مضاعفة في الكهربائي الرحم يسمح استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. هذه التقنية مفيدة لتصور التفاعلات بين تلك الخلايا التي تستخدم البروتينات الفلورية في الظروف العادية ولكن أيضا بعد التجارب الوظيفية ل الجينات التي تثير الاهتمام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الإلكتروبور الرحمي هو في تقنية نقل الحمض النووي في الجسم الحي تستخدم على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة في الثدييات corticogenesis. يستفيد هذا الإجراء من بطين الدماغ للسماح بإدخال الحمض النووي ذات الاهتمام ويستخدم زوجًا من الأقطاب لتوجيه مدخل المادة الوراثية إلى الخلايا المبطنة للبطين ، وهي الخلايا الجذعية العصبية. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتسمية الخلايا المطلوبة و / أو التلاعب في التعبير عن الجينات من الاهتمام في تلك الخلايا. لديها تطبيقات متعددة، بما في ذلك المقايسات التي تستهدف الهجرة العصبية، وتتبع النسب، ومحور عصبي المسار. ومن السمات الهامة لهذه الطريقة هي سيطرتها الزمنية والإقليمية، مما يسمح بالتحايل على المشاكل المحتملة المتعلقة بالفتاكة الجنينية أو عدم وجود فئران محددة من فئران سائق CRE. جانب آخر ذو صلة من هذه التقنية هو أنه يساعد على الحد إلى حد كبير من القيود الاقتصادية والزمنية التي تنطوي على توليد خطوط الماوس الجديدة ، والتي تصبح ذات أهمية خاصة في دراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا التي تنشأ في مناطق بعيدة من الدماغ في مختلف الأعمار التنموية. هنا نحن وصف استراتيجية مزدوجة الكهربائي التي تمكن من استهداف مجموعات الخلايا التي يتم فصل مكاني وزمنيا. مع هذا النهج يمكننا تسمية أنواع فرعية مختلفة من الخلايا في مواقع مختلفة مع البروتينات الفلورية المختارة لتصور لهم، و / أو يمكننا التعامل مع الجينات من الفائدة التي تعبر عنها هذه الخلايا المختلفة في الأوقات المناسبة. هذه الاستراتيجية تعزز إمكانات في الصعق الكهربائي الرحمي وتوفر أداة قوية لدراسة سلوك مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً التي تهاجر لإقامة اتصالات وثيقة، فضلاً عن التفاعلات طويلة المدى من خلال الإسقاطات المحورية، مما يقلل من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
المقدمة
القشرة الدماغية هي بنية معقدة جدا ومنظمة بشكل معقد. لتحقيق هذه الدرجة من التنظيم، الخلايا العصبية إسقاط القشرية تمر العمليات التنموية المعقدة التي تتطلب جيلها الزمني، والهجرة إلى وجهتها النهائية في لوحة القشرية، وإنشاء اتصالات قصيرة وطويلة المدى1،,2. لفترة طويلة، كانت الطريقة الكلاسيكية لدراسة الكورتيوجينسيس على أساس استخدام نماذج الميرين بالضربة القاضية أو الروبوت في الجينات ذات الأهمية. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية، وخاصة استخدام الفئران خروج المغلوب المشروطة، هو مضيعة للوقت ومكلفة، وأحيانا يطرح مشاكل إضافية بشأن وجود التكرار الوراثي أو عدم وجود برامج محددة CRE، من بين أمور أخرى. واحدة من النهج التي نشأت في محاولة لمعالجة تلك المشاكل ، وهذا يستخدم في الوقت الحاضر على نطاق واسع لدراسة التنمية القشرية هو في التيار الكهربائي الرحمي3،4. في الإلكتروبور الرحمي هو تقنية تستخدم في التنظير الجسدي، مما يسمح في الجسم الحي استهداف الخلايا الجذعية العصبية وذريتها. يمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا من خلال التعبير عن البروتينات الفلورية5،6، للتلاعب الجيني في الجسم الحي (أي كسب أو فقدان مقايسات الدالة)7،8،9، لعزل الكورتيسيسات الكهربائية في المختبر وخلايا الاستزراع8،10. وعلاوة على ذلك، يسمح الإكتروليت في الرحم بالسيطرة الزمنية والإقليمية على المنطقة المستهدفة. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات، وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الهجرة العصبية, تقسيم الخلايا الجذعية, اتصال الخلايا العصبية, وغيرها من المواضيع8,,9,,11,,12.
تصف المخطوطة الحالية استخدام متغير كهربائي في الرحم، يُطلق عليه مضاعفة في الإلكتروبور الرحمي، لتحليل تفاعلات الخلايا في قشرة الدماغ ذات الأصول الزمانية والمكانية المختلفة. هذه الدراسات معقدة للغاية لإكمال عند استخدام نماذج المورين لأنها تتطلب الاستخدام المشترك لعدة خطوط محورة وراثيا. وتشمل بعض تطبيقات البروتوكول الموصوفة في هذه الورقة دراسة التفاعلات الوثيقة بين الخلايا المجاورة، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا البعيدة من خلال الإسقاطات بعيدة المدى. تتطلب الطريقة إجراء اثنين مستقلين في عمليات الجراحة الكهربائية الرحمية ، مفصولة زمنيًا ومكانيًا ، على نفس الأجنة لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة ذات الاهتمام. وميزة هذا النهج هو إمكانية التلاعب وظيفة الجينات في واحد أو كلا النوعين من الخلايا العصبية باستخدام الحيوانات من النوع البرية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين هذه التجارب الوظيفية مع التعبير عن البروتينات الفلورية السيتوبلازمية أو الغشاء الموسومة لتصور مورفولوجيا الدقيقة للخلايا المستهدفة، بما في ذلك dendrites والمحارب، وتحليل الاختلافات المحتملة في التفاعلات الخلوية بالمقارنة مع السيطرة (أي الخلايا التي تحمل اسم البروتين الفلوري فقط).
ويركز البروتوكول المحدد هنا على دراسة التفاعلات الخلوية داخل القشرة الجديدة، ولكن هذه الاستراتيجية يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة التفاعلات مع المناطق الخارجة عن القشرية التي يمكن استهدافها باستخدام في الإلكتروبورات الرحمية، مثل الزبالة الفرعية أو المهاد13،,14،أو تفاعلات الخلايا في الهياكل الأخرى، مثل المخيخ15. ويستند استهداف مناطق مختلفة على اتجاه الأقطاب وعلى البطين حيث يتم حقن الحمض النووي (الجانبي، الثالث، أو الرابع). مع الاستراتيجية المذكورة هنا ، يمكننا تسمية عدد كبير من الخلايا ، وهو أمر مفيد لتقييم التغييرات العامة في الاتصال / التداخل في التجارب الوظيفية. ومع ذلك، لدراسة التغيرات الدقيقة في الاتصال، يمكن للمرء استخدام الإصدارات المعدلة من في الكهربائي الرحم للحصول على وضع العلامات sparser وتحديد خلايا واحدة16. وباختصار، فإن ضعف القدرة الكهربائية الرحمية هو طريقة متعددة الاستخدامات تسمح باستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً ودراسة تفاعلاتها بالتفصيل، إما في ظروف التحكم أو في ظروف مقترنة بتجارب وظيفية، مما يقلل إلى حد كبير من التكاليف الزمنية والاقتصادية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت على الإجراء الوارد في هذه الوثيقة من قبل اللجنة الأخلاقية المسؤولة عن التجارب، والرفاهية الحيوانية في جامعة فالنسيا و Conselleria de Agricultura، Desarrollo Rural, Emergencia Climática y Transición Ecológica من Comunidad فالنسيانا، وتلتزم المبادئ التوجيهية للمجلس الدولي لعلوم الحيوان المختبرات (ICLAS) استعرضت في 53/2013 ريال Decreto من التشريعات الإسبانية وكذلك في التوجيه 2010/63/EU من البرلمان الأوروبي والمجلس.
ملاحظة: ينطوي هذا البروتوكول على غرضين مختلفين: 1) الدراسة الأولى، ويشار إليها باسم "الاستراتيجية A"، تسمح بتحليل التفاعلات بين خلايا Cajal-Retzius (خلايا CR) والخلايا العصبية الإسقاط القشرية في وقت مبكر من الولادة داخل نصف الكرة الأرضية نفس الدماغ. 2) يتم تنفيذ الدراسة الثانية ، "استراتيجية ب" ، من أجل دراسة إينتيشن الطبقة العليا من الخلايا العصبية الإسقاط الكالوسال إلى الجانب الآخر من القشرة الجديدة.
1. إعداد ما قبل الجراحة
- إعداد الحمض النووي
- تحويل كيميائيا أو الكهربائية المنافسة E. كولاي DH5α الخلايا مع plasmids من الفائدة، لوحة لهم على لوحات LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: جميع plasmids المستخدمة هنا تحتوي على المروج العام للدجاج β-actin (CAG) يقود التعبير عن بروتين مراسل الفلورسنت (CAG-mCherry وCAG-EGFP للاستراتيجية A وCAG-BFP وCAG-nEGFP-2A-mtdTomato للاستراتيجية B). تحتوي جميعها على مقاومة الأمبيسيلين (AMP). - اختيار المستعمرات الفردية من كل التحول البلازميد وبدء ثقافة سائلة بداية في 2 مل من مرق لوريا + أمبيسيلين (LB + AMP) في أنابيب الثقافة البكتيرية خلال 3−4 ح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي (200 دورة في الدقيقة). بعد, تعيين أكبر ثقافة بكتيرية في قارورة 500 مل Erlenmeyer إضافة 200 مل من LB + AMP و 1 مل من ثقافة بداية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية في 200 دورة في الدقيقة.
- استخدام مجموعة ماكسي الإعدادية خالية من الانسهاي(جدول المواد)اتباع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على الحمض النووي البلازميد النقي والمركز من الثقافات السائلة. إعادة تعليق الحمض النووي في ~ 50-100 ميكرولتر من حمض تريس EDTA (TE) خالية من الانسثة (TE) للحصول على تركيزات لا تقل عن 5 ميكروغرام/ميكرولتر.
- لكل عملية جراحية، وإعداد حل مع حجم النهائي من 10 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر من صبغة خضراء سريعة، حل الحمض النووي plasmid من الفائدة لتركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر لكل plasmid، و endotoxin خالية من TE العازلة. على سبيل المثال، مزيج 1 ميكرولتر من صبغة خضراء سريعة، 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام/ميكرولتر حل الحمض النووي plasmid، و 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
- تحويل كيميائيا أو الكهربائية المنافسة E. كولاي DH5α الخلايا مع plasmids من الفائدة، لوحة لهم على لوحات LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- الماصات سحب
- سحب البورسليكات الشعرية الزجاجية (1/0.58 مم الخارجي / القطر الداخلي) في بكرة ميكروبليت عمودي حتى يصل طول طرف 1-1.5 سم وتقليم باستخدام ملقط تشريح في زاوية 30 درجة تقريبا تحت نطاق تشريح.
- إعداد غرفة الجراحة
- وضع جميع المعدات على طاولة التشغيل (أي، ملاقط، مقص، ملقط، micropipettes، إبرة، وحامل إبرة). بدوره على وسادة التدفئة وتغطية مع وسادة ماصة الجراحية العقيمة. تأكد من أن الخزان في الجهاز لتخدير استنشاق مليء isoflurane، خزان الأكسجين يحتوي على ما يكفي من الأوكسجين، ويعمل النظام بشكل صحيح.
ملاحظة: يجب أن تبقى غرفة الجراحة والمواد المقاومة معقمة قدر الإمكان (أي يجب أن تكون جميع المواد ذاتية الخضوع قبل الجراحة ويجب تطهير الأسطح مع الإيثانول بنسبة 70٪). يجب تطهير الأقطاب الكهربائية البلاتينية بعناية أولاً بالصابون المسبب للجراثيم والثانية مع الإيثانول بنسبة 70٪ قبل الجراحة. - إعداد 100 مل من 0.9٪ (ث / الخامس) محلول ملحي معقمة تحتوي على البنسلين ستريبتوميسين 1:100 وملء طبق بيتري 10 سم. ضع اللوحة على قمة لوحة ساخنة لتسخين الحل.
- ملء حقنة 1 مل مع 150 ميكرولتر من محلول مسكن (على سبيل المثال، 0.1 ملغم / كجم البوبرينورفين).
- قم بتحميل الماصات المسحوبة بـ 5 ميكرولتر من محلول DNA plasmid النهائي الذي تم إعداده في الخطوة 1.1.4. قم بتوصيل الشعيرات الدموية بأنبوب اسبيرات يتم التحكم فيه بالفم.
- وضع جميع المعدات على طاولة التشغيل (أي، ملاقط، مقص، ملقط، micropipettes، إبرة، وحامل إبرة). بدوره على وسادة التدفئة وتغطية مع وسادة ماصة الجراحية العقيمة. تأكد من أن الخزان في الجهاز لتخدير استنشاق مليء isoflurane، خزان الأكسجين يحتوي على ما يكفي من الأوكسجين، ويعمل النظام بشكل صحيح.
2. الأولى في جراحة كهربائي الرحم
- وضع E11.5 (الاستراتيجية أ) أو E13.5 (استراتيجية B) C57BL/ 6 الماوس الحوامل داخل غرفة التعريفي مغلقة مع 2.5٪ (الخامس / الخامس) isoflurane في 0.8 لتر / دقيقة والانتظار حتى يتم تخديره. نقل الماوس إلى وسادة التدفئة ووضع أنفه في قناع للتسليم المستمر من ايزوفلوران. تحقق من عدم وجود رد فعل دواسة كمؤشر للتخدير السليم.
ملاحظة:يتم تحديد عمر المبيرونيك E بناءً على اليوم الذي يتم فيه ملاحظة المكونات المهبلية (E0.5). - حقن الأنثى الحامل مع المحلل مسكن (0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين) تحت الجلد. لمنع العينين من الجفاف أثناء الإجراء، ضعي قطرة واحدة من مرهم العين في كل عين باستخدام مسحة قطنية.
- حلق منطقة البطن الماوس مع شفرة حلاقة كهربائية وغسلها 2x مع 70٪ (الخامس / الخامس) مناديل الإيثانول، مرة واحدة مع مناديل اليود، ومرة أخيرة مع مسح الإيثانول.
- استخدم المقص لعمل شق بطول 30 مم من خلال الجلد في الجانب الأيمن من الحيوان وفصل الجلد المجاور بعناية عن العضلات مع ملعقة حادة. بعد ذلك، قم بعمل شقّ ثانٍ في جدار البطن.
- غطي البطن بقطعة من ورق الأنسجة المطوية التي تم تطهيرها سابقًا مع الإيثانول بنسبة 70٪ تحتوي على فتحة طولها 40 مم في مركزها. سحب بعناية الرحم من تجويف البطن مع ملقط حلقة.
ملاحظة: يجب أن يبقى الرحم رطبًا بالمحلول الملحي الدافئ المعد في الخطوة 1.3.2 أثناء الإجراء بأكمله. - تحميل مسبقة الماصات المسحوبة مع حل الحمض النووي المعدة في الخطوة 1.1.4. تحقن ~ 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي لكل جنين في البطين الجانبي لنصف الكرة الغربي المحدد باستخدام أنبوب التعرق الذي يتم التحكم فيه بالفم حتى تصبح الصبغة الخضراء السريعة ملحوظة داخل البطين.
- ضع أقطاب بلاتينية من نوع الكتب بشكلٍ ثنائِي حول رأس الجنين المحقون (كما هو موضح في الشكل 1A والشكل 2A). توجيه الأقطاب لاستهداف منطقة الدماغ المطلوب. توجيه القطب الموجب نحو الجدار الوسيط لكهرباء الهزيم القشري (الاستراتيجية A) أو نحو القشرة الجانبي (الاستراتيجية ب) لتسمية الخلايا المتولدة في هذا المجال.
ملاحظة: في جميع الحالات، يجب تجنب القلب والمشيمة لضمان البقاء على قيد الحياة الجنينية. - تطبيق التسلسل المحدد للنبضات الكهربائية مع كهربائي موجة مربعة بعد المؤشرات المبينة في الجدول 1 (الاستراتيجية A E11.5 أجنة: أربعة نبضات من 25 V و 40 مللي ثانية، مفصولة بفواصل 950 مللي ثانية؛ الاستراتيجية B E13.5 أجنة: خمس نبضات من 35 V و 60 مللي ثانية، مع فواصل زمنية 950 مللي ثانية).
- ضع الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن مع ملقط، وملء مع محلول ملحي دافئ، وإغلاق جدار البطن مع خياطة إبرة 6-0. الانضمام إلى جانبي الشق الأولي المحرز في الجلد إما باستخدام إبرة 6-0 خياطة أو مقاطع خياطة.
- الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة ومراقبتها حتى استعادتها من التخدير. توفير جرعة إضافية من المسكن (150 ميكرولتر) في محلول هيدروجيل وضعت في قفصها المنزل.
- بعد 24 ساعة من الجراحة ، وإدارة جرعة إضافية من المسكن (150 ميكرولتر). مواصلة الرصد اليومي عن طريق الفحص البصري للألم والضيق المحتمل. مراقبة سلوك الحيوان، واختبار ردود الفعل الطبيعية لها الطرف الخلفي، وتفقد خياطة لعلامات الضرر المحتملة بسبب لعق أو خدش الجرح.
3. الثانية في كهربائي الرحم
- بعد يومين من الجراحة الأولية، كرر الخطوات 2.1−2.3. على الرغم من أن شفاء الإناث الحوامل بعد الجراحة جيد جدا، تأكد من أنها تظهر السلوك الطبيعي وتقديم أي علامات على الألم أو الضيق قبل إجراء الجراحة الثانية (E13.5 أجنة لاستراتيجية A و E15.5 للاستراتيجية B).
- إجراء شق 30 مم طويلة من خلال الجلد كما هو الحال في الخطوة 2.4 وشق ثان في جدار البطن, هذه المرة في الجانب الأيسر من الحيوان. كشف بعناية الرحم على رأس الأنسجة المطهرة كما هو موضح في الخطوة 2.5.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم التدخل في شق التي أجريت سابقا في الجانب الآخر. - حقن حوالي 0.5 ميكرولتر لكل جنين من محلول الحمض النووي في بطين الدماغ الجانبي لنصف الكرة الأرضية الذي تم تحويله إلى كهرباء في حالة الاستراتيجية A وفي بطين الدماغ الجانبي لنصف الكرة الأرضية المقابل للاستراتيجية B.
ملاحظة: استخدم الأجنة التي تظهر التطور الطبيعي فقط ولا تظهر علامات على إعادة الامتصاص. - ضع الأقطاب الكهربائية حول رأس الجنين كما هو موضح في الخطوة 2.7، توجيه القطب الموجب نحو القشرة الجانبية وتطبيق النبضات المناسبة بعد المؤشرات الموضحة في الجدول 1 (الاستراتيجية A E13.5 أجنة: خمس نبضات من 35 V و 60 مللي ثانية تفصل بينها 950 مللي ثانية؛ الاستراتيجية B E15.5 أجنة: خمس نبضات من 50 V و 80 مللي ثانية تفصل بينها فواصل 950 مللي ثانية).
- متابعة والانتهاء من الجراحة كما هو موضح في الخطوات 2.8−2.10.
4- حصاد الأنسجة والقطع
- الاستراتيجية ألف
- بعد أربعة أيام من الكهربة الثانية (E17.5) ، قم بإجراء خلع عنق الرحم للأنثى الحامل ووضعه في وضعية الوبين.
- باستخدام مقص، وجعل شق البطن لاستخراج قرون الرحم ومع ملقط وضعها في طبق بيتري مليئة المالحة 1x الفوسفات المخزن (PBS) وضعت على الجليد.
ملاحظة: درجة الحرارة المنخفضة تجعل تخدير الأجنة ممكناً. - باستخدام ملاقط، استخراج الأجنة من الكيس السلوي ونقلها مع ملقط إلى طبق بيتري جديد مملوءة PBS تحت نطاق تشريح. أمسك بعناية رأس الأجنة باستخدام ملقط وقم بتشريح الدماغ باستخدام الملاقط لإزالة الجلد فوق الرأس أولاً ثم الجمجمة. استخدم ملعقة لسحب العقول المكشوفة.
- جمع العقول مع ملعقة وإيداعها في لوحة 48 جيدا مليئة الحل المثبت (4٪ [ث / الخامس] paraformaldehyde [PFA] في 1X PBS). اختبار على الفور للنتائج الناجحة لكلا الكهربائيات عن طريق فحص العقول باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب، على سبيل المثال.
- ثبّت الدماغ جنينيّة بين ليلة وضحاها في 4 [ك] في شاكرة مداريّة. غسل مع 1X برنامج تلفزيوني للقضاء على آثار PFA. ثم نقلها إلى برنامج تلفزيوني مع المواد الحافظة المضادة للفطريات (1x PBS-0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم).
تنبيه: PFA وأزيد الصوديوم هي مركبات السامة للخلايا التي تتطلب احتياطات خاصة أثناء استخدامها. - تضمين العقول في التركيز 4٪ (ث / الخامس) انخفاض ذوبان نقطة agarose في 1X PBS وانتظر ~ 10 دقيقة حتى يقوي. التمسك بها إلى حامل الأنسجة هزاز باستخدام الغراء سيانواكريلات مع المصابيح الشم التي تواجه صعودا للحصول على أقسام الإكل.
- بدء الاهتزاز وتحديد المعلمات المطلوبة: 100 μm العرض، 0.60 μm / s السرعة، و 0.60 مم من السعة.
- تأمين الدماغ داخل حاوية هزاز، وملء مع 1x برنامج تلفزيوني الحل، والبدء في جمع أقسام تسلسلية الإكلال مع مساعدة من فرشاة في لوحة 48 جيدا مليئة 1x PBS-0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم أن يكون تصوير كامل للدماغ (على سبيل المثال، حوالي سبعة أقسام في البئر وستة آبار لكل جنين).
- جبل المقاطع المطلوبة في شرائح الزجاج المجهر باستخدام فرشاة غرامة. غطّيهم بأغطية زجاجية. للتخزين على المدى الطويل إضافة المتوسطة تصاعد، مما يمنع photobleaching والتأكسد الضوئي. مراقبة الشرائح تحت مجهر epifluorescence تستقيم لتقييم فعالية الكهربائي.
- الاستراتيجية باء
- السماح الجراء سابقا الكهربائية في E13.5 و E15.5 أن يولد والانتظار حتى P15 لأداء ضخ عبر القلب باستخدام نفس الحل المثبت المستخدمة في الخطوة 4.1.4.
- قبل التسريب، تدار داخل الصفاق جرعة من 75/1 ملغ/كغ من الكيتامين/ميدتومويدين. عندما يتم فقدان رد الفعل دواسة، وتأمين الماوس في موقف سوبين وجعل شق البطني بعد خط الوسط باستخدام مقص لفضح كل من القفص الصدري والحجاب الحاجز.
- قطع الحجاب الحاجز وفتح القفص الصدري للوصول إلى القلب. عقد القفص الصدري باستخدام الهيموستات وجعل شق في الأذين الأيمن مع مقص غرامة.
- اختراق البطين الأيسر مع إبرة متصلة مع أنبوب مرن إلى مضخة النفخ ال peristaltic. بدء ضخ عبر القلب، وتقديم ما لا يقل عن 25 مل من 4٪ PFA في تدفق مستمر من 5.5 مل/ دقيقة (الوقت الإجمالي ~ 5 دقيقة).
- تشريح دماغ الحيوانات المُقَدّمة. أولاً، إزالة الجلد فوق الرأس مع مقص والملقط. بدء قطع الجمجمة باستخدام مقص وسحب بعناية قبالة أجزاء من عظام الجمجمة حتى يتم إزالتها تماما. وأخيراً، استخرج الدماغ بمساعدة ملعقة.
- نقل العقول إلى لوحة 24 جيدا وإصلاحها مع 4٪ PFA بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر المدارية. وقف التثبيت عن طريق استبدال PFA مع 0.05٪ (ث / الخامس) أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: كما هو مبين في الخطوة 4.1.5، فإنه من المستحسن تنفيذ غسل وسيطة مع 1X PBS. - كرر الخطوات 4.1.6−4.1.9، وتغيير معلمات الاهتزاز لأدمغة ما بعد الولادة (عرض 40 ميكرومتر، وسرعة 1.20 ميكرومتر/س، و0.5 مم من السعة).
ملاحظة: يمكن إجراء الكيمياء المناعية أو الفلوروسين المناعية للكشف عن علامات خلايا محددة أو تعزيز إشارة البروتينات الفلورية المستخدمة في الكهربة.
5- التصوير والتحليل الفلوري النافوكال
- قم بتشغيل المجهر confocal، ضع شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام الدماغ المثبتة على حامل شرائح المجهر وحدد القنوات التي سيتم التقاط صور الفلوريسنس (أي 420-460 نانومتر لBFP، 490−540 نانومتر لـ GFP، و570−620 نانومتر لـ MCherry و tdTomato).
- قم بإجراء مسح عينة للحصول على صور خريطة لكل قسم في الدماغ في أطوال موجية مختلفة للحصول على عرض عام لإخراج الإلكتروبور المزدوج. بمجرد الانتهاء، حدد عدسة 10x ووضع المراقبة متعددة المناطق-Z-المكدس-timelapse. وهذا سيسمح برمجة اقتناء التلقائي للصور الفلورية في تعريب XYZ مختلفة داخل أقسام الدماغ.
- في كل منطقة من المناطق المختارة (XY) ، قم بتعيين معلمات التصوير المناسبة (أي كثافة الليزر ، وحساسية الMulinglier الضوئية ، والحد الأدنى للدقة 1024 × 1024) ، وكذلك عمق المسح (Z) وفقًا لـ طائرات العينة التي يكون فيها الفلوريسين مرئيًا.
- الحصول على التكبير المنخفض (10x) الصور من جميع المناطق المختارة وتصديرها من تنسيق المنظمة الدولية للIF إلى TIFF باستخدام برنامج عارض المجهر.
- تغيير إلى عدسة 60x، كرر الخطوة 5.3 والتقاط صور التكبير عالية لمراقبة التفاعلات الخلية الخلية بطريقة أكثر تفصيلا. تصديرها كما هو مبين في الخطوة 5.4.
- افتح الصور التي تم الحصول عليها مع أي برنامج تصوير (مثل فيجي) لمزيد من التحليل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نشأت التفاعلات بين الخلايا المجاورة في أماكن وفي أوقات مختلفة: خلايا Cajal-Retzius (خلايا CR) والخلايا العصبية الإسقاط القشرية المهاجرة المبكرة (الاستراتيجية أ)
وقد سبق وصف التفاعل بين الخلايا CR-cells والخلايا العصبية الإسقاط القشرية المبكرة بأنها ضرورية لتنظيم نقل سومال عبر جزيئات التصاق النكتين والكادهرين باستخدام استراتيجية مزدوجة electroporation8. تُنشأ خلايا CR من neuroepithelium على حواف اللاميوم وتهاجر بشكل عرضي لتملأ الجزء الأكثر سطحية من القشر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دراسة التفاعلات الخلية الخلية في الجسم الحي في المناطق ذات الكثافة الخلوية العالية مثل قشرة الدماغ مهمة معقدة. النهج التقليدية بما في ذلك استخدام الأجسام المضادة لتسمية نيوريت ليست مناسبة بسبب عدم وجود علامات محددة للسكان الخلايا المختلفة. استخدام نماذج مورين المعدلة وراثيا، حيث نوع معين من الخلايا يعبر عن بروتين الفلورسنت، مفيد لتصور العمليات العصبية، ولكن هذا يعتمد على توافر مثل هذه النماذج. هذه المهمة أكثر تعقيدا عند محاولة تصور الاختلافات المحتملة في التفاعلات بين نوعين من الخلايا معينة على الانزعاج من الجينات ذات ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفان كريستينا أندريس كاربونيل وأعضاء مرفق العناية بالحيوانات التابع جامعة فالنسيا على المساعدة التقنية. كما نود أن نشكر إيزابيل فارينايس وساكرامنتو ر. فيرون على الكواشف وتبادل معداتها معنا. يتم تمويل I.M.W من خلال عقد Garantía Juvenil من Conselleria de Educación de Valencia (GJIDI/2018/A/221) ، يتم تمويل D.dA.D من قبل وزير دي سيسيليا ، Innovación y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz حاصل على منحة رامون إي كاجل (RYC-2015-19058) من وزير الإسبانية دي سينسيا، Innovación y Universidades (MICINN). تم تمويل هذا العمل RYC-2015-19058 و SAF2017-82880-R (MICINN).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أمبيسلين ملح الصوديوم | سيجما ألدريتش | A9518-25G | |
| أنبوب شفاط | سيجما-ألدريتش | A5177-5EA | |
| خلاط الأطفال هيموسات (نضح) | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 13013-14 | |
| البورسليكات الشعيرات الدموية | WPI | 1B100-6 | |
| بوبرينورفين (بوبريكس 0,3 مجم / مل) | Rb المستحضرات الصيدلانية المحدودة | 921425 | |
| بلازميد CAG-BFP | يرجى توفيره من قبل U.Mü ller مختبر | ||
| CAG-EGFP البلازميد | المقدم من U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mCherry البلازميد | يرجى المقدمة من U.Mü ller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP البلازميد | يرجى المقدمة من U.Mü ller مختبر | ||
| مجهر متحد البؤر | أوليمبوس | FV10i | |
| مسحات قطنية | BFHCVDF | ||
| غراء سيانواكريليت | ب. نطاق | 1050044 | |
| براون Zeiss | stemi 305 | ||
| ملقط دومون # 5 ملقط ناعم | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 مربع Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| ماكينة حلاقة كهربائية | Oster | 76998 | |
| عازلة TE خالية من السموم | QIAGEN | مناديل الإيثانول 1018499 | |
| BFHCVDF | |||
| ملقط Graefe Extra | Fine Science Tools (FST) 11150-10 | ||
| مرهم العين | Alcon | 682542.6 | |
| صبغة خضراء سريعة | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| مقص ناعم | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 14069-09 | |
| مصابيح LED مضان | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (خياطة) | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 91308-12 | |
| وسادة | التدفئةUFESA | AL5514 | |
| مجهر epifluorescence المقلوب | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| مناديل اليود المبللة | Lorsoul | ||
| Isofluorane | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| الكيتامين (Anastemine) | Fatro Ib & eacute ؛ ريكا SL | 583889-2 | |
| مناديل كيمبرلي | كلارك الدقيقة كيمبرلي كلارك | 7252 | |
| رطل (لينوكس) أجار جين | لابكيم | AGLB-00P-500 | |
| رطل (لينوكس) مرق جين | لابكيم | LBBR-00P-500 | |
| نقطة انصهار منخفضة الاغاروز | فيشر Scientific | BP165-25 | |
| ميديتوميدين (مهدئ) | Dechra | 573749.2 | |
| أغطية المجهر | Menel-Glä ser | 15747592 | |
| المجهر شرائح | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| تصاعد | متوسطة علوم المجهر الإلكتروني | 17984-25 | |
| لوحات Mutiwell (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| لوحات Mutiwell (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| كلوريد الصوديوم (للمحلول الملحي) | فيشر 10112640 العلمي | ||
| إبرة 25 جم (BD Microlance 3) | Becton و Dickinson and Company | 300600 | |
| حاضنة مدارية S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J.P. Selecta، s.a. | 0485472 | |
| بارافورمالدهايد | PanReac Applied Chem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| مضخة التروية التمعجية | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode ، قطر 5 مم | Btx | 45-0489 | |
| نظام إغلاق الجلد المنعكس - مشابك 7 مم ، علبة 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| نظام إغلاق الجلد المنعكس - تطبيق المشبك ، 7 مم | AgnThos | 204-1000 | |
| ملقط دائري | أدوات العلوم الدقيقة (FST) | 11103-09 | |
| أزيد الصوديوم | PanReac Applied Chem | 122712-1608 | |
| وسادة ماصة جراحية (معقمة) | خياطة HK الجراحية | PD-M | |
| (Surgicryl PGA 6-0) | مواد خياطة SMI | BYD11071512 | |
| حقنة 1 مل (BD plastipak) | Becton و Dickinson and Company | 303172 | |
| طبق زراعة الأنسجة 100 × 20 مم | Falcon | 353003 | |
| مجتذب ماصة دقيقة عمودي | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| مجهر عمودي | نيكون | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
المراجع
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During Development. Journal of Experimental Neuroscience. 12, (2018).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development, Growth & Differentiation. 50, 507-511 (2008).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Müller, U. Reelin Regulates Cadherin Function via Dab1/Rap1 to Control Neuronal Migration and Lamination in the Neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gil-Sanz, C., et al. Cajal-Retzius cells instruct neuronal migration by coincidence signaling between secreted and contact-dependent guidance cues. Neuron. 79, 461-477 (2013).
- Martinez-Garay, I., et al. Cadherin 2/4 signaling via PTP1B and catenins is crucial for nucleokinesis during radial neuronal migration in the neocortex. Development. 143, 2121-2134 (2016).
- Popovitchenko, T., et al. The RNA binding protein HuR determines the differential translation of autism-associated FoxP subfamily members in the developing neocortex. Scientific Reports. 6, (2016).
- Bultje, R. S., et al. Mammalian Par3 Regulates Progenitor Cell Asymmetric Division via Notch Signaling in the Developing Neocortex. Neuron. 63, 189-202 (2009).
- Rodríguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89, 494-506 (2016).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, 151-158 (2005).
- Mire, E., et al. Spontaneous activity regulates Robo1 transcription to mediate a switch in thalamocortical axon growth. Nature Neuroscience. 15, 1134-1143 (2012).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental Biology. 322, 345-354 (2008).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero electroporation approaches to study the excitability of neuronal subpopulations and single-cell connectivity. Journal of Visualized Experiments. 120, e55139(2017).
- Bielle, F., et al. Multiple origins of Cajal-Retzius cells at the borders of the developing pallium. Nature Neuroscience. 8, 1002-1012 (2005).
- Meyer, G., Perez-Garcia, C. G., Abraham, H., Caput, D. Expression of p73 and Reelin in the Developing Human Cortex. Journal of Neuroscience. 22, 4973-4986 (2002).
- Takiguchi-Hayashi, K., et al. Generation of Reelin-Positive Marginal Zone Cells from the Caudomedial Wall of Telencephalic Vesicles. Journal of Neuroscience. 24, 2286-2295 (2004).
- Berry, M., Rogers, A. W. The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex. Journal of Anatomy. 99, 691-709 (1965).
- Alcántara, S., et al. Regional and cellular patterns of reelin mRNA expression in the forebrain of the developing and adult mouse. Journal of Neuroscience. 18, 7779-7799 (1998).
- Yoshida, M., Assimacopoulos, S., Jones, K. R., Grove, E. A. Massive loss of Cajal-Retzius cells does not disrupt neocortical layer order. Development. 133, 537-545 (2006).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O. L., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nature Neuroscience. 4, 143-150 (2001).
- Fame, R. M., MacDonald, J. L., Macklis, J. D. Development, specification, and diversity of callosal projection neurons. Trends in Neurosciences. 34, 41-50 (2011).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Interlaminar Connections in the Neocortex. Cerebral Cortex. 13, 5-14 (2003).
- Zarrinpar, A., Callaway, E. M. Local connections to specific types of layer 6 neurons in the rat visual cortex. Journal of Neurophysiology. 95, 1751-1761 (2006).
- Chovsepian, A., Empl, L., Correa, D., Bareyre, F. M. Heterotopic Transcallosal Projections Are Present throughout the Mouse Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 36(2017).
- DeFelipe, J. The evolution of the brain, the human nature of cortical circuits, and intellectual creativity. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 29(2011).
- Velmeshev, D., et al. Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 364, 685-689 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
