروتينات والبكتين العربي ، وجزءًا من راتنج الأكريليك المائي ، المقطع والمثبت على الشرائح الزجاجية. نظهر سيتم الكشف عن epitopes جدار الخلية ذات الصلة مع الأجسام المضادة محددة.

الملخص

ويشمل تطوير النبات تعديلات ثابتة على تكوين جدار الخلية وهيكلها استجابة للمحفزات الداخلية والخارجية على حد سواء. وتتألف جدران الخلايا من السليلوز وغير السليلوزية السكريات جنبا إلى جنب مع البروتينات والمركبات الفينولية والماء. يتكون 90٪ من جدار الخلية من السكريات (مثل البكتين) وبروتينات أرابينوغالكاتا (AGPs). يبقى تحديد مكان المناعة الفلورية من أسطح جليكان محددة في أقسام النسيج النباتية أداة رئيسية للكشف عن إعادة عرض الشبكات السكاريد الجدار، والهيكل والمكونات.

هنا، نحن الإبلاغ عن إجراء تحسين المناعة الفلورية للكشف عن epitopes الجليكان من AGPs والبكتين في الأنسجة النباتية. وقد استخدم تثبيت Paraformaldehyde/glutaraldehyde جنبا إلى جنب مع LR-White تضمين عينات النبات، مما يسمح للحفاظ على نحو أفضل من بنية الأنسجة وتكوينها. واستخدمت أجزاء رقيقة من العينات المضمنة التي تم الحصول عليها مع microtome فائقة لlocalization المناعة مع الأجسام المضادة محددة. هذه التقنية تقدم دقة كبيرة، وخصوصية عالية، وفرصة للكشف عن عدة ظهارات الجليكان في نفس العينة. هذه التقنية تسمح توطين دون الخلية من الجليكان ويكتشف مستوى تراكمها في جدار الخلية. كما يسمح بتحديد الأنماط الزقتية -الزمنية لتوزيع البكتين و البكتين أثناء العمليات التطويرية. استخدام هذه الأداة قد توجه في نهاية المطاف اتجاهات البحوث وربط الجليكانات لوظائف محددة في النباتات. وعلاوة على ذلك، يمكن للمعلومات التي تم الحصول عليها أن تكمل الدراسات الكيميائية الحيوية ودراسات التعبير الجيني.

المقدمة

جدران الخلايا النباتية هي هياكل معقدة تتألف من السكريات وبروكرينات الجليكو. جدران الخلية هي هياكل ديناميكية للغاية التي تختلف هندستها التنظيمية ، والتنظيم والتركيب وفقا لنوع الخلية ، والتوطين ، ومرحلة التنمية ، ومحفزات خارجية وداخلية1. تعتبر بروتينات أرابينوغالات (AGPs) والبكتين مكونات مهمة من جدار الخلايا النباتية. إن البروتينات والجليكوسيلات عالية البيرة والبكتين هي السكاريدات المثلية التي تختلف تكوينها وكميتها وبنيتها اختلافاً كبيراً خلال مراحل نمو النباتات المختلفة2،3،4. وقد كشفت الدراسات AGPs والبكتين مشاركتهم في العديد من العمليات النباتية مثل موت الخلايا المبرمجة، والاستجابة للضغوط اللاأحيائية، والتكاثر النباتي الجنسي، من بين أمور أخرى كثيرة5. وقد بدأت معظم هذه الدراسات بمعلومات تم الحصول عليها من دراسات نقل المناعة.

ونظرا لتعقيدها، فإن دراسة جدران الخلايا تتطلب العديد من الأدوات المختلفة. الكشف عن الظهارات الجليكان باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) هو نهج قيم لحل توزيع السكرياتيدات وجليكوبروتين على طول هذا الهيكل. هناك مجموعة كبيرة من mAbs المتاحة للكشف عن epitopes الجليكان ويتم تحسين خصوصية كل ماب بشكل مستمر وكذلك6. التقنية الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على جميع أنواع النباتات، وهي أداة مثالية لتوجيه اتجاهات البحث المستقبلية التي قد تنطوي على تقنيات أكثر تكلفة وتعقيدا.

في هذه التقنية، يتم الاقتران مع أجسام مضادة محددة كيميائيا لأصباغ الفلورسنت مثل FITC (الفلوريسين ايزوثيوسانات)، TRITC (tetramethylrhodamine-5-(و 6)-isothiocyanate) أو عدة صبغات فلور اليكسا. يوفر الفلورسينت العديد من المزايا، مما يسمح بتعريب الخلايا دون الخلوية الواضحة والسريعة للجليكانات التي يمكن ملاحظتها مباشرة تحت مجهر الفلورانس. وهو محدد وحساس للغاية ، لأن إعداد العينة يمكن أن يحمي بشكل فعال الهيكل الطبيعي للمستضد ، حتى لو كان موجودًا بكميات أقل. فإنه يسمح للكشف عن مستضدات متعددة في نفس العينة والأهم من ذلك، ويقدم جودة عالية ونتائج جميلة بصريا. على الرغم من القوة العظمى التي تقدمها دراسات تحديد المواقع المناعية المفلورة ، فإنها غالبا ما تعتبر صعبة الأداء والتنفيذ على الأرجح بسبب عدم وجود بروتوكولات مفصلة تسمح بالتصور من مختلف خطوات الإجراء. هنا، ونحن نقدم بعض المبادئ التوجيهية البسيطة حول كيفية تنفيذ هذه التقنية وكيفية الحصول على صور ذات جودة عالية.

بالنسبة للبروتوكول المقدم هنا، يجب أولاً إصلاح العينات وإضمانها باستخدام المثبت الأكثر ملاءمة. على الرغم من اعتبارها تقنية مستهلكة للوقت ومملة نسبيًا ، فإن التثبيت السليم وتضمين عينة النبات هو المفتاح لضمان إجراء فحص مناعي ناجح. لهذا الغرض، فإن الأكثر شيوعا هو تثبيت المواد الكيميائية باستخدام المثبتات عبر الربط، مثل الألدهيدات. المثبتات المتبادلة الربط إنشاء الروابط الكيميائية بين جزيئات الأنسجة، وتحقيق الاستقرار وتصلب العينة. الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد هي عبر ربط المثبتات، وأحيانا يتم استخدام مزيج من كل من المثبتات7. الفورمالديهايد يقدم الحفاظ الهيكلية كبيرة من الأنسجة لفترات طويلة من الزمن، وإنتاج تراجع الأنسجة الصغيرة ويجري متوافقة مع المناعة. الجلثارالدهيد هو تثبيت أقوى ومستقرة تستخدم عادة في تركيبة مع الفورمالديهايد. استخدام الجلوتارالدلديهايد لديه بعض العيوب التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار لأنه يقدم بعض المجموعات الألدهيد الحرة في الأنسجة الثابتة, التي قد تولد بعض العلامات غير محددة. أيضا الربط بين البروتينات والجزيئات الأخرى في بعض الأحيان قد تجعل بعض epitopes الهدف لا يمكن الوصول إليها للأجسام المضادة. لتجنب هذا، يجب تحديد كمية ومدة التثبيت بعناية.

بعد التثبيت، يتم تضمين عينات في الراتنج السليم لتصلب قبل الحصول على أقسام. لندن الراتنج (LR-الأبيض) الراتنج الاكريليك هو الراتنج المفضل لدراسات تخصيص المناعة. على عكس راتنجات أخرى، LR-White هو ماء، مما يسمح للأجسام المضادة للوصول إلى المستضدات الخاصة بهم، مع عدم الحاجة إلى أي علاج لتسهيل ذلك. LR-White لديها أيضا ميزة تقديم انخفاض فلورا لصناعة السيارات، مما يسمح للحد من الضوضاء الخلفية أثناء تصوير المناعة.

هناك العديد من تقنيات التلطيخ المتاحة للكشف عن مكونات مختلفة من جدار الخلية، مثل تلطيخ الأزرق ألسيان، تلطيخ الأزرق التلوويدين أو حمض الدورية شيف (PAS) تلطيخ. لا شيء من هذه تقدم قوة تحليل تخصيص المناعة8. هذا النهج يعطي قدرا أكبر من التحديد في الكشف عن الجليكان، وتقديم معلومات أوسع بشأن تكوين جدار الخلية وهيكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد العينة: التثبيت، والجفاف، وLR-الأبيض تضمين

  1. التثبيت والجفاف
    ملاحظة: عملية التثبيت هامة للحفاظ على العينة; عن طريق الجزيئات crosslinking يتم إيقاف الأيض الخلوية، وضمان سلامة الخلوية ومنع الانتشار الجزيئي. يجب تعديل العوامل المثبت والتركيز المستخدم لهذا الغرض ، مما يترك المستضدات معرضة بما فيه الكفاية للتفاعل مع الأجسام المضادة. البروتوكول التالي يجمع بين القدرة تثبيت معتدل من ما قبلية، مع تأثير أقوى من الجلوتارالديهيد. تم تحسين نسبها لمكونات AGPs وجدار الخلية ، ولكنها مناسبة للبروتينات الأخرى وهياكل الخلايا. عملية الجفاف اللاحقة سوف تعد العينات لتضمين LR-الأبيض. واستخدمت في هذه التجربة الأنسجة النباتية من عدة أنواع نباتية. تم جمع عينات من الـ Quercus suber من الأشجار التي تمت زراعتها في الحقل. عينات الغمر Trithuria كانت تشارك التكرم معنا من قبل بولا Rudall (حدائق كيو، لندن، المملكة المتحدة).
    1. زرع جميع النباتات العربية على التربة مباشرة وتنمو في منشأة نمو داخلية مع 60٪ الرطوبة النسبية ودورة نهار / ليلة من 16 ساعة ضوء في 21 درجة مئوية و 8 ح الظلام عند 18 درجة مئوية. حدد الأنسجة النباتية التي سيتم تحليلها، وتقليم العينات لتكون لا تزيد عن 16 ملم2 في الحجم.
    2. نقل على الفور العينة إلى قارورة الزجاج شغلها سابقا مع ما يكفي من محلول المثبت الباردة (2٪ الفورمالديهايد (ث / الخامس)، 2.5٪ glutaraldehyde (ث / الخامس)، 25 mM PIPES pH 7 و 0.001٪ توين-20 (الخامس / الخامس)) لغمر تماما العينات(الشكل 1A).
      تنبيه: الفورمالديهايد والغلوثارالدهيد كلاهما عوامل تثبيت يمكن أن تكون ضارة عن طريق الاستنشاق والاتصال. قم بتنفيذ خطوة التثبيت على غطاء الدخان وارتداء الملابس الواقية الكافية وقفازات النتريل. جميع الحلول من هذه الخطوة فصاعدا، بما في ذلك سلسلة الكحول حتى 70٪، يجب أن يتم تخزينها لإزالة التلوث في وقت لاحق من قبل الموظفين المتخصصين.
    3. بعد جمع كل العينات، تحديث المثبت.
    4. نقل قارورة إلى فراغ الغرفة، وتطبيق الفراغ ببطء. عند الوصول إلى -60 كيلو باسكال، سوف تبدأ المواد العائمة في الغرق إلى أسفل القارورة(الشكل 1B).
    5. تبقى تحت فراغ لا يزيد عن -80 كيلو باسكال لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    6. الإفراج ببطء الفراغ، وختم الزجاج القارورة ومكان بين عشية وضحاها في 4 °C.
    7. تجاهل أية عينات لم تغرق أثناء التثبيت بين عشية وضحاها. اغسل العينات المتبقية بـ 25 mM PBS pH 7 لمدة 10 دقائق ، تليها 20 دقيقة من الغسيل في 25 mM PIPES pH 7.2.
    8. تجفيف العينات في سلسلة الإيثانول (25٪ ، 35 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، و 3x 100 ٪ الإيثانول) لمدة 20 دقيقة لكل من. نقل عينات المجففة فورا إلى قارورة الزجاج المسمى لتضمين (الشكل 1C).
      ملاحظة: يمكن إيقاف عملية الجفاف مؤقتاً عند خطوة الإيثانول بنسبة 70٪.
  2. LR-أبيض الراتنج تضمين
    ملاحظة: LR-أبيض هو راتنج الاكريليك غير المائية مع اللزوجة منخفضة، مما يجعلها مثالية لاختراق الأنسجة مع العديد من جدران الخلايا سميكة الطبقات. LR-White يأتي أيضا في عدة درجات صلابة متوافقة لقطع معظم عينات النباتات. يرجى التأكد من أن الراتنج المستخدمة تم تزويدها بالفعل مع محفز مناسب مختلطة في، أو اتباع تعليمات المورد لإعداد الراتنج. عملية التضمين التالية بطيئة ولكن النتائج تبرر إلى حد كبير الوسائل.
    1. اثقب العينات عن طريق احتضان الراتنج LR-White في سلسلة من تركيزات الهلال من الراتنج (1:3، 2: 3، 1: 1، 3: 2، 3: 1، 1: 0) في الإيثانول، في حضنة لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في كل خطوة.
      تنبيه: LR-الراتنج الأبيض هو الراتنج الاكريليك منخفضة السمية; ومع ذلك، قد يكون مصدر إزعاج للجلد عن طريق الاتصال والاستنشاق. ويوصى بشدة العمل في منطقة جيدة التهوية أو تحت غطاء الدخان مع ارتداء واقية مناسبة وقفازات نيتريل.
    2. تحديث الراتنج LR-أبيض واحتضان لمدة 12 ساعة إضافية في 4 °C.
    3. إعداد كبسولات الجيلاتين التضمين الحجم المناسب (حجم 1 (0.5 مل) للعينات حتى 3 مم، 2 × 0.37 مل للعينات حتى 5 مم أو 3 × 0.3 مل للعينات حتى 8 مم، وعلامات الورق(الشكل 1D).
      ملاحظة: حدد حجم الكبسولة ليكون أكبر قليلاً من العينة، بحيث يمكن وضع العينة بالكامل في الراتنج. أيضا، تذكر أن تسمية العلامات مع قلم رصاص، لأن القلم أو أحبار المطبوعة سوف تلوث الراتنج، وتدمير العينة.
    4. تطبيق قطرة واحدة من الراتنج LR-أبيض جديد إلى الجزء السفلي من كل كبسولة.
    5. ضع عينة في كل كبسولة الجيلاتين وملء إلى أقصى حد ممكن مع الراتنج الطازج. ضع غطاء الكبسولة واضغط بلطف لتشكيل ختم محكم (الشكل 1E).
    6. البلمرة الراتنج لمدة 24 إلى 48 ساعة في 58 درجة مئوية، أو حتى تصلب تماما.
    7. تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: آخر البلمرة LR-الراتنج الأبيض خامل.

2. إعداد الشرائح

ملاحظة: يجب أن تكون الشرائح الزجاجية نظيفة وخالية من أي غبار أو شحوم أو أي ملوثات أخرى. حتى الشرائح الجديدة يجب تنظيفها لأن بعض الموردين يستخدمون الزيوت والمنظفات لمنع الشرائح من التمسك معا. أي الشحوم أو المنظفات سوف تتداخل مع التصاق القسم إلى الشريحة، حتى لو تعامل مع بولي-L-ليسين. الوبر والغبار سيؤثر على ملاحظات العينة وربما يفسد التجربة. شرائح تفلون المغلفة مع رد فعل الآبار هي مثالية لهذه المهمة. فهي بأسعار معقولة، قابلة لإعادة الاستخدام، ويقلل بشكل كبير من كمية حل الأجسام المضادة اللازمة. مع التنظيف السليم، يمكن إجراء ممتازة نوعية الفلورسنت المناعية بتكلفة معقولة جدا.

  1. غسل الشرائح
    1. ضع الشرائح في رف تلطيخ وغطيها بمحلول التنظيف (0.1٪ SDS (ث / الخامس)، 1٪ حمض الخليك (v/v)، 10٪ الإيثانول (v/v)).
    2. الحفاظ على الانفعالات خفيفة لمدة 20 دقيقة.
    3. نقل رفوف تلطيخ إلى حمام ddH2O مع الانفعالات خفيفة لمدة 10 دقيقة. كرر 4 مرات.
    4. استصفي الرفوف بعناية قبل أن تغمس لفترة وجيزة في الإيثانول بنسبة 100٪، واترك الشرائح تجف في بيئة خالية من الغبار.
    5. يُخزن حتى الاستخدام.
  2. بولي-L-ليسين طلاء (اختياري)
    ملاحظة: عادة ما تلتصق الأقسام الصغيرة بشكل جيد جدًا بزلاقات الزجاج النظيف. هذه الخطوة هي فقط من المستحسن لأقسام أكبر (> 2 ملم2). أقسام أكبر تميل إلى أضعاف والتجاعيد، وليس من المستحسن. ومع ذلك، إذا لزم الأمر استخدام الشرائح رد فعل مع ثقوب أكبر. تنظيفها على النحو الوارد أعلاه والمضي قدما على النحو التالي.
    1. ضع شرائح نظيفة في طبق بيتري مربع. Pipette 0.001٪ بولي-L-lysine حل (ث / الخامس) لتغطية ثقوب الشرائح، دون تفيض.
    2. دع الشرائح تجف بين عشية وضحاها عند 40 درجة مئوية في أطباق بيتري مغلقة.
      ملاحظة: الشرائح المغلفة جاهزة للاستخدام الفوري ويمكن تخزينها في بيئة خالية من الغبار في درجة حرارة الغرفة، لعدة أشهر.

3. عينة التشذيب والقطع

  1. عينة التشذيب
    1. مع شفرة حادة، تقليم كتل LR-الأبيض تحت stereomicroscope لتشكيل هيكل هرمي الشكل حيث قمة عمودي على منطقة اهتمام العينة(تكميلية الشكل 1A).
      ملاحظة: حامل العينة فائقة الصغر هو أداة ممتازة لتأمين كتلة. إذا لم يكن الجهاز حامل عينة عالمية، استخدم واحد الأكثر ملاءمة للكميات المستديرة.
    2. تقليم هيكل هرمي عن طريق إزالة شرائح غرامة من الراتنج الزائد عموديا على المحور الرئيسي الهرم.
    3. استمر حتى يتم الوصول إلى العينة لتشكيل سطح القطع. ضمن سطح القطع، يجب أن تكون العينة الهدف مُحاطة بشكل شبه منحرف.
      ملاحظة: يمكن أن يتم تشذيب كتلة الراتنج في زاوية الشق لتقليل مساحة سطح القسم بشفرة حادة (الشكل 1F).
  2. اقسام شبه رقيقة
    ملاحظة: سيتم استخدام ميكروتوم مع السكاكين الزجاجية. قدرة الجسم المضاد على ربط epitope سوف شرط نجاح رد فعل مناعي. وسوف تسمح الطبيعة المائية من راتنج LR-الأبيض للاتصال جيدة من الأجسام المضادة مع أقسام العينة. سوف أرق المقاطع تقديم تلوين Calcofluor fainter التي سيتم استخدامها للمساعدة في تحديد موقع المقاطع والمساعدة في عملية التصوير. وينطبق الشيء نفسه على البقع الأخرى التي قد تطبق في وقت لاحق. كما أن سمك مفرط يؤثر على جودة الحصول على الصور. يمكن العثور على حل وسط جيد لسمك القسم بين 200 و 700 نانومتر ، اعتمادًا على خصائص الأنسجة. جبل كتل بإحكام على حامل العينة من microtome فائقة.
    1. مع microtome فائقة، وجعل المقاطع بسماكة بين 200 و 700 نانومتر (الشكل 1G).
    2. تحقق من منطقة المقطع عن طريق نقل بعض المقاطع إلى قطرة ddH2O على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على صفيحة ساخنة 50 درجة مئوية حتى يتبخر الماء. وضع وصمة عار قطرة 1٪ تولويدين الأزرق O (ث / الخامس) في 1٪ محلول حمض البوريك (ث / الخامس) على أقسام لمدة 30 ث. شطف ومراقبة تحت المجهر.
    3. عند العثور على الهيكل المطلوب، نقل واحد أو قسمين إلى كل قطرة من DdH2O وضعت سابقا على كل بئر من شريحة رد فعل نظيفة.
    4. ضع كل شريحة في طبق بتري مربع مغلق 10 سم واتركه جافًا عند 50 درجة مئوية.
    5. تخزين الشرائح في صندوق أرشيف نظيف حتى الاستخدام.

4- نقل المناعة

ملاحظة: يعتمد إجراء تخصيص الفلورسنت المناعي على الاستخدام المتسلسل لأجسامتين مضادتين. يتم رفع الأجسام المضادة الأولية ضد مستضد مستهدف محدد. يتم رفع الأجسام المضادة الثانوية على وجه التحديد ضد الأجسام المضادة الأولية ويتم الاقتران مع تقنيات الفلورسنت إلى الفلوروفور (FITC في هذا البروتوكول المحدد). سيتم استخدام الأجسام المضادة الأولية للكشف عن المستضد المستهدف في العينة، وسيتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتحديد الموقع حيث يتم توصيل الجسم المضاد الأساسي بالعينة بعد غسل الفائض من الأجسام المضادة الأولية. الضوابط هي جزء مهم من هذا الفحص ويجب دائما أن يتم تنفيذها لضمان دقة الملاحظات. يجب حجز بئر واحد على الشريحة للاستخدام كتحكم سلبي ، حيث سيتم تخطي علاج الأجسام المضادة الأولية ، وبالتالي لا ينبغي ملاحظة أي إشارة في نهاية التجربة. يجب أن تدرج سيطرة إيجابية في التجربة عن طريق معاملة واحدة بشكل جيد مع الأجسام المضادة التي وسم بالفعل معروفة ومؤكدة. يتم استخدام التحكم الإيجابي لتأكيد فعالية وسم الأجسام المضادة الثانوية وظروف التفاعل بينما يختبر التحكم السلبي خصوصية الأجسام المضادة الثانوية.

  1. إعداد غرفة الحضانة عن طريق وضع بعض المناشف الورقية المثبطة في الجزء السفلي من مربع نصائح ماصة والتفاف عليه مع رقائق القصدير(تكميلية الشكل 1B-1E). ضع الشرائح في غرفة الحضانة.
  2. Pipette قطرة 50 ميكرولتر لكل 8 مم جيدا من محلول منع (5٪ الحليب الجاف غير الدهنية (ث / الخامس) في 1 م PBS) واحتضان لمدة 10 دقيقة. إزالة حل حجب وغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
  3. إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول التكميلي 1)، 1:5 (v/v) الأجسام المضادة في حل الحجب؛ جعل تقدير حوالي 40 ميكرولتر لكل 8 ملم جيدا.
    ملاحظة: يجب تعديل تركيز الأجسام المضادة وفقًا لبروتوكول التصنيع.
  4. قم بإجراء غسل نهائي مع ddH2O لمدة 5 دقائق ، ولا تدع الآبار تجف تمامًا.
  5. الماصات الحل الأجسام المضادة الأولية لآبار رد الفعل. ماصة حظر حل لآبار التحكم.
  6. أغلق غرفة الحضانة ودع الوقوف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة متبوعة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية، 1٪ في حل حظر (v/ الخامس) حوالي 40 ميكرولتر في البئر. يبقيه مغطاة مع احباط القصدير.
  7. اغسل جميع الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق ، تليها 10 دقائق إضافية مع ddH2O. تأكد من عدم وجود أثر لمحلول الحجب أو الرواسب مرئية على الآبار.
  8. الماصات حل الأجسام المضادة الثانوية لجميع الآبار. من الآن فصاعداً، احمي الشرائح من الضوء.
  9. احتضان لمدة 3-4 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  10. غسل جميع الآبار مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تليها آخر غسل 10 دقيقة مع ddH2O.
  11. تطبيق قطرة من كالكوفلور (1:10,000 (ث / الخامس) الفلورسنت 28 أكثر إشراقا في برنامج تلفزيوني) إلى كل بئر. دون غسل، وتطبيق قطرة من المتوسط تصاعد (انظر جدول المواد)إلى كل بئر ووضع غطاء (الشكل 1H).
  12. مراقبة مع المجهر الفلوريس، ومجهزة 10x/0.45، 20x/0.75، 40x/0.95 و 100x/1.40 عدسة، واستخدام الأشعة فوق البنفسجية (لصبغة الكالفور) ومرشحات FITC، للكشف عن جدار الخلية وlocalization المناعي على التوالي(الشكل 1I). استخدم الأطوال الموجية التالية: الإثارة/الانبعاث (nm) 358/461 للأشعة فوق البنفسجية و485/530 لـ FITC.
  13. للحصول على تصور أفضل للنتائج تتداخل الصور مع ImageJ أو ما شابه ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في تجربة ناجحة ، فإن الأجسام المضادة الثانوية تحديد موقع محدد من epitope في اللون الأخضر مشرق ، بطريقة متسقة ، مما يسمح لتوصيف تكوين جدار الخلية في مرحلة معينة من تطوير الخلية أو الأنسجة أو الجهاز. على سبيل المثال الأجسام المضادة LM6 له صلة عالية ل1,5-arabinan, مركب مع نوع-I rhamnogalacturonan التي يمكن العثور عليها بغزارة وسم جدار الخلية من النمو Quercus suber anther (الشكل 2A), مما يسمح باستنتاج أن هذا النوع من البكتين وفيرة وجزء من تكوين جدار الخلية الأولية. JIM5 لديه تقارب ل hom...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة تحديد المواقع المناعية الفلورية في النباتات الموصوفة هنا ، في حين أنها واضحة بسلاسة ، تعتمد على نجاح العديد من الخطوات الصغيرة. الأول منها هو إعداد العينة واللصلح. خلال هذه الخطوة الأولى، يتم استخدام مزيج من الفورمالديهايد والغلوتارالدهيد لتقاطع التشابك غالبية مكونات الخلية. يوفر الفورمالديهايد في الحل تثبيتًا معتدلًا ويمكن عكسه بينما يوفر الجلوتاراللديهايد ارتباطًا أكثر دائمًا؛ التوازن بين اثنين من المثبتات يوفر المبلغ المناسب من crosslinking، مما يسمح التعرض للeptopes للرد مع الأجسام المضادة الأولية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تلقى المؤلفون الدعم من مشروع الاتحاد الأوروبي 690946 'SexSeed' (الاستنساخ النباتي الجنسي – تكوين البذور) الممول من H2020-MSCA-RISE-2015 وSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. تلقى مشروع AMP منحة من مشروع MSCA-IF-2016 التابع للاتحاد الأوروبي (رقم 753328). تلقت MC منحة من منحة دكتوراه FCT SFRH/BD/111781/2015.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25٪ (وزن / حجم) GluteraldehydeAgar ScientificAGR1010aq. محلول ، خالي من الميثانول
8 آبار شرائح تفاعل زجاجييمكن استخدام MarinfeldMARI1216750ماركات أخرى
يمكن استخدام حمض الخليكSigma-AldrichA6283
Anti-Rat IgG (جزيء wole) - الجسم المضاد FITC المنتج فيSigma-AldrichF6258
، 24 مم × 50 مممارينفيلدMARI0100222يجب أن تغطي زلة الغطاء جميع الآبار. يمكن استخدام ماركات أخرى 
ddH2< / sub>Onaالإيثانول
المطلقو
الفلورسنت المشرق 28الجيلاتين Sigma-AldrichF-6259
AgarScientific AGG29211يجب أن يتناسب حجم الكبسولة مع حجم العينة.
قوارير زجاجيةفيأي قوارير زجاجية بسيطة غير مكلفة يمكن إغلاقها, يمكن استخدامها. يمكن تنظيف القوارير بنسبة 96٪ من الإيثانول بعد الاستخدام لإزالة بقايا LR-White وإعادة استخدامها.
Agar ScientificAGR1281الدرجة المتوسطة LR-Whiteفي عدة أشكال ؛ توفر الدرجة المتوسطة دعما مناسبا للقطع لمعظم الأنسجة ، بينما بالنسبة للأنسجة الصلبة ، قد يوصى بدرجة أصعب من LR-white. إذا أمكن ، استخدم راتينجا ممزوجا بالفعل بمنشط التبول (البنزويل بيروكسايد) ، إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيرجى اتباع تعليمات المورد لتحضير الراتنج.
حليب جاف خالي من الدسمNestl & eacute;فيأي حليب جاف خالي من الدسم كاف
فرنفيفرن مختبر عام
طبق بتري ، 10 سم × 10 سم مربعو
أنابيبSigma AldrichP1851
فئران ولدت مجسات نبات أحادية النسيلة المضادة للأجسامتتوفر العديد من الأجسام المضادة التي تتعرف على مكونات جدار الخلية
في كل من مركز أبحاث الكربوهيدرات المعقدة
(CCRC ، جامعة جورجيا بالولايات المتحدة الأمريكية) و Plant Probes (Paul
Knox Cell Wall Lab ، في جامعة ليدز بالمملكة المتحدة). يتم تقديم قائمة قصيرة ب
بعض MABS شائعة الاستخدام وأين يمكن شراؤها
في الجدول التكميلي 1
شفرات الحلاقةفيالحلاقة العادية
SDSSigma-AldrichL6026
Toluidine Blue-OAgar ScientificAGR1727
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UltramicrotomeLeica MicrosystemsUC7
مجهر التألق المستقيم مع مرشحات الأشعة فوق البنفسجية و FITCLeica MycrosistemsDMLb
ومضخة
التفريغومختبرات
VectashieldVectashieldT-1000يمكن استخدام مضادات التلاشي الأخرى. يرجى التحقق من التوافق مع FITC و Fluorescente brightner 28. (ملاحظة: للحصول على بديل غير تجاري ، (انظر Jonhson et al 198218< / sup>) يمكن عمل وسيط مضاد للبهتان عن طريق خلط 25 مجم / مل من 1،4-Diazobicyclo-(2،2،2) أوكتان (DABCO) في 9: 1 (v / v) glycerol إلى 1xPBS. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف.)
زلات غطاء Goat كبسولات يأتي الراتنج LR-White من شفرات غرفة التفريغ

المراجع

  1. Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
  2. Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
  3. Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
  4. Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
  5. Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
  6. Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  7. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505(2017).
  8. Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
  9. Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
  10. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
  11. Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
  12. Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
  13. Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
  14. El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
  15. Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
  16. Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
  17. Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
  18. Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
  19. Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
  20. Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LR White Calcofluor White ImageJ

مقالات ذات صلة